Os autores agradecer o pessoal do Hospital Universitário animal instalação (UTE) de Nantes para pecuária e cuidados, o celular e tecidual de imagem facilidade do núcleo da Universidade de Nantes (MicroPICell) para a imagem latente e a facilidade de citometria (Cytocell) de Nantes para sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO inter-regional 2017) e o consórcio europeu ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). A equipe é financiada pelo Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO e os programas IHU-Cesti, suportado pelo nacional investigação Agência Investissements d'Avenir através dos programas ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, respectivamente. O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Metropole e a região de Pays de la Loire. Os autores agradecer Chirine Rafia para fornecer ajuda em corrigir o manuscrito.

As procedimento envolvendo animais disciplinas foi realizada segundo as orientações institucionais (acordo #00186.02; Comitê de ética regional de Pays de la Loire [França]). Humano PBMC foram isolada a partir do sangue coletado de doadores saudáveis informados (Etablissement Français du Sang Nantes, França). Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.
1. não-específica expansão de linfócitos citotóxicos Effector T
<ol><li>Preparar e irradiar as células alimentador em 35 Gy. Para a estimulação de 2 x 105 - células efetoras de 4 x 105 , prepare-se 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs de três doadores distintos, saudáveis.</li>
	<li>Resuspenda tanto células alimentador e células efetoras em 15 mL de RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor FCS, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (0,1 µ g/mL) e recombinantes IL-2 300 UI/mL.</li>
	<li>Adicionar PHA-L em uma concentração final de 1 µ g/mL, misture cuidadosamente e distribuir 150 µ l de suspensão de célula por bem em placas de 96 poços de fundo U.</li>
	<li>Incube a 37 ° C e com 5% CO2 em um ambiente umidificado.</li>
	<li>Verificar diariamente a placa até grandes células agrupa formulário dos poços de cultura (~ dia 7).</li>
	<li>Transferi as células em um frasco de cultura a 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.</li>
	<li>Determinar o número total de células por contagem (2x por semana) e mantê-las em 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco. Nota: As células imunes efetoras devem estar prontas para a administração de terapêutica em um estado de repouso (geralmente 3 semanas após o estímulo inicial de amplificação). A pureza e a reatividade destas células efetoras devem ser verificados antes na vivo injeções (por exemplo, com ensaios em vitro ).</li>
</ol>2. preparação de células efetoras pré-operatório
<ol><li>Depois de verificar a contagem de células efetoras, colete as células efetoras em um tubo de 50 mL por centrifugação (300 x g por 5 min). Nota: Para compensar qualquer perda, prepare um excesso de células (por exemplo, 50 x 106).</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 15 mL de PBS estéril e centrifugar durante 5 min à 300 x g para executar a lavagem.</li>
	<li>Cuidadosa e completamente remover o sobrenadante e em seguida Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Transferi as células ressuspensa em um microtubo de 1,5 mL por centrifugação a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Cuidadosa e completamente remova o sobrenadante pipetando lentamente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 8 µ l de PBS estéril por rato. Nota: Este é um passo crítico.</li>
	<li>Medir o volume da suspensão celular usando uma micropipeta. Se necessário, adicionar PBS estéril (20 x 106 células em 15 µ l de PBS por dose) e misturar cuidadosamente.</li>
	<li>Verificar, por meio de uma micropipeta, que o volume final por rato é entre 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).</li>
	<li>Manter as células no gelo até injeção estereotáxica. Nota: mais de 3-h momentos não foram testados.</li>
</ol>3. estereotáxica injeção
<ol><li>
Instalação de equipamento
	<ol>
<li>Montar e calibrar um pequeno quadro estereotáxico animal de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção). Nota: A taxa de infusão lenta é recomendada (ou seja, 2-3 µ l/min).</li>
		<li>Instale o material em um armário de segurança microbiana (MSC) para manter a esterilidade dos instrumentos e para proteger os ratos de infecções. Nota: lugar "blocos isotérmicos" em um banho-maria a 37 ° C. Este sistema limita a hipotermia de ratos durante a cirurgia. Radiante, que são necessárias para o cuidado pós-processual, deve ser usado durante a monitorização contínua da temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de animais pré-operatório
	<ol>
<li>Anestesia um rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) em 10 µ l/g de peso do corpo do mouse.</li>
		<li>Execute um teste do beliscão do dedo do pé para garantir a completa anestesia e analgesia do animal. Nota: Qualquer movimento é uma indicação de analgesia não de profundidade e, se isso ocorrer, mais alguns minutos são necessários antes de repetir a operação.</li>
		<li>Uma vez que o mouse é devidamente anestesiado, use a tesoura para remover a pele do local cirúrgico (entre as duas orelhas, até o nariz).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da pilha pré-operatória
	<ol>
<li>Cuidadosamente, Ressuspender as células com uma pipeta (várias vezes) antes de cada injecção para impedir que qualquer célula aglutinação.</li>
		<li>Desenhe cuidadosamente o volume de suspensão de células necessárias (15-20 µ l) para o microseringa 22-G para evitar a aspiração de bolhas. Nota: Este passo de carregamento de celular para o microseringa é importante para minimizar as variações no volume injetado. Recarrega pilhas para cada injeção individual entre procedimentos para impedir que qualquer célula aglutinação e garantir um número par de administração de células efetoras na coorte.</li>
		<li>Em seguida, coloque a seringa para a bomba de seringa adaptada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados processuais
	<ol>
<li>Desinfectar o local cirúrgico com cotonetes embebidos em solução de iodo-povidona 5% pelo menos 3 x.</li>
		<li>Coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato, para evitar qualquer secagem de córneas.</li>
		<li>Posição do mouse anestesiado na armação estereotáxica, num bloco isotérmico quente coberto com um filme plástico estéril para manter a temperatura do rato durante a cirurgia e limitar a taxa de mortalidade. Nota: Do mouse nariz e dentes devem ser adequadamente posicionados acima da barra de dente, para assegurar o fluxo respiratório adequado durante o procedimento.</li>
		<li>Uma vez que o mouse está posicionado acima da barra de dente, aperte as barras de orelha firmemente sob as orelhas do rato para imobilizar a cabeça. Nota: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos ou comprometer a respiração.</li>
		<li>Fazer uma incisão de 1-2 cm da pele sagital com tesoura estéril, ao longo da parte superior do crânio de anterior posterior para expor o crânio.</li>
		<li>Identifica a interseção das suturas coronais e sagitais (Bregma) para servir como pontos de referência para localização estereotáxica antes da injeção (mostrada na Figura 1).</li>
		<li>Lugar da micro-seringa acima deste ponto.</li>
		<li>Mova a micro-seringa lateral direita 2 mm e 0,5 mm anterior do Bregma.</li>
		<li>Usando um microdrill, faça um pequeno furo no crânio com uma broca estéril coordenadas pré-determinadas. Tenha cuidado para permanecer superficial para evitar qualquer lesão traumática do cérebro. Nota: No presente protocolo, as células imunes foram injetadas dentro um tumor estabelecido (uma semana após a injeção de células de tumor). A pele deve ser reaberto (scar) e a injeção é executada com as mesmas coordenadas usadas para a implantação de células de tumor (o furo geralmente ainda está presente acima de 2 semanas após a injeção). As coordenadas foram selecionadas para injetar células de tumor e efetoras no parênquima cerebral13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injeção de células imunes efetoras
	<ol>
<li>Cuidadosamente Introduza a micro-seringa o orifício perfurado e, movendo-se lentamente, encaminhar a agulha 3 mm para baixo na dura-máter e então para trás 0.5 mm até uma profundidade final de 2,5 mm antes de injetar as células efetoras.</li>
		<li>Executar a injeção de células efetoras em 2-3 µ l/min e monitorar os ratos ao longo do tempo de injeção.</li>
		<li>Uma vez concluída a injeção, retirar a agulha para apenas 1 mm e manter a micro-seringa no lugar por um minuto adicional antes lentamente retirando completamente o microseringa, para evitar qualquer vazamento do local da infusão. Nota: Após a remoção do animal do dispositivo estereotáxico, limpe imediatamente o equipamento de injeção para experiências futuras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados pós-operatórios e follow-up de rato
	<ol>
<li>Retire o animal do quadro estereotáxico e imediatamente aplicar solução de 5% de iodo-povidona no local da incisão e fechar a pele com uma sutura cirúrgica adequada.</li>
		<li>Aplicar o gel de lidocaína 2% diretamente sobre a ferida e administrar 0,15 µ g/g de buprenorfina por injeção subcutânea para analgesia pós-processual.</li>
		<li>Lugar de volta o mouse anestesiado para sua jaula sobre uma almofada de aquecimento definida a 37 ° C para manter uma temperatura de corpo do mouse apropriado e evitar qualquer hipotermia. Nota: Alojamento separado não é necessário.</li>
		<li>Monitorar o mouse até que ele está totalmente recuperado da anestesia e transferi-lo para um quarto de habitação. Nota: Até à data, este protocolo é bem suportado como poucas complicações imprevistas ocorreram (< 5% dos ratos injetados).</li>
		<li>Diariamente, monitorar os ratos e sacrificá-los quando qualquer declínio saúde são observados sinais (por exemplo, postura encurvada, mobilidade reduzida, prostração ou perda de peso significativa corpo [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma transferência adotiva de selecionado nativo ou células efetoras imune engenharia representa uma abordagem promissora para tratar eficientemente a tumores, como câncer de cérebro infiltrativa, tendo o cuidado de limitar reatividades contra células não-transformadas15, 16,17,18. No entanto, o sistema nervoso central, que compreende o cérebro, tem um determinado status imune, nomeadamente devido a existência da barreira hemato - encefálica e a falta de um sistema de drenagem linfática clássica19,20. Estas características fisiológicas afetam tráfico de tecido e podem comprometer sistêmicas injeções de células do sistema imunológico. Para superar estes obstáculos, injeções difuso tem sido exploradas no princípio de que células antitumorais bastante localmente são entregues, estreitamente para o local do tumor, quanto microesferas que contêm compostos farmacológicos21, 22. por um lado, a diluição limitada de linfócitos dentro o órgão pode melhorar sua eficácia antitumoral, mas ele também pode amplificar mecânica ou tumor adaptação efeitos deletérios, como a compressão tecidual, que se desenvolve ao longo do cérebro crescimento do tumor. Isto implica que este procedimento exige volumes pequenos de injeções de imunoterapia. Esta questão é ainda mais crítico em modelos experimentais animais no qual cérebro tumores não podem ser extirpados cirurgicamente. Este artigo descreve uma abordagem terapêutica para a preparação e a entrega local de efetores celulares tumor-específicas cérebro, baseado em injection(s) estereotáxica de alogênico linfócitos T humanos.
Este estudo mostra a preparação e a entrega estereotáxica de alogênico linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos em ratos NSG imunodeficientes carregando humanas xenografts GBM. A primeira fase do presente protocolo descreve um procedimento simples para amplificar alogênico linfócitos T de PBMC de doadores saudáveis, usando uma padrão estimulação de PHA-alimentadores-IL2 inespecífica que produz grandes quantidades de linfócitos efetores pura T, permitindo sua utilização terapêutica23,24. A segunda fase deste artigo incide sobre a preparação de suspensões de linfócitos T de repouso no dia da administração estereotáxica. Um foco particular foi colocado nesta etapa importante que requer uma alta densidade celular não deve afetar a viabilidade e a função dos linfócitos effector selecionada T. Finalmente, sobre experiências na vivo , a preparação de linfócitos efetores T e sua injeção dentro do núcleo do tumor está associada a sua divulgação, não só dentro do tumor, mas também nos tecidos cerebrais circundantes, destacando suas habilidade especial para patrulhar e controlar as células do tumor invasivo. Importante, estes métodos de preparação e injeção mantêm a capacidade destes linfócitos T para ser ativado dentro do cérebro em cima de um reconhecimento específico de células de tumor cerebral. No total, estas características atraentes assegurar a capacidade de linfócitos T para especificamente e eficientemente alvo e eliminam as células do tumor cerebral profunda infiltrativa que são uma marca registrada da GBM25. Digno de nota, um cuidado especial tem que ser tomado durante a injeção e a remoção do microseringa para minimizar qualquer lesão cerebral ou vazamentos de células efetoras.
Em conclusão, este artigo descreve um procedimento eficiente para fornecer grandes quantidades de alogênico linfócitos humanos anti-tumoral, tais como repouso linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T, nas proximidades de tumores cerebrais. Importante, este procedimento terapêutico não é acompanhado com efeitos adversos sobre os linfócitos T transferidos (por exemplo, viabilidade, reatividade) ou sobre os tecidos do cérebro. Estudos recentes, baseados em modelos de murino ortotópico de GBM humana primária, têm demonstrado que os linfócitos Vϒ9Vδ2T alvo eficientemente células GBM, incluindo células de tumor que infiltraram-se profundamente o cérebro parênquima9,11. Estes elementos abrir oportunidades para o desenvolvimento do romance adotiva T linfócitos transferência procedimentos que pode ser aplicado em primeira instância em camundongos carregando ortotópico os tumores cerebrais e, em seguida, em estudos clínicos em pacientes GBM.

GBM (quem grau astrocitoma IV), é o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar de tratamentos agressivos que combinam radio-quimioterapia e cirurgia, GBM continua associada com um prognóstico extremamente pobre (sobrevida média de 14,6 meses e um ano-2-mortalidade > 73%)1. Isto evidencia que alguns avanços terapêuticos eficientes foram validados ao longo da última década2. Entre os candidatos para a concepção de estratégias terapêuticas mais eficazes3,4,5, imunoterapias6 são atualmente exploradas para controlar e eliminar altamente invasivo e rádio/quimioterapia-resistente do tumor células, suspeitadas por sua contribuição fundamental para a rápida e fatal tumor recaída7. Vários alvos imunológicos foram identificadas e propostas para imunoterapias, envolvendo natural ou αβ modificado ou linfócitos T de ϒδ como antígenos do tumor GBM específicos ou estresse induzido por moléculas8,9, 10. A possibilidade de administrar efetores de células imunes GBM-reativos selecionados representa uma oportunidade única para entregar quantidades elevadas de linfócitos efetores diretamente no site da malignidade residual. Para oferecer suporte a esta estratégia, nós recentemente demonstraram que modelos baseados em camundongos imunodeficientes carregando ortotópico primários xenografts humanos de GBM fielmente recapitular o desenvolvimento de tumores cerebrais em GBM pacientes9,11. Além disso, estes modelos foram usados para demonstrar a eficiência forte antitumoral de enviaram transferidos linfócitos humanos alogênico de Vϒ9Vδ2T.
Este protocolo descreve as etapas experimentais críticas para alcançar imunoterapias estereotáxica de tumores cerebrais, tais como GBM, com base na transferência adotiva de alogênico linfócitos T. O artigo mostra: (i) a amplificação de linfócitos terapêuticos alogénicos imunes efetoras T, tais como linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T; (ii) a preparação destes linfócitos efetores T para injeção; (iii) o processo de administração estereotáxica dentro do cérebro, perto do tumor. Este artigo também fornece insights sobre o comportamento desses efetores celulares após a injeção estereotáxica.
A abordagem terapêutica aqui apresentada baseia-se a injeção de 20 x 106 efetoras células por dose para cada mouse imunodeficientes rolamento-tumor de cérebro. Uma etapa de expansão inicial em vitro é necessária para produzir grandes quantidades de células do sistema imunológico. Portanto, expansões de célula não-específicas são executadas usando a Fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiados células alogénicas alimentador: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis e célula B-lymphoblastoid Epstein Barr vírus EBV-transformado linhas (BLCLs), derivado de PBMC por infecção em vitro com cultura EBV-contendo sobrenadante da linha celular sagui B95-8, na presença de 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Células imunes efetoras GBM-reativa são comparadas e selecionadas a partir de vitro ensaios9. Estas células efetoras são ativadas e amplificado usando protocolos padrão, de acordo com sua natureza (por exemplo, de linfócitos humanos Vγ9Vδ2 T9 ou humano anti-herpes vírus αβ T linfócitos12) com uma pureza mínima de > 80%, como rotineiramente verificada pela análise cytometric. O procedimento de expansão celular detalhado abaixo aplica-se a vários subconjuntos de linfócitos humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBMCs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:232px;">from 3 different healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BLCLs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>from 3 different donors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">FCS</td>
			<td style="width:136px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IL-2</td>
			<td style="width:136px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">proleukin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PHA-L</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mouse adaptator for stereotaxic frame&#160;&#160;</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microsyringe pump injector&#160;</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoFil Syringe</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">NF34BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">NSG mice</td>
			<td style="width:136px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">NSGSSFE07S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ketamine</td>
			<td style="width:136px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;">Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylazine</td>
			<td style="width:136px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;">Rompur 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Scissors</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">201758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Forceps</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OmniDrill 115/230V</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td align="right">503598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Vicryl 4-0</td>
			<td style="width:136px;">Ethicon</td>
			<td>VCP397H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylocaine</td>
			<td style="width:136px;">Astrazeneca</td>
			<td>3634461</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos, é geralmente associada com um prognóstico pobre e escassas eficientes terapias têm sido propostas ao longo da última década. Entre os candidatos promissores para a concepção de novas estratégias terapêuticas, imunoterapias celulares têm sido alvo para eliminar altamente invasivo e células tumorais de quimio-radioresistant, provavelmente envolveram em uma recaída rápida e fatal de câncer. Assim, organismos de alogênico GBM-reativa efetores célula imune, como linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos, nas proximidades do tumor que representa uma oportunidade única para entregar eficiente e altamente concentrado agentes terapêuticos diretamente para o site de malignidades do cérebro. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito pré-clínicos para a viabilidade e a eficácia antitumoral destes imunoterapias celulares que dependem de injeções estereotáxica de linfócitos humanos alogênico dentro camas de tumor intrabrain.

Este estudo descreve a estratégia de transferência adotiva de células efetoras imune celular dentro do cérebro de camundongos portadores de tumor, baseado em injeções estereotáxica realizadas diretamente dentro da cama do tumor.
Para minimizar qualquer risco de lesão cerebral associada com um volume grande de injeção, a suspensão de células efetoras precisa ser concentrado (20 x 106 células em 15-20 µ l de PBS). Para verificar se essa etapa de concentração celular pode afetar a viabilidade das células efetoras, estas células foram preparadas de acordo com o protocolo descrito e carregadas para o microseringa. As células efetoras foram recolhidas imediatamente, ou 10 min depois de carregá-los para o microseringa. As células foram coradas com iodeto de propidium (PI), um agente intercalante fluorescente de DNA que não é permeant de células vivas e analisadas por citometria de fluxo em momentos diferentes (0, 24 e 72 horas). Os resultados mostram que a preparação e o carregamento para o microseringa não afetar significativamente a viabilidade de células efetoras pelo menos 24 horas (Figura 2A e 2B). Em 72 horas, observou-se um aumento ligeiro, mas não significativas, de célulaspositivas de PI (14% contra 11% para pilhas descarregadas). De forma semelhante, foi analisada a reatividade antitumoral de células efetoras que foram preparados e mantido no gelo por 3 horas. Células efetoras foram cocultured com as células do tumor de cérebro por 4 horas na presença de um mAb anti-CD107a. O upregulation do marcador de ativação CD107a, similar ao valor obtido em condições de controle, indica que a reatividade de células efetoras não é afectada pela preparação e o carregamento para o microseringa (Figura 2).
Para avaliar se as células efetoras sobrevivem e mover-se dentro do parênquima cerebral após sua implantação intra-tumoral, 20 x 106 efetoras células foram injetadas o site tumor de ratos com tumor cerebral (GBM-111). Uma semana depois, os cérebros foram coletados, fixo, seccionado e coradas por coloração de hematoxilina e eosina safran (HES) e anti-humano CD3 mAb (IHC). Coloração de HES identificou a estrutura dos tumores cerebrais (Figura 3, painel esquerdo). A coloração de CD3 identificadas e localizadas de linfócitos T efetores imunes (aqui, células humanas Vϒ9Vδ2 T) (Figura 3, painel direito). Curiosamente, os linfócitos T do effector foram detectados em torno do tumor (Figura 3, painel superior direito), no núcleo do tumor (Figura 3, meio painel direito), mas também no hemisfério contralateral (Figura 3, painel direito inferior). Além disso, a função dos linfócitos T humanos isolados do cérebro do rato 48 horas após a sua injeção (4 x 106 células de T de αβ), que representam 2% das células do cérebro, foi analisada. Os resultados indicam que coletados cérebro-injetado effector alogênico αβ T células expandir e proliferam em cima de uma ativação de células de PHA-alimentador específico realizada na presença de IL-2 (Figura 4).
Juntos, esses resultados mostram que células efetoras T preparadas e administradas sob estes procedimentos sobrevivem durante horas no cérebro e podem patrulhar dentro do tumor e os tecidos cerebrais saudáveis. Esses procedimentos têm sido utilizados para avaliar a eficiência antitumoral das administrações estereotáxica terapêuticas alogénicas humanas descanso Vϒ9Vδ2 de pilhas de T, para controlar o desenvolvimento humano GBM cérebro tumores9,11. Estas evidências de estudos que injeções de linfócitos alogênico effector humana T na cama tumor melhorar significativamente a sobrevivência de ratos com tumores cerebrais. Curiosamente, sobreviver os ratos não carregava pilhas do tumor detectável, indicando, assim, uma rejeição completa do tumor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig1.jpg"> Figura 1 : Imagens dos principais marcos anatômicas no crânio do mouse. Isso inclui sagital (linha vermelha) e a sutura coronal (linha azul) e a sua interseção (Bregma) usado para orientar o local da injeção. Barra de escala é indicada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig2.jpg"> Figura 2 : Sobrevivência e ativação de preparados linfócitos efetores T. Células efetoras (aqui, descansando de células humanas de Vϒ9Vδ2 T periféricas) foram amplificadas e preparados de acordo com o procedimento descrito. Coloração de linfócitos com iodeto de propidium (PI), foram realizados um DNA intercalante composto fluorescente que não permeant viver as células e ativação funcional. (A), este painel mostra uma parcela representativa de frente (FSC-H) contra lateral (SSC-H) scatter gating de linfócitos efetores (deixou o painel). O histograma mostra a coloração de PI de linfócitos de controle fechado (painel direito). É indicada a percentagem de linfócitospositivos de PI. (B), este painel mostra o percentual de linfócitos mortos (PIpositivo) recolhido imediatamente (linha azul clara) ou após 10 min (linha azul escura) na microsseringa, medido em momentos os indicado. Como controle, foram usadas células preparadas descarregadas (linha de cinzento). (n = 3; média ± DP; ns = não significativo.) CD107a (C) mobilização de superfície foi medida por citometria de fluxo ou células de controlepositivo Vδ2 (despreparados) ou preparadas de linfócitos mantidos no gelo (preparado + 3 h) seguindo um coculture com células de tumor de cérebro humano principal alvo. A percentagem de linfócitos é indicada em cada quadrante cytometric. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig3.jpg"> Figura 3 : Deteção e localização dos linfócitos efetores T dentro do cérebro de ratos de tumor-rolamento. Uma semana depois de glioblastoma cerebral implantação do tumor, as células imunes efetoras (aqui, descansando de células humanas de Vϒ9Vδ2 T periféricas) foram injetados nos cérebros de ratos. Uma semana após o tratamento de imunoterapia, os cérebros foram coletados, fixo e seccionados. Seções do cérebro foram coloridas para análise imuno-histoquímica (hematoxilina eosina e coloração safran [HES]) (painel esquerdo) ou manchado com anticorpo CD3 de anti-humano (painel direito). Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes. Barra de escala é indicada.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig4.jpg"> Figura 4 : Ativação de linfócitos efetores T coletados de cérebro de ratos tratados. Descanso de linfócitos T humanos (aqui, 4 x 106 humano αβ T linfócitos) foram injetados nos cérebros de ratos NSG. Após 48 horas, os cérebros foram coletados e dissociados. A percentagem de linfócitos de T infiltrando cérebro humanos foi medida por citometria de fluxo, usando um anticorpo anti-humano de CD3 (painel inferior). As células coletadas foram semeadas (10 células/poço) em placas de 96 poços de fundo U e estimulado (PHA-alimentador células e IL-2) por 20 dias (16 ciclos de duplicação). Nota, no dia 10, 13,3 x 106 de linfócitos T humanos foram obtidos (painel direito).

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Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K visualizações.  CRCINA. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.