Os autores desejam agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana do IRST.
Nota: Este procedimento é projetado especificamente para a detecção de um reduzido número de moléculas de cDNA em tecidos humanos fresco congelado. As secções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congelado, previamente validado tumor gástrico paciente-derivado ou amostras de tecido normal.
1. purificação e isolamento de RNA
<ol><li>
Extração de RNA Nota: A isolação do RNA é executada sob o capô, usando um produto específico (ver Tabela de materiais). No entanto, uma variedade de kits de isolamento estão comercialmente disponíveis.<ol>
<li>Homogeneizar 50-100 mg de amostra de tecido finamente cortada de fresco congelado em um tubo de 1,5 mL com 1 mL do reagente de isolamento de RNA e vórtice vigorosamente durante 15 s. Incubar os tubos a-80 ° C durante a noite.</li>
		<li>Incubar o tubo contendo a amostra em temperatura ambiente por 5 min e mistura vortexing por 15 s.</li>
		<li>Mantenha o tubo no gelo, adicionar 200 µ l de clorofórmio e vórtice vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Incubar os tubos à temperatura ambiente por 60 s e centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir a fase aquosa em um tubo de 1,5 mL e adicionar 20 µ g de glicogênio. Nota: É importante evitar cuidadosamente transferir qualquer interfase ou camada orgânica a fim de reduzir a contaminação.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de isopropanol, inversão do tubo para misturar e incubar no gelo por 10 min.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C, para precipitar o RNA. Nota: RNA estará presente em uma pelota gelatinosa do lado e o fundo do tubo, muitas vezes invisível após a centrifugação.</li>
		<li>Remover o sobrenadante sem perturbar o precipitado e lave-a com 1 mL de etanol a 75% por pipetagem.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
		<li>Deixe o sedimento secar até que o precipitado torna-se transparente e dissolvê-lo em 50 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Congele as amostras a-80 ° C pelo menos durante a noite antes de quantificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminação de DNA genômica e purificação de RNA Nota: Um passo de digestão de DNase, seguido por uma purificação de RNA baseados em colunas, é recomendado para análises de baixa abundância Alvos para digerir o DNA contaminante.<ol>
<li>Dissolva o liofilizado DNase I (1.500 Kunitz unidades) em 550 µ l de RNase-livre da água utilizando uma seringa, misture gentilmente por inversão do frasco e dividir a solução reconstituída em alíquotas.</li>
		<li>O volume calculado da amostra com 15 µ g de RNA de transferência em um tubo de 1,5 mL, 10 µ l de DNase digestão buffer do kit (listados na Tabela de materiais), 2,5 µ l de DNase solução estoque e RNase-livre da água a 100 µ l. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Adicione 350 µ l de tampão de lise do tecido (do kit, consulte Tabela de materiais) e misture por pipetagem.</li>
		<li>Adicione 250 µ l de etanol 100% e misture por pipetagem.</li>
		<li>Transferir todo o volume (700 µ l) em uma nova coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 15 s.</li>
		<li>Transferir o filtro para um novo tubo de coleção, adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 2 min.</li>
		<li>Abra a tampa da coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 5 min com um novo tubo de coleta para secar o filtro; Depois de transferir o filtro para um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 14 µ l de água livre de RNase diretamente para a coluna de filtro e centrifugar a 12.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Mantenha as amostras no gelo e proceder à quantificação usando 2 µ l da amostra em um Espectrofotômetro de bancada ou armazenar o RNA a-80 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntese de cDNA
<ol><li>Lugar de 1.000 ng do RNA, 4 µ l do mix mestre, 1 µ l de transcriptase reversa e água livre de RNase, até um volume final de 20 µ l em um tubo estéril de PCR. Misture delicadamente e spin para baixo.</li>
	<li>Incubar a mistura de reação em um termociclador, aplicando as seguintes condições: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C.</li>
	<li>Os tubos de centrifuga brevemente e proceder à análise dPCR ou armazenar a-20 ° C até ser necessário.</li>
</ol>3. reação de PCR digital setup
<ol><li>
reação de dPCR misturar e preparação da amostra
	<ol>
<li>Descongele o mestre mix e o ensaio à temperatura ambiente pelo menos 20 min.</li>
		<li>Diluir as amostras de cDNA a uma concentração de 300 ng em 6 µ l de água.</li>
		<li>Delicadamente, vórtice o mestre misturar e preparar a mistura em um tubo estéril com 8.7 µ l do mix mestre, 0,87 µ l do primer personalizado projetado ensaio CDH1a e 1.83 µ l de água livre de nuclease para um volume final de 11,4 µ l. Nota: Para detalhes de primeira demão CDH1a personalizado projetado ensaio consulte a Tabela de materiais.</li>
		<li>Transferência de 11,4 µ l da mistura preparada para a amostra diluída do cDNA, misture delicadamente e brevemente centrifugar. Nota: Os Volumes incluem excesso de 20% para compensar a perda de volume de pipetagem. Prepare a mistura para todas as amostras e um controle modelo não (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da microplaqueta Nota: Para obter melhores resultados carregar os chips mais rápido possível.<ol>
<li>Conecte o carregador a microplaqueta e esperar até que a luz indicadora fica verde.</li>
		<li>Retire a tampa da seringa fluido imersão puxando suavemente o êmbolo 1-2 mm e liberá-lo para facilitar essa etapa e substituí-lo com uma dica.</li>
		<li>Pegue um novo chip e tome nota do código escrito na tampa para associá-la com a amostra.</li>
		<li>Segure a tampa com cuidado, por seu lado, descascar afastado a película protetora e coloque a tampa com a cara pegajosa na orientação correta.</li>
		<li>Cuidadosamente pegue um chip, tomando cuidado para não tocar na parte interna e carregá-lo em ninho chip na posição correta, pressionando para baixo a alavanca para abrir a pinça.</li>
		<li>Carregar uma nova lâmina de carregamento sobre o carregador e empurre suavemente para garantir que é firmemente no lugar.</li>
		<li>Transferência de 14,5 µ l do mix dPCR reação sobre a lâmina de carregamento sem fazer bolhas de ar ou desviando a lâmina, depois que a imprensa o preto carregando o botão para distribuir o volume no chip.</li>
		<li>Use a seringa de fluido de imersão para transferir cerca de 20 gotas na superfície da microplaqueta, tomando cuidado para não tocar na superfície com a ponta. Nota: É importante cobrir toda a superfície sem derramar o líquido sobre as bordas.</li>
		<li>Gire o braço de carregador para fazer a tampa, entrar em contacto com o chip e pressione para baixo para 15 s.</li>
		<li>Pressione o botão da tampa para liberar o chip e coloca o braço para a posição.</li>
		<li>Segure o chip montado em um ângulo de 45° e cuidadosamente dispensar o líquido de imersão com a seringa através da porta de preenchimento, girar o chip ligeiramente para certificar-se de que há nenhuma bolha de ar e remover qualquer excesso de líquido com uma limpeza sterile.</li>
		<li>Fechar o caso do chip por descascar fora delicadamente a etiqueta em cima do chip tampa e pressione sobre a porta de preenchimento pelo menos 5 s.</li>
		<li>Armazene o chip no escuro até que esteja pronto para carregar no termociclador. Nota: Fichas preparadas devem ser usadas até 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
reação de dPCR
	<ol>
<li>Abra a tampa e instale os adaptadores para ambos os blocos, mesmo quando é usado um único bloco.</li>
		<li>Coloque as fichas sobre o bloco de amostra na posição correta. Nota: A porta de preenchimento deve ser orientada para a frente do termociclador em posição elevada para permitir que quaisquer bolhas de ar para flutuar para o topo sem perturbar a janela do chip. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.</li>
		<li>Coloque a almofada térmica sobre o bloco de amostra para cobrir completamente as fichas.</li>
		<li>Feche a tampa e começar a PCR executar, aplicando as seguintes condições: Segure a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min e 98 ° C por 30 s; Segure a 60 ° C por 2 min; manter a 4 ° C. Desligue o termociclador e descongelar os chips em temperatura ambiente pelo menos 10 min. Nota: Análise de Chip deve ser realizada dentro de uma hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise da microplaqueta
	<ol>
<li>Abra a tampa do instrumento e retirar as almofadas térmicas e, em seguida, remover os chips de adaptadores. Nota: Guarde as fichas em um local escuro, limpo, até a análise.</li>
		<li>Limpe a superfície do chip com isopropanol e uma limpeza estéril. Nota: Inspecione cada chip para vazamentos ou problemas potenciais.</li>
		<li>Insira o cabo USB o sistema detector para salvar os dados.</li>
		<li>Abra a bandeja do chip do sistema detector, carregar o chip voltado para cima na posição correta e feche a bandeja.</li>
		<li>Espere 30 s para processamento, então retire o chip e inserir o outro.</li>
		<li>Espere que a análise seja concluída para todos os chips transformados, em seguida, inserir o USB em um computador para transferir os arquivos. Nota: O tempo total para análise é cerca de 2 a 3 min/chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interpretação e análise de dados
<ol><li>Ligue para a plataforma de software baseado em nuvem necessária para realizar todas as análises a jusante.</li>
	<li>Criar um projeto e importar todos os arquivos de dados dos chips de interesse.</li>
	<li>Digite o nome da amostra; Selecione o corante e ensaio utilizado na aba "Definir Chips".</li>
	<li>Determine se o chip é aceitável, visualizando-a na guia "Dados de revisão", verificando como completamente a amostra foi carregada para o chip e quantos pontos de dados são avaliáveis. Nota: Rejeitar chips com menos de 13.000 pontos de dados avaliáveis.</li>
	<li>Avançar para o gráfico de dispersão do chip selecionado no lado direito da tela; aplica um limite de 6.000 para os sinais de corante fluoresceína amidite (FAM) repórter (eixo y) para todos os chips. Nota: O limite configurado pode variar com base em ensaios os usados.</li>
	<li>Remover quaisquer sinais positivos duvidosos para evitar resultados falso-positivos, selecionando o ponto relativo sobre o scatter plotagem usando a ferramenta laço e pressionar em "indeterminado". Todos os restantes pontos positivos indicam a presença de cópias do cDNA do raro alvo analisado.</li>
</ol>

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li><li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Assays+Part+I:+Partitioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics.">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li><li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR:+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia.">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li><li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR.">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

Os autores relatam que não há conflitos de interesse para este trabalho.

dPCR foi originalmente desenvolvido para DNA molecular medições10,11,12,13 e no tempo que essa tecnologia foi adaptada para a quantificação de microRNAs e RNA transcritos5, 14,15. Neste protocolo, ampliamos a lista de aplicativos que incluem detecção de transcrições raras derivada de amostras de tecido fresco congelado. Para esse fim, utilizamos uma quantidade bastante elevada de cDNA (300 ng). Apesar deste montante não é o máximo que pode ser usado em dPCR, foi suficiente para a criação de condições padronizadas comparar todas as amostras. Definindo o limite do sinal de florescimento em 6.000 e cuidando as localizações dos sinais de amplificação positiva sobre o chip e a dispersão do enredo, detectamos com êxito este destino raro em amostras de tecido do tumor gástrico.
Por dPCR, nós absolutamente não podia quantificar CDH1a, devido a uma quantidade muito baixa do alvo, mas pode confiantemente avaliamos a presença/ausência desta transcrição rara. Com efeito, a natureza quantitativa desta técnica é limitada pelo número inicial de alvos presentes na amostras analisadas7. De relevância, a técnica em si continua a ser bastante caro e tempo intensivo. Assim, quando a análise de várias amostras e/ou vários alvos é necessária, técnicas alternativas devem ser consideradas7,8.
Dito isso, dPCR, sem dúvida, fornece a plataforma final para medição sensível e quantificação de ácidos nucleicos, como melhora a precisão e a reprodutibilidade em relação qPCR7,8. Além disso, o que poderia ser considerada como o único método disponível para a análise de expressão gênica de baixo-abundante ácidos nucleicos que perto do limite de sensibilidade de qPCR6.
O protocolo descrito aqui pode ser adaptado a RNAs de quaisquer tecidos, permitindo a detecção de alvos raros, como em nosso estudo. Além disso, o ensaio pode ser estendido para quantificação absoluta de transcrições. Em tais casos, o número de cópias / µ l, relatado pelo instrumento de uma determinada amostra deve ser simplesmente multiplicado pelo volume carregado de reação e dividido pela quantidade inicial de cDNA. Para superar a variabilidade produzida pela transcrição reversa, calibradores de gene-específico devem ser incluídos, quando for possível6. Olhando para o futuro, dPCR detém considerável potencial em se tornar a plataforma padrão-ouro, não só para detecção de sequência rara, mas também deteção rara mutação e de quantificação precisa copiar número7. Isto é especialmente relevante em mosaicismo genético, bem como em pesquisa de câncer onde a heterogeneidade de tumor pode afetar resultados clínicos do paciente e da resposta ao tratamento.
Do ponto de vista prático, ao configurar o protocolo dPCR existem várias etapas críticas que devem ser destacadas. Primeiro de tudo, a mistura de reação contendo a quantidade adequada de cDNA com base no nível de expressão destino esperado, devem ser transferidos com grande cuidado no carregamento lâmina para não criar bolhas de ar, que podem interferir com a homogeneidade da amostra. Além disso, a própria lâmina primeiro deve ser posicionada adequadamente; caso contrário, que poderia resultar em uma distribuição desigual de amostra. Além disso, sempre deve ser executado suficiente revestimento com imersão fluida e precisa de vedação da tampa. Sobre o chip de processamento e análise, é importante estar ciente da possibilidade de acumular a condensação no chip; em tal cenário, o chip deve ser re-limpou com isopropanol e re-analisado. Além disso, dPCR é baseada em estatísticas de Poisson, um número mínimo de dados avaliáveis pontos (> 10.000) deve estar presente no chip, caso contrário a amostra deve ser executada novamente. Finalmente, para experimentos de deteção do alvo baixo cópia, um fator de confundimento crítico pode ser a relação sinal-ruído, mas um posicionamento de limiar de confiança pode ajudar na identificação de sinais muito positivos.

O gene CDH1 codifica para E-caderina, um factor-chave envolvidos na manutenção do epitélio gástrico normal através da regulamentação de1, de adesão, sobrevivência, proliferação e migração celular. Perda de proteína E-caderina, como resultado do germline deletério ou alterações somáticas de CDH1 tem sido associadas com o desenvolvimento de GC2,3. Non-canônico transcrições decorrentes intrão 2 do gene também tem sido a hipótese para desempenhar um papel na carcinogênese gástrica4,5. Em particular, uma tal transcrição, CDH1a, foi mostrada para ser expressa em células no GC, mas está ausente do estômago normal4. Recentemente detectamos CDH1a em amostras de tecido do GC de pacientes do GC usando chip baseada dPCR5. dPCR foi utilizado para avaliar, pela primeira vez, a presença da transcrição do gene CDH1a em GC intestinal e no tecido normal.
O método padrão-ouro para determinar a expressão do gene é PCR quantitativo em tempo real (qPCR). No entanto, os dados resultantes podem às vezes ser variável e de má qualidade, especialmente quando o nível do alvo na amostra é baixo. Esta variabilidade pode ser causada por contaminantes, que inibem a atividade do polymerase e recozimento da primeira demão, levando a amplificação não-específica e o lado competitivo reações6.
Embora os princípios básicos de bioquímicos da dPCR são semelhantes da qPCR, dPCR mostra algumas vantagens, permitindo medidas muito precisas do DNA genômico (gDNA) / complementar as moléculas de DNA (cDNA). Com efeito, dPCR é uma reação de ponto de extremidade que depende o particionamento calibrado de uma amostra em milhares de poços, para que cada um contém bem zero ou uma molécula alvo único. Então, amplificação ocorre apenas em poços que contém uma cópia do alvo e é indicada por um sinal fluorescente. O número absoluto de moléculas-alvo na amostra original, então, pode ser calculado determinando a proporção de positivos para totais partições usando binomial Poisson estatísticas7.
Além disso, a técnica de dPCR elimina a necessidade para a execução de uma curva padrão e, portanto, o viés associado e variabilidade, permitindo uma quantificação directa de alvos8,9; produz resultados mais precisos e reprodutíveis independentemente de contaminantes e eficiência devido a sua alta tolerância a inibidores de10; é mais sensível e específico que qPCR e, portanto, é um método confiável para a detecção de um destino de rara. Finalmente, o particionamento da amostra em várias reações reduz a competição com moléculas de fundo e melhora o limite de detecção de alvo, possibilitando a amplificação e facilitar a detecção de moléculas simples de gDNA/cDNA6 . A detecção e quantificação de ácidos nucleicos por chip baseada dPCR foi cada vez mais aplicado para copiar número variação, fragmentos de quantificação de DNA e mutação analisa11,12,13, dada a precisão e material de baixa exigência do método de entrada. Além disso, dPCR recentemente foi integrada a análise de ambos os microRNAs14 e gene transcrições5,15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">TRIazol Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycogen 20 mg/ml</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iScript cDNA Synthesis kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">CDH1a IDT custom designed assay</td>
			<td style="width:159px;">Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:339px;">F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG 
			(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG 
			(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ 
			[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermocycler (Labcycler)</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>011-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dual Flat Block Sample Module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4425757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4486414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">4485513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4482592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4489084</td>
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detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

CDH1a, uma transcrição não-canônicos do gene CDH1 , foi encontrado para ser expressa em algumas linhas de células de câncer gástrico (GC), Considerando que está ausente na mucosa gástrica normal. Recentemente, nós detectamos variante de transcrição CDH1a em tecidos de tumor fresco congelado obtidos de pacientes com GC. A expressão desta variante em amostras de tecido foram investigada pela microplaqueta digital PCR (dPCR) abordagem aqui apresentada. dPCR oferece o potencial para uma medição precisa, robusta e altamente sensível de ácidos nucleicos e é cada vez mais utilizada para muitas aplicações em diferentes campos. dPCR é capaz de detectar alvos raros; Além disso, dPCR oferece a possibilidade de quantificação absoluta e precisa de ácidos nucleicos, sem a necessidade de calibradores e curvas padrão. Na verdade, o particionamento de reação enriquece o alvo do plano de fundo, o que melhora a eficiência de amplificação e tolerância aos inibidores. Tais características fazem dPCR uma ferramenta ideal para a deteção da transcrição CDH1a rara.

Usando o procedimento aqui apresentado, verificamos para a expressão da variante rara de transcrição CDH1a em tecidos gástricos fresco congelado. A análise por dPCR foi realizada em amostras de tecido normal e câncer 21-emparelhado e em 11 amostras de tumor adicionais. CDH1a foi detectável em tumores 15 de 32 (47%), Considerando que não há amostras de tecido normal mostraram a presença desta transcrição rara5. Em nossa análise, chips com menos de 13.000 pontos de dados foram rejeitadas, como eram fichas com embarque não homogéneo. A Figura 1 mostra uma microplaqueta ver para avaliáveis (figura 1A) e não-avaliáveis (figura 1B, C) amostras. No caso do último, o chip deve ser descartado devido à presença de bolhas múltiplas (figura 1B), uma única grande bolha (Figura 1), ou como resultado de um número insuficiente de pontos de dados acima do limiar (figura 1B). Estas amostras devem ser executadas novamente para obter resultados interpretáveis. No que se refere o gráfico de dispersão fornecido pelo software (Figura 2), normalmente retrata os sinais da tintura repórter FAM (eixo y) contra os sinais da tintura repórter VIC (proprietário do fabricante) (eixo x). Os pontos de dados que apresentou sobre o gráfico de dispersão são codificadas por cores, e aqui, nós apenas visualizados os sinais de corante repórter FAM em azul (Figura 2A), indicando os poços em que o alvo foi amplificado. Esses sinais estão localizados o mais próximo para o eixo y e mais distante da origem da trama. A segunda cor que vi sobre a trama é amarela e é indicativa dos poços no qual ocorreu sem amplificação. Um limite de confiança para os sinais positivos foi definido e aplicado a todas as fichas para evitar viés de chamada. Aqui, o limiar selecionado foi 6.000 baseado na faixa de sinais observados para os vários chips nesses experimentos. CDH1a do cDNA cópias (sinais azuis) foram encontrado em um número de amostras de tumor, mostrando uma clara diferença na amplitude dos sinais negativos (Figura 2A). Inversamente, sem sinais acima do limiar selecionado foram encontrados em amostras negativas para CDH1a transcrição, ou seja, todas as amostras de tecido normal e algumas amostras do tumor (Figura 2B). Da mesma forma, não há sinais positivos foram detectados no NTC em que a água foi adicionada ao invés de cDNA, portanto, servindo como um controle negativo para a reação de dPCR (Figura 2).
Uma análise bem chip devem ser aplicadas aos pontos de dados de filtro de baixa qualidade e eliminar o risco de resultados ambíguos. Isto foi feito através da visualização do chip para determinar a localização exata do correspondente sinal positivo: se o sinal azul situa-se nas fronteiras muito do chip (Figura 3A), ou em torno de bolhas (figura 1B), o sinal está dispensado da análise . Para evitar ainda mais o risco de falsos positivos, sinais acima de 6.000 para o canal de FAM e na extrema direita da trama foram considerados como provavelmente controvérsias e assim foram filtrados para fora, mesmo que eles foram localizados dentro do chip (Figura 3B). Desta forma, uma amostra é considerada positiva para a expressão da transcrição rara, CDH1a, mesmo se ele mostra um sinal único de amplificação, enquanto que o sinal está em conformidade com as condições acima mencionadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig1.jpg"> Figura 1 . Representante chips avaliáveis e não-avaliáveis. Os pontos azuis são poços em que a transcrição de CDH1a foi amplificada; os pontos amarelos são poços no qual ocorreu sem amplificação; os pontos brancos são poços vazios. Pontos de dados acima do limiar são indicados por baixo de cada chip. (A), um chip avaliável com azul sinais localizados dentro das fronteiras do chip. (B) A não-avaliáveis chip com menos de 13.000 pontos de dados acima do limiar. (C) A não-avaliáveis chip com uma bolha grande. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig2.jpg"> Figura 2 . Dispersão PCR digital representativas de parcelas CDH1a expressão. Parcelas mostram sinais da tintura repórter FAM (eixo y) contra os sinais da tintura repórter VIC (eixo x). Os pontos azuis são sinais de expressão positiva de CDH1a , enquanto os pontos amarelos são os sinais de "Sem amplificação". (A) CDH1a-amostra positiva. (B) CDH1a-amostra negativa. (C) nenhum controle modelo (NTC) mostrando zero CDH1a expressão. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig3.jpg"> Figura 3 . Representante multa-chip análise de dispersão PCR digital parcelas. À esquerda está a vista de microplaqueta com os sinais de interesse zoom-in em um preto quadrado, enquanto à direita é o correspondente gráfico de dispersão. (A) um sinal azul, localizado a fração correta da trama, mas na fronteira do chip. (B) três sinais azuis destacados em cinza localizada na extrema direita da trama, mas dentro do chip. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

6.1K visualizações.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

Vídeo: Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Pesquisa do câncer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image analysis. Digital scanning is a fast way to scan a stack of slides and produce digital images with high quality. It can produce concordant results with conventional light microscopy (CLM) by pathologists. Furthermore, the availability of digital images makes it possible that the same slide can be concurrently observed by multiple people. Moreover, digital images of slides can be stored in a database, which means the long-term deterioration of glass slides is avoided. The limitations of this technique are as follows. First, it needs high-quality prepared tissue and the original immunohistochemistry (IHC) slides without any damage or excess sealant residue. Second, tumor or nontumor areas should be specified by experienced pathologists before the analysis using software, in order to avoid any confusion about the tumor or nontumor areas during scoring. Third, the operator needs to control the color reproduction throughout the digitization process in whole-slide imaging.

ZW10 interacting protein (ZWINT) participates in the mitotic spindle checkpoint and the pathogenesis of carcinoma. Here, we introduce a methodology of the immunostaining of ZWINT in human lung cancer tissues, followed by the digital scanning of whole slides and image analysis. This methodology can provide high-quality digital images and reliable results.

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so by a process called retrotransposition wherein they transcribe to form an mRNA intermediate which is then consequently inserted into the genome by reverse transcription. Despite being silent in normal cells, LINE-1s are highly active in different epithelial tumors. De novo LINE-1 insertions can potentially drive tumorigenesis, and hence it is important to systematically study LINE-1 retrotransposition in cancer. Out of ~150 retrotransposition-competent LINE-1s present in the human genome, only a handful of LINE-1 loci, also referred to as &#34;hot&#34; LINE-1s, account for the majority of de novo LINE-1 insertion in different cancer types. We have developed a simple polymerase chain reaction (PCR)-based method to monitor retrotransposition activity of these hot LINE-1s. This method, based on long-distance inverse (LDI)-PCR, takes advantage of 3&#180; transduction, a mechanism by which a LINE-1 mobilizes its flanking non-repetitive region, which can subsequently be used to identify de novo LINE-1 3&#180; transduction events stemming from a particular hot LINE-1.

This article outlines a simple PCR-based assay to monitor the activity of an active LINE-1 retrotransposon and to map de novo retrotranspositions in a given genome. Using the MCF7 cell line, we demonstrate herein how this method can be applied to detect activity of a LINE-1 located at 22q12.1.

Detecção de atividade de retrotransposição de Hot LINE-1s por PCR inverso de longa distância

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...