Los autores desean agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.

El protocolo sigue las pautas del Comité de ética de investigación humana de primera.
Nota: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de cDNA en tejidos humanos, congelado. Las secciones de tejido se han reducido en hielo seco, mientras que siguen congeladas, de tumor gástrico paciente derivado previamente validado o muestras de tejido normal.
1. purificación y aislamiento de ARN
<ol><li>
Extracción de RNA Nota: El aislamiento de RNA se lleva a cabo bajo la campana con un producto específico (véase Tabla de materiales). Sin embargo, una variedad de kits de aislamiento están comercialmente disponibles.<ol>
<li>Homogeneizar 50-100 mg finamente cortadas congeladas en fresco de muestra de tejido en un tubo de 1,5 mL con 1 mL del reactivo de aislamiento de RNA y vortex vigorosamente durante 15 s. incubar los tubos a-80 ° C durante la noche.</li>
		<li>Incubar el tubo que contiene la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y mezclar con un vórtex durante 15 s.</li>
		<li>Mantenga el tubo en hielo, añada 200 μL de cloroformo y agitar vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 60 s y centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir la fase acuosa en un tubo de 1,5 mL y agregar 20 μg de glucógeno. Nota: Es importante evitar cuidadosamente transferir cualquier de la interfase o capa orgánica con el fin de reducir la contaminación.</li>
		<li>Añadir 500 μl de isopropanol, invertir el tubo para mezclar e incubar en hielo durante 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C para precipitar el RNA. Nota: RNA estará presente en un pellet de gel-como en el lado y la parte inferior del tubo, a menudo invisible después de la centrifugación.</li>
		<li>Quite el sobrenadante sin molestar el precipitado y lave con 1 mL de etanol al 75% mediante pipeteo.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
		<li>Que el sedimento seco hasta que el precipitado se vuelve transparente y disolver en 50 μl de agua libre de ARNasa.</li>
		<li>Congelar las muestras a-80 ° C al menos durante la noche antes de la cuantificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminación de ADN genómico y purificación de RNA Nota: Un paso de digestión ADNsa, seguido por una purificación de RNA base de columna, se recomienda para el análisis de los objetivos de baja abundancia para digerir DNA contaminante.<ol>
<li>Disolver el liofilizado DNasa I (1.500 unidades de Kunitz) en 550 μl de ARNasa-libre del agua utilizando una jeringa, mezclar suavemente por inversión del frasco y dividir la solución reconstituida en alícuotas.</li>
		<li>El volumen calculado de la muestra con 15 μg de RNA de transferencia en un tubo de 1.5 mL, 10 μl de la digestión de la ADNsa buffer del kit (enumeradas en Tabla de materiales), 2.5 μl de DNasa de solución madre y libre de Rnasa de agua a 100 μl. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Añadir 350 μl de tampón de lisis del tejido (del kit, consulte la Tabla de materiales) y mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Transferir todo el volumen (700 μL) en una nueva columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 15 s.</li>
		<li>Transferir el filtro a un tubo nuevo de colección, Añadir 500 μl de etanol al 80% a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 2 minutos.</li>
		<li>Abra la tapa de la columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 5 min con un tubo de colección nuevo para secar el filtro; luego transferir el filtro a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Agregue 14 μl de agua libre de ARNasa directamente en la columna de filtro y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación con 2 μl de la muestra en un espectrofotómetro de mesa o guardar el ARN a-80 ° C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntesis de cDNA
<ol><li>Lugar 1.000 ng de RNA, 4 μL de la mezcla principal, 1 μl de transcriptasa reversa y agua libre de ARNasa a un volumen final de 20 μl en un tubo estéril de la polimerización en cadena. Mezclar suavemente y desactivación.</li>
	<li>Incubar la mezcla de reacción en el termociclador, aplicando las siguientes condiciones: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 minutos a 85 ° C.</li>
	<li>Centrifugar los tubos brevemente y proceder al análisis de dPCR o almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.</li>
</ol>3. configurar la reacción de PCR digital
<ol><li>
reacción de dPCR mezcla y preparación de muestras
	<ol>
<li>Descongelar la mezcla principal y el ensayo a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.</li>
		<li>Diluir las muestras de cDNA para una concentración de 300 ng de 6 μl de agua.</li>
		<li>Suavemente vortex el amo mezclar y preparar la mezcla en un tubo estéril con 8.7 μl de la mezcla principal, 0.87 μl del primer ensayo de diseño personalizado CDH1a y 1.83 μl de agua libre de nucleasa para un volumen final de 11.4 μL. Nota: Para CDH1a ensayo diseñado personalizado primer detalles ver la Tabla de materiales.</li>
		<li>Transferir 11,4 μL de la mezcla preparada a la muestra de cDNA diluido, mezclar suavemente y centrifugar brevemente. Nota: Volúmenes incluyen exceso de 20% para compensar la pérdida de volumen de pipeteo. Preparar la mezcla de todas las muestras y no control de la plantilla (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la viruta Nota: Para obtener resultados óptimos de carga las fichas tan pronto como sea posible.<ol>
<li>Enchufe el cargador chip y esperar hasta que el indicador luminoso se pone verde.</li>
		<li>Retire la tapa de la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente hacia atrás el émbolo 1-2 mm y para facilitar este paso y reemplazarlo con una punta de lanza.</li>
		<li>Un nuevo chip y tomar nota del código escrito en la tapa para asociar a la muestra.</li>
		<li>Coloque la tapa con cuidado por su lado, retire la película protectora y coloque la tapa con la cara pegajosa hacia arriba en la orientación correcta.</li>
		<li>Cuidadosamente levante un chip, teniendo cuidado de no para tocar la parte interna y cargarlo en el nido de chip en la posición correcta, presionando hacia abajo la palanca para abrir la abrazadera.</li>
		<li>Cargar una nueva hoja de carga en el cargador y empújelo suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar.</li>
		<li>Transferencia de 14,5 μl de la mezcla de reacción de dPCR sobre la cuchilla de carga sin hacer burbujas de aire o desviar la hoja, después de que prensa el negro carga botón para distribuir el volumen en el chip.</li>
		<li>Utilizar la jeringa de líquido de inmersión para transferir unos 20 gotas sobre la superficie del chip teniendo cuidado de no para tocar la superficie con la punta. Nota: Es importante cubrir toda la superficie sin derramar líquido sobre los bordes.</li>
		<li>Gire el brazo de la cargadora para hacer la tapa entra en contacto con el chip y presione hacia abajo para 15 s.</li>
		<li>Presione el botón para liberar el chip y volver el brazo a su posición.</li>
		<li>Sostenga el chip montado en un ángulo de 45° con cuidado prescindir la jeringa a través del puerto de llenado de líquido de inmersión, gire el chip un poco para asegurarse de que no hay burbujas de aire y retire cualquier exceso de líquido con un paño estéril.</li>
		<li>Sellar la caja de la viruta de peeling suavemente lejos la etiqueta encima de la tapa de la viruta y la prensa sobre el puerto de llenado para por lo menos 5 s.</li>
		<li>Guardar el chip en la oscuridad hasta que esté listo para cargar en el termociclador. Nota: Puede usarse chips preparados dentro de 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
reacción de dPCR
	<ol>
<li>Abra la tapa e instale a los adaptadores para ambos bloques, incluso cuando se utiliza un solo bloque.</li>
		<li>Coloque las fichas en el bloque de muestra en la posición correcta. Nota: El orificio de llenado debe estar orientado hacia la parte delantera del termociclador en una posición elevada para permitir que cualquier burbuja de aire para flotar en la parte superior sin molestar a la ventana de la viruta. Utilizar fichas vacías para equilibrar los dos bloques.</li>
		<li>Coloque la almohadilla térmica sobre el bloque de muestras para cubrir completamente las virutas.</li>
		<li>Cierre la tapa y comenzar la PCR ejecutar, aplicando las siguientes condiciones: mantener a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min y a 98 ° C por 30 s; mantener a 60 ° C por 2 min; mantener a 4 ° C. Apague el termociclador y descongelar los chips a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Nota: Análisis de la viruta deben realizarse dentro de una hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de la viruta
	<ol>
<li>Abra la tapa del instrumento y quite las almohadillas térmicas, luego retire las virutas de los adaptadores. Nota: Almacenar las virutas en un lugar oscuro y limpio hasta su análisis.</li>
		<li>Limpie la superficie del chip con isopropanol y un paño estéril. Nota: Inspeccione cada chip para fugas o posibles problemas.</li>
		<li>Inserte el USB en el sistema detector para guardar los datos.</li>
		<li>Abrir la bandeja del chip del sistema detector, cargar el chip boca arriba en la posición correcta y cierre la bandeja.</li>
		<li>Esperar 30 s para el procesamiento, quite el chip e Inserte el siguiente.</li>
		<li>Espere a que el análisis ser completado para todos los chips de procesado y luego inserte el USB en un ordenador para transferir los archivos. Nota: El tiempo total de análisis es alrededor de 2 a 3 min y virutas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interpretación y análisis de datos
<ol><li>Conecte a la plataforma de software en la nube necesaria para llevar a cabo todos los análisis posteriores.</li>
	<li>Crear un proyecto e importar todos los archivos de datos de las fichas de interés.</li>
	<li>Introduzca el nombre de la muestra; seleccionar el tinte y análisis utilizados en la pestaña de "Chips de definir".</li>
	<li>Determinar si el chip es aceptable, visualizar en la pestaña de "Datos del informe", revisando minuciosamente cómo la muestra fue cargada en el chip y cuántos puntos son evaluables. Nota: Rechazan chips con menos de 13.000 puntos de datos evaluables.</li>
	<li>Pasemos a la trama de la dispersión de la viruta seleccionada a la derecha de la pantalla; un umbral de 6.000 para las señales de tinte fluoresceína amidite (FAM) reportero (eje y) se aplica a todas las fichas. Nota: El umbral puede variar sobre la base de los ensayos utilizados.</li>
	<li>Quite cualquier dudosas señales positivas para evitar resultados falsos positivos, seleccionando el lugar relativo de la dispersión solar usando la herramienta lazo y pulsando en "indeterminado". Todos los restantes puntos positivos indican la presencia de copias cDNA del raro objetivo analizado.</li>
</ol>

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li><li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Assays+Part+I:+Partitioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Huggett, J. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

Los autores no divulgan conflictos de interés para este trabajo.

dPCR fue desarrollado originalmente para el ADN molecular medidas10,11,12,13 y en el tiempo que esta tecnología fue adaptada para la cuantificación de microRNAs y RNA transcripciones5, 14,15. En este protocolo hemos ampliado la lista de aplicaciones que incluyen la detección de las transcripciones raras derivada de las muestras de tejido fresco congelado. Para ello se utilizó una cantidad bastante alta de cDNA (300 ng). Aunque esta cantidad no es lo máximo que se puede utilizar en dPCR, era suficiente para establecer condiciones estandarizadas comparar nuestras muestras. Ajuste del umbral de la señal de floración en 6.000 y ocupándose de la ubicación de señales de amplificación positiva en el chip y la dispersión de la trama, se detectaron con éxito este objetivo rara en muestras de tejido del tumor gástrico.
Por dPCR, nosotros no podríamos cuantificar absolutamente CDH1a, debido a una muy baja cantidad de la meta, pero confiablemente podríamos evaluar la presencia/ausencia de esta transcripción rara. De hecho, la naturaleza cuantitativa de esta técnica está limitada por el número inicial de objetivos presentes en las muestras analizadas7. De relevancia, la técnica sí mismo queda bastante costoso y tiempo intensivo. Así, cuando el análisis de numerosas muestras o de varios objetivos es necesario, técnicas alternativas deben considerarse7,8.
Dicho esto, dPCR sin duda proporciona la última plataforma para sensible medición y cuantificación de ácidos nucleicos, ya que mejora la precisión y reproducibilidad respecto de qPCR7,8. Por otra parte, podría considerarse como el único método disponible para el análisis de expresión génica de los ácidos nucleicos bajo abundante que cerca del límite de sensibilidad de qPCR6.
El protocolo aquí descrito se puede adaptar a RNAs de cualquier tejido, lo que permite la detección de objetivos raros, como en nuestro estudio. Además, el ensayo podría extenderse a la cuantificación absoluta de las transcripciones. En tales casos, el número de copias/μl registrados por el instrumento en una muestra dada debe multiplicado por el volumen de reacción cargados simplemente y dividido por la cantidad inicial de cDNA. Para superar la variabilidad producida por la reverso-transcripción, calibradores de gene específico debe incluidas, cuando sea posible6. Mirando al futuro, dPCR tiene considerable potencial en convertirse en la plataforma estándar de oro, no sólo para la detección de la secuencia rara, pero también detección de mutación rara y copia exacta de cuantificación número7. Esto es especialmente relevante en mosaicismo genético, así como en la investigación del cáncer donde heterogeneidad del tumor puede afectar el resultado clínico del paciente y respuesta al tratamiento.
Desde el punto de vista práctico, al configurar el protocolo de dPCR hay varios pasos fundamentales que deben ser resaltados. En primer lugar, la mezcla de reacción que contiene la cantidad apropiada de cDNA basado en el nivel de expresión de lo esperado, debe ser transferida con gran cuidado en la hoja de carga para no crear burbujas de aire, que podrían interferir con la homogeneidad de la muestra. Además, la hoja se debe primero colocarse apropiadamente; de lo contrario podría resultar en una distribución desigual de la muestra. Además, siempre se debe realizar suficiente capa con inmersión fluido y preciso cierre de la tapa. En cuanto a chip de procesamiento y análisis, es importante ser consciente de la posibilidad de acumulación de condensación en el chip; en tal escenario, la viruta debe volver a limpiar con isopropanol y volver a analizar. Por otra parte, como dPCR se basa en las estadísticas de Poisson, un número mínimo de datos evaluables puntos (> 10.000) debe estar presente en el chip, de lo contrario la muestra debería ejecutarse otra vez. Finalmente, para los experimentos de detección de copia baja objetivo, un factor de confusión importante podría ser la relación señal a ruido, pero un posicionamiento confiable umbral puede ayudar en la identificación de señales reales positivas.

El gen CDH1 codifica para E-cadherina, un factor clave en el mantenimiento del epitelio gástrico normal a través de la regulación de la adherencia, la supervivencia, proliferación y migración de células1. Pérdida de la proteína cadherina-como resultado del germline deletéreo o alteraciones somáticas de CDH1 se han asociado con el desarrollo del GC2,3. Otras transcripciones resultantes del intrón 2 del gen también han presumido para desempeñar un papel en la carcinogénesis gástrica4,5. En particular, un tal transcripción, CDH1a, se ha demostrado para ser expresados en líneas celulares de GC pero está ausente de los de estómago normal4. Recientemente detectamos CDH1a en muestras de tejido de GC de GC pacientes utilizando dPCR basada en chip5. dPCR fue utilizado para evaluar, por primera vez, la presencia de la transcripción del gene CDH1a GC intestinal y el tejido normal.
El método estándar de oro para determinar la expresión génica es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Sin embargo, los datos resultantes a veces pueden ser variable y de mala calidad, especialmente cuando el nivel de objetivo en la muestra es bajo. Esta variabilidad puede ser causada por contaminantes, los cuales inhiben la actividad de polimerasa y el recocido de la cartilla, conduciendo a la amplificación inespecífica y de reacciones del lado competitivo6.
Aunque los principios bioquímicos básicos de dPCR son similares a los de la qPCR, dPCR muestra algunas ventajas, lo que permite mediciones muy precisas de DNA genómico (gDNA) / complementarios las moléculas de ADN (cDNA). De hecho, dPCR es una reacción de punto final que se basa en repartir calibrado de una muestra en miles de pozos, para que cada uno también contiene cero o molécula de un solo objetivo. Amplificación se produce sólo en los pozos que contienen una copia del blanco y se indica mediante una señal fluorescente. Entonces, el número absoluto de moléculas Diana en la muestra original puede calcularse determinando la proporción de positivos a particiones total con binomial Poisson estadísticas7.
Además, la técnica de dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo asociado y variabilidad, lo que permite una cuantificación directa de objetivos8,9; produce resultados más precisos y reproducibles independientemente de contaminantes y eficiencia debido a su alta tolerancia a los inhibidores de la10; es más sensible y específica que la qPCR y por lo tanto es un método fiable para la detección de un blanco raro. Por último, el repartir de la muestra en reacciones múltiples reduce la competencia con las moléculas de fondo y mejora el límite de detección de blancos, permitiendo la amplificación y facilitar la detección de las moléculas individuales del gDNA/cDNA6 . La detección y cuantificación de ácidos nucleicos por dPCR basada en chip se ha aplicado cada vez más para copiar la variación en el número, fragmentos de cuantificación del ADN y mutación analiza11,12,13, dado el precisión y el material de baja entrada de requisito del método. Además, dPCR recientemente se ha integrado en el análisis de ambos microRNAs14 y gene transcripción5,15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">TRIazol Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycogen 20 mg/ml</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iScript cDNA Synthesis kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">CDH1a IDT custom designed assay</td>
			<td style="width:159px;">Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:339px;">F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG 
			(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG 
			(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ 
			[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermocycler (Labcycler)</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>011-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dual Flat Block Sample Module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4425757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4486414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">4485513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4482592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4489084</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

CDH1a, una no-canónico transcripción del gen CDH1 , se ha encontrado para ser expresado en algunas líneas celulares de cáncer gástrico (CG), mientras que está ausente en la mucosa gástrica normal. Recientemente, se detectó CDH1a variante de transcripción en los tejidos del tumor congelado obtenidos de pacientes con GC. La expresión de esta variante en muestras de tejido fueron investigada por el chip digital PCR (dPCR) enfoque presentado aquí. dPCR ofrece el potencial para una medición precisa, robusta y altamente sensible de los ácidos nucleicos y cada vez más se utiliza para muchas aplicaciones en diferentes campos. dPCR es capaz de detectar blancos raros; Además, dPCR ofrece la posibilidad de cuantificación absoluta y precisa de los ácidos nucleicos sin necesidad de calibradores y curvas estándar. De hecho, el repartir de reacción enriquece el objetivo del fondo, que mejora la eficiencia de amplificación y tolerancia a los inhibidores. Tales características hacen dPCR una herramienta óptima para la detección de la transcripción rara CDH1a .

Utilizando el procedimiento presentado aquí, se revisaron para la expresión de la variante rara transcripción CDH1a en tejidos gástricos congelado. El análisis de dPCR fue realizado en muestras de tejido de normal y cáncer 21-emparejados y en 11 muestras de tumor adicionales. CDH1a era perceptible en los tumores de 15 clientes de los 32 (47%), mientras que no hay muestras de tejido normal demostraron la presencia de esta rara transcripción5. En nuestro análisis, fichas con menos de 13.000 puntos de datos fueron rechazados, como chips con carga no homogéneas. Figura 1 muestra un chip para ve los valorables (figura 1A) y no valorables (figura 1B, C) muestras. En el caso de este último, el chip debe ser desechado debido a la presencia de múltiples burbujas (figura 1B), una sola gran burbuja (figura 1), o como resultado de un número suficiente de puntos de datos por encima del umbral (figura 1B). Estas muestras se deben ejecutar otra vez para obtener resultados interpretables. Con respecto a la trama de la dispersión proporcionada por el software (figura 2), normalmente representa las señales de la tintura de reportero de FAM (eje y) contra las señales de la tintura de reportero de VIC (propietario del fabricante) (eje x). Los puntos de datos presentados en el diagrama de dispersión están codificados por colores, y aquí, sólo visualizamos las FAM reportero tinte señales en azul (figura 2A), indicando que los pozos en que se amplió el objetivo. Estas señales se encuentran más cerca al eje y y más lejos el origen de la trama. El segundo color en la parcela es de color amarillo y es indicativo de los pozos en que se produjo sin amplificación. Un umbral fiable de las señales positivas fue establecido y aplicado a todas las fichas para evitar el sesgo de la llamada. Aquí, el umbral seleccionado era 6.000 basado en la gama de señales observadas para los diferentes chips en estos experimentos. CDH1a copias de cDNA (señal azul) fueron encontrados en un número de muestras tumorales, mostrando una clara diferencia en la amplitud de señales negativas (figura 2A). Por el contrario, ninguna señal por encima del umbral seleccionado fueron encontrada en las muestras negativa para CDH1a transcripción, es decir, todas las muestras de tejido normal y algunas muestras de tumor (figura 2B). Del mismo modo, no hay señales positivas fueron detectadas en el Consejo Nacional de transición en la que se añade agua en lugar de cDNA, por lo tanto servir como un control negativo de la reacción de dPCR (figura 2).
Un análisis fino de la viruta se debe aplicar al filtro de la baja calidad los puntos de datos y eliminar el riesgo de resultados ambiguos. Esto se hizo mediante la visualización de la viruta para determinar la ubicación exacta de la señal positiva: Si la señal azul se encuentra en las fronteras muy de viruta (Figura 3A) o alrededor de las burbujas (figura 1B), la señal es desestimada a partir del análisis . Para evitar aún más el riesgo de falsos positivos, las señales por encima de 6.000 para el canal de FAM y de la extrema derecha de la parcela se consideraron como probablemente específico y así se filtraron hacia fuera, a pesar de fueron localizados dentro de la viruta (figura 3B). De esta manera, una muestra se considera positiva para la expresión de la transcripción rara, CDH1a, aunque demuestra una señal de amplificación individuales, como señal de cumple con las condiciones mencionadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig1.jpg"> Figura 1 . Fichas evaluables y no evaluables representante. Los puntos azules son los pozos en los que se amplificó la transcripción de CDH1a ; los puntos amarillos son los pozos en los que no hay amplificación producido; los puntos blancos son los pozos vacíos. Puntos de datos por encima del umbral se indican debajo de cada chip. (A) un chip evaluable con azul las señales localizadas dentro de las fronteras de la viruta. (B) un chip no evaluable con menos de 13.000 puntos de datos por encima del umbral. (C) A chip no evaluable con una burbuja de grande dimensiones. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig2.jpg"> Figura 2 . Parcelas representativas digital dispersión PCR CDH1a expresión. Parcelas representan señales del tinte de reportero de FAM (eje y) contra las señales de la tintura de reportero de VIC (eje x). Los puntos azules son señales de expresión positiva de CDH1a , mientras que los puntos amarillos son las señales de "No hay amplificación". (A) CDH1a-muestra positiva. (B) CDH1a-muestras negativas. (C) no hay control de plantilla (NTC) mostrando cero expresión CDH1a . <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57066/57066fig3.jpg"> Figura 3 . Parcelas representativas análisis de viruta fina de dispersión PCR digital. La izquierda es la vista de la viruta con las señales de interés ampliada en un negro cuadrado, mientras que a la derecha es el correspondiente diagrama de dispersión. (A) una señal azul localizada en la fracción correcta de la parcela pero en la frontera de la viruta. (B) tres señales azul resaltadas en gris localizado en el extremo derecho de la parcela pero en el chip. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57066/57066fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

6.1K vistas.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Suero y Plasma copia número detección mediante PCR en tiempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

Tinción elástica en diapositivas incrustadas en parafina de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image analysis. Digital scanning is a fast way to scan a stack of slides and produce digital images with high quality. It can produce concordant results with conventional light microscopy (CLM) by pathologists. Furthermore, the availability of digital images makes it possible that the same slide can be concurrently observed by multiple people. Moreover, digital images of slides can be stored in a database, which means the long-term deterioration of glass slides is avoided. The limitations of this technique are as follows. First, it needs high-quality prepared tissue and the original immunohistochemistry (IHC) slides without any damage or excess sealant residue. Second, tumor or nontumor areas should be specified by experienced pathologists before the analysis using software, in order to avoid any confusion about the tumor or nontumor areas during scoring. Third, the operator needs to control the color reproduction throughout the digitization process in whole-slide imaging.

ZW10 interacting protein (ZWINT) participates in the mitotic spindle checkpoint and the pathogenesis of carcinoma. Here, we introduce a methodology of the immunostaining of ZWINT in human lung cancer tissues, followed by the digital scanning of whole slides and image analysis. This methodology can provide high-quality digital images and reliable results.

Análisis digital de inmunomanchado de ZW10 Interacción de proteínas en tejidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so by a process called retrotransposition wherein they transcribe to form an mRNA intermediate which is then consequently inserted into the genome by reverse transcription. Despite being silent in normal cells, LINE-1s are highly active in different epithelial tumors. De novo LINE-1 insertions can potentially drive tumorigenesis, and hence it is important to systematically study LINE-1 retrotransposition in cancer. Out of ~150 retrotransposition-competent LINE-1s present in the human genome, only a handful of LINE-1 loci, also referred to as &#34;hot&#34; LINE-1s, account for the majority of de novo LINE-1 insertion in different cancer types. We have developed a simple polymerase chain reaction (PCR)-based method to monitor retrotransposition activity of these hot LINE-1s. This method, based on long-distance inverse (LDI)-PCR, takes advantage of 3&#180; transduction, a mechanism by which a LINE-1 mobilizes its flanking non-repetitive region, which can subsequently be used to identify de novo LINE-1 3&#180; transduction events stemming from a particular hot LINE-1.

This article outlines a simple PCR-based assay to monitor the activity of an active LINE-1 retrotransposon and to map de novo retrotranspositions in a given genome. Using the MCF7 cell line, we demonstrate herein how this method can be applied to detect activity of a LINE-1 located at 22q12.1.

Detección de la actividad de retrotransposición de Hot LINE-1 por PCR inverso de larga distancia

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Detección de la progresión del tumor pulmonar en ratones por imágenes por ultrasonido

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...