Este trabalho foi financiado por uma concessão do NINDS para KMC (R01 NS086932). LMN foi apoiado por uma bolsa do programa de NIGMS IMSD (R25 GM076419). Estirpes utilizadas neste estudo c. elegans centro de genética, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos a James Baker e Mason Klein para debates úteis.

1. cepas, cultura, mídia e montagem de animais
<ol><li>C. elegans worms a 20 ° C em padrão-60mm nematódeo crescimento médio (NGM) placas de ágar inoculadas com OP50 Escherichia coli alimentar bacteriana19de crescer.</li>
	<li>Prepare dois plasmídeos para cada promotor celular específico de interesse: um, dirigindo a expressão de GCaMP5 de registro intracelular Ca2 +e no segundo, dirigindo a expressão de mCherry para permitir a quantificação de ratiometric de GCaMP5 mudanças de fluorescência e simplifica a medição e a descoberta do objeto. Nota: GCaMP5:mCherry ratiometric imagem corrige para flutuações na fluorescência GCaMP5 que resultam em mudanças no movimento de foco e animal, não reais mudanças no intracelular Ca2 +.</li>
	<li>Injetar GCaMP5 - e mCherry-expressando plasmídeos juntamente com o plasmídeo de marcador de resgate visível pL15EK as gônadas de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animais mutantes e recuperar não-vum lin-15(+) animais expressando GCaMP5 e mCherry de um transgene alta-cópia20,21,22. Use o fundo mutante lite-1 para reduzir o comportamento de evitação de luz azul23,24.</li>
	<li>Integre os transgenes de cromossomos para reduzir mosaicismo e simplificar a geração de cepas mutantes composto25. Nota: A tensão de LX2004 descrita aqui carrega um transgene integrado de alta-cópia que expressa a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 (ver Tabela de materiais)26,27, 28 , 29. o promotor de PNL-3 foi encontrado a expressão forte de carro nos HSNs de tarde L4 e animais adultos sem causar defeitos significativos no desenvolvimento de HSN ou comportamento de oviposição em comparação com outros promotores testado (e.g.,tph-1, EGL-6e unc-86). Esta estirpe e outros que expressam a GCaMP5 e mCherry no cabo ventral (VC) neurônios, músculos vulvares e células neuroendócrinas uv1 estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis e detalhes de sua construção foram descritas 27.</li>
	<li>Aplicar OP50 escolher alimentar bacteriana de uma placa de ágar NGM semeada no fundo de um verme de platina e usá-lo para transferir ~ 20 animais L4 LX2004 tarde que expressam a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 . Certifique-se que a vulva em desenvolvimento aparece em um estereomicroscópio como uma mancha clara escura rodeada por uma lua crescente branca. Incube os animais a 20 ° C por 24-40 h.</li>
	<li>Após a incubação, aplicar OP50 para a escolha e transferência ~ 3 dos vermes para uma placa NGM não-semeada, deixando uma pequena quantidade de comida por trás para os vermes que alimentam-se durante a imagem latente. Certifique-se de alimentos suficientes, como também pouca comida bacteriana incentivará os vermes a vaguear longe do centro da placa, enquanto muita comida aumentará a fluorescência de fundo e causar hipóxia.</li>
	<li>Use uma espátula plana arredondada para cortar um ~ 20 mm x 20 mm bolão da placa carregando os vermes e transferir o bloco para baixo para o centro de uma lamela limpa 24 x 60 mm #1.5 (Figura 1). Inicie a aplicação de um lado para evitar bolhas sendo presa sob a lamela e interferentes com imagem latente. Uma lamela 22 x 22 mm #1 para o topo do parte para reduzir a degola e evaporação.</li>
</ol>2. hardware e instalação de instrumentação
<ol><li>Coloque o encenado, vermes transgênicos para o palco de um microscópio invertido com um ≥ 0,7 numérica abertura plano-Apochromat 20 x estágio objetivo, motorizado de XY controlável com um joystick, um divisor de imagem e fluorescência filtros para GCaMP5 simultânea e mCherry de excitação e emissão, câmeras de infravermelho e fluorescência brightfield de imagem e um sistema de iluminação triggerable do diodo emissor de luz (LED)(Figura 2). Nota: Um divisor de feixe de 80/20 envia 80% do sinal de imagem da câmera de fluorescência e 20% para a câmara de brightfield. Um microscópio vertical também pode ser usado, mas o pedaço NGM deve ser colocado entre uma lâmina de vidro e a lamela grande neste caso.<ol>
<li>Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem latente. Quando um animal é selecionado, deslize o filtro infravermelho no lugar acima do condensador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lógica do transistor-transistor (TTL) desencadeia<ol>
<li>Conecte cabos coaxiais de cada uma as três linhas de saída do TTL gatilho da câmera de fluorescência. Conecte a primeira saída à entrada BNC #3 do sistema de iluminação LED.</li>
		<li>Conecte a saída segunda a um adaptador de BNC 'banana' com verde e marrons fios do conector 8 pinos GPIO GPIO correndo entrada #3 (pino 4) e terra (pino 5) da câmera infravermelha, respectivamente.</li>
		<li>Conecte a saída de terceira para um adaptador de 'banana' BNC com fios de jumper, correndo para a entrada digital #8 e terra no dispositivo de aquisição digital (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispositivo de aquisição digital (DAQ)<ol>
<li>Conecte a placa do microcontrolador DAQ (ver Tabela de materiais) para o PC através de um cabo USB. Atualize o firmware com o padrão Firmata protocolo (consulte Tabela de materiais) e configurar a porta USB para se comunicar em baud 57600.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diodos emissores de luz<ol>
<li>Executar o software de controlador de LED (veja a Tabela de materiais). Alterne para o modo de gatilho de 'Continuous' para 'Gated' e selecione canal gatilho 3' para ambos os LEDs 470 e 590 nm.</li>
		<li>Ligue e digite LED de potência de cada LED (por exemplo, conjunto a 470 nm LED para 20% e a 590 nm LED 40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o script 'XY-fase-final' em Bonsai (ver Tabela de materiais) de comunicação serial-palco30. Clique no nó cinzento 'CsvWriter' e selecione uma pasta para salvar o gravado X e Y palco informações (Figura 3). Pressione a seta verde da barra de ferramentas para inicializar o DAQ. Nota: O script começa a gravação a posição X e Y do palco, quando a câmara de fluorescência envia um sinal TTL. Este script produz quatro colunas de dados: frame número, X posição (µm), posição Y (µm) e o intervalo entre quadros (s).</li>
	<li>A câmera infravermelha, software de gravação (ver Tabela de materiais) em 'Modos de vídeo personalizado', selecione "Modo 1" (binning 2x2; 1.024 x 1.024 pixels), e "Pixel formato Raw 8". Sob ' gatilho / Strobe', defina a linha de entrada de gatilho (GPIO) "3", a polaridade de "Alta", o 'modo' para "14". Alternar 'Habilitar' parar aquisição de quadro até um sinal de gatilho TTL é recebido.<ol>
<li>Deixando a janela aberta, clique no botão "Record" vermelho na barra de ferramentas modo de exibição de câmera principal. Selecione a pasta para sequências de imagem ser salvo. Selecione o modo de gravação de 'Tampão' e 'Imagens' de salvar em formato JPEG. Clique em "Iniciar gravação" para inicializar a aquisição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Câmera e imagem divisor de fluorescência Nota: Os canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry devem ser recolhidos simultaneamente para garantir o registro de imagem apropriada para quantificação de ratiometric. Um divisor de imagem permite a aquisição de dois canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry em um sensor.<ol>
<li>Na aba 'Captura' do software de aquisição de imagem tempo de exposição definido (ver Tabela de materiais), a 10 ms, binning 4x, e profundidade de imagem de 16 bits. Selecione um subarray câmera centrada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura. Clique em 'Mostrar opções de gatilho de saída' e definir todos os gatilhos para 'Positivo'. Nota: O DAQ ocasionalmente pode perder TTL disparadores se eles são 10 ms ou menos.</li>
		<li>Certifique-se de que 'Gatilho 1' e 'Gatilho 2' estão definido como 'Exposição' enquanto 'Gatilho 3' é definida como 'Programável' com um 'período' de 25 MS. sob a aba 'Sequência', selecione 'Time Lapse' com um 'campo Delay1' de 50 ms para coletar imagens em 20 Hz. Select 'Salve Buffer temporário.'</li>
	</ol>
</li>
	<li>PGTO ganhar e intensidade de laser durante a imagem latente confocal canal três<ol>
<li>Defina o ganho de PGTO para a fluorescência de fundo está em um nível acima do mínimo (nível de preto). Aumente a potência de laser (verde) de nm 561 até um único saturado em 12 bits ou 16 bits de pixel é observado no terminal pré-sináptica no canal mCherry.</li>
		<li>Ajuste a intensidade de laser (azul) 488 nm para que GCaMP5 fluorescência é apenas visível no terminal pré-sináptica acima do fundo. Essa configuração baixa impede a saturação dos pixels GCaMP5 quando a fluorescência aumenta em resposta a transientes de Ca2 + fortes. Abra o pinhole confocal todo o caminho para maximizar a captura de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ratiometric Ca2 + imagens e gravação de comportamento
<ol><li>Na guia 'Sequência' do software de aquisição de fluorescência, clique em "Start" para começar a gravação. Rastrear o verme com o joystick, mantendo a célula (s) e sinapses de interesse em foco e no centro do campo de visão (FOV). Clique no botão 'Stats' na janela de histograma para mostrar estatísticas de pixel de cada canal.</li>
	<li>Ajuste a potência do LED para garantir uma fluorescência máxima mCherry de single-pixel no terminal pré-sináptica de ≥ 8.000 contagens (~ 4.000 photoelectrons), dando um ~ 12 bits intervalo dinâmico acima de fundo (~ 100 photoelectrons). Sinais de GCaMP5 no terminal pré-sináptica durante o descanso (baixo) Ca2 + deve ser em torno de ~ 2.500 conta - apenas visível acima do fundo.</li>
	<li>Gravar até atingir uma postura estado ativo; Geralmente, isso ocorre a cada 20-30 min em um verme selvagem-tipo7. Salve um subconjunto de 10 min (12.001 frames), 6.000 quadros antes e após o primeiro evento de postura (quadro 6.001). Certifique-se de manter o mesmo subconjunto de brightfield imagens de worm comportamento e momentos de posição XY, ou a perfeita sincronização de fluxos de dados serão perdida.</li>
	<li>Usar o ImageJ e o plugin BioFormats (consulte a Tabela de materiais) para converter sequências de imagem para o formato de imagem padrão Cytometry (ICS) assim pode ser importado para o software de quantificação de Ratiometric.</li>
</ol>4. segmentação e análise quantitativa de imagem
<ol><li>Importar sequências de imagem para o software de quantificação de Ratiometric (ver Tabela de materiais). Clique em 'Auto contraste' no menu 'Ferramentas' e ajuste o contraste de cada canal para estabelecer adequado preto (~ 1.800) e branco níveis (10.000). Selecione 'Alterar cores...' no menu ' ferramentas ' para confirmar que mCherry e atribuições de cor GCaMP5 canal estão corretas (Figura 4A - C).<ol>
<li>Clique com o botão direito sobre a série de tempo na aba 'Sequência' e configurá-lo para 20 frames/s e 1,25 µm/pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione 'Ratio' no menu 'Ferramentas' e selecione "GCaMP5" para 'Canal' e "mCherry" para 'Canal B'. Clique em "Calcular" ao lado de 'Limite' para subtrair o fundo de cada sequência de imagens. Selecione "Aplicar um arco-íris LUT para o canal de relação". Nota: Para uma gravação com uma relação de base média de 0,3 (baixa Ca2 +) e uma proporção máxima de 2-3 (alta Ca2 +), uma tabela de pesquisa adequado seria de 0 (azul) 1 (vermelho).</li>
	<li>Gere um canal de intensidade modulada proporção usando o canal de mCherry (Figura 4-D). O canal de intensidade modulada Ratio é uma imagem de milhões-de-cores onde a cor da relação é mapeada para o brilho do canal mCherry.</li>
	<li>Na guia 'Medidas', crie um protocolo de pesquisa de objeto, arrastando a ferramenta 'Encontrar objetos usando intensidade' no painel 'Protocolo'. Clique a 'engrenagem' para definir a janela de mCherry valores de intensidade e encontrar objetos.<ol>
<li>Selecione a intensidade valores ≥ 2 desvios padrão (SD) acima do plano de fundo (por exemplo, o limite inferior de ~ 2.500, limite máximo de 65.535). Verifique se o terminus pré-sináptica é detectado e que 'atualizar automaticamente feedback' é selecionada no menu de medições. Nota: O software também pode identificar objetos pelo seu desvio-padrão de fundo usando um protocolo relacionado 'SD intensidade.' No entanto, se um objeto especialmente brilhante entra o FOV, drasticamente muda a intensidade média durante esses momentos, que afectam as cortes de intensidade usados para localizar o HSN. Esta variabilidade não ocorrerá se os valores de intensidade crua são usados para localizar objetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione filtros adicionais visando apenas o canal de mCherry (tamanho, intensidade de Max, etc) se necessário excluir objetos indesejáveis como cabeça, cauda e estripá-fluorescência. Selecione 'Fazer medição Item' no menu de medições e escolha "Todos os momentos." Nota: Isto irá executar o protocolo, escrevendo todas as medições para um arquivo de valores separados por vírgula (. csv) que deve ser exportado usando o comando 'Exportar' no menu arquivo.</li>
	<li>Abra o arquivo exported.csv e copie o Commit, área (µm2), média (relação de canal), centroide X (µm) e dados de centroide Y (µm) em uma nova folha. Exporte arquivo de a.csv sem cabeçalhos de coluna. O software de quantificação de Ratiometric pode classificar uma célula de interesse, como um ou mais objetos por commit.<ol>
<li>Para recombinar esses objetos, use um script personalizado 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. Nota: O script também identifica Ca2 + (ratio) picos nos dados e salva o arquivo de a.csv de seus momentos, amplitudes de pico e largura dos picos. Ele também gera arquivos postscript para os traços de proporção de matérias-primas e anotado. Com esta informação, devem ser determinadas a amplitude de Ca2 + transitória e intervalo inter transitório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione a saída de X e Y valores de centroide de cada objeto de fluorescência para os valores X e Y, gravados pelo script XY-estágio de Bonsai. Use a posição líquida de XY para gerar um rastreamento de locomoção worm e para calcular o deslocamento da célula e velocidade que acompanham o comportamento de diferentes Estados31.</li>
	<li>Importe as imagens gravadas brightfield ImageJ como uma pilha virtual. Anote eventos de postura e outros comportamentos. Compare o calendário destes eventos de Ca2 + picos do rastreamento de relação.</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Transgenes:
Porque mCherry expressão foi melhorada através da inserção de códon-otimização e intrão (e mais disponível GCaMP repórteres não têm), injetar ~ 4 x a quantidade de GCaMP5-expressando de shRNA para assegurar níveis comparáveis de fluorescência GCaMP5 durante forte Ca 2 + transientes. Resgate da mutação lin-15(n765ts) permite a recuperação fácil dos animais transgénicos com efeitos mínimos na postura e outros comportamentos35. Transgenes deve ser integrado para garantir condições entre diferentes animais25de imagem e expressão uniforme. Marcadores selecionáveis, incluindo a resistência aos antibióticos36,37 e resgate de armas letais sensíveis à temperatura38 também devem funcionar, mas, porque os animais não-transgênicos são mortos, confirmação da integração do transgene e homozigotia é mais difícil comparado com marcadores que apresentam um fenótipo visível de25. Marcadores dominantes que perturbam o normal locomoção e diminuem a aptidão, tais como rol-6(dm), devem ser evitada39. Imagem latente na lite-1 fundo mutante é essencial para reduzir a fuga de luz azul respostas durante a imagem23,40,41. Mutação adicional de gur-3, que atua paralelamente à lite-1, pode minimizar ainda mais comportamento residual e alterações fisiológicas causadas pela luz azul42. Convenientemente, gur-3, 1-litee lin-15 estão todos situados na metade direita do cromossomo X, que deve simplificar a construção de novas estirpes de Ca2 + imagens e experiências optogenetic.
Porque os tempos de exposição são curtos e imagens são coletadas em 20 Hz, sinais GCaMP5 e mCherry devem ser brilhantes. A explicação mais provável para barulhento Ca2 + gravações é fluorescência fraca causada pela expressão repórter fraco. Os promotores também devem ser razoavelmente específicos para a região a ser fotografada. Porque o corpo celular HSN e sinapses para os músculos vulvares são no centro do corpo, expressão adicional do promotor de PNL-3 na cabeça e cauda é tipicamente fora do campo de visão e podem ser excluído usando filtros adicionais na Software de quantificação de Ratiometric. Para garantir que observado alterações no resultado de fluorescência GCaMP5 de mudanças reais no intracelular Ca2 +, controle transgenes expressando GFP em vez de GCaMP5 devem ser preparadas de forma independente e analisados26. Mais recente Ca2 + repórteres com diferentes Ca2 + sensibilidades, cinética, cores e expandiram a escolha das ferramentas disponíveis de imagem, mas cada novo repórter deve ser validado usando o Ca2 +-variante fluorescente insensível14 ,16.
Mídia:
Placas NGM para a imagem latente devem ser preparadas com ágar de alta qualidade. Ágar de qualidade inferior não irá dissolver completamente após a autoclavagem, deixando pequenas partículas essa dispersão de luz durante a imagem latente e aumento da fluorescência, plano de fundo. Biologia molecular agarose de grau pode ser usado em vez disso, mas a quantidade adicionada deve ser reduzida para manter a firmeza de placa equivalente.
Comparações com outros métodos de montagem:
Abordagens anteriores, a atividade de imagem no circuito de comportamento de oviposição utilizaram vermes imobilizadas com cola para uma almofada de agarose. Sob estas condições, atividade de circuito e postura de comportamento não é favorecidas sem redução em meios de cultura osmolaridade8,10,44,45. Recentes sugerem que vários comportamentos de worm são modulados por estado de locomoção, levantando questões sobre a relação da atividade das células observadas em animais imobilizados ao observado em livremente, comportando-se animais. Recentemente mostramos que a atividade de circuito de postura é inesperadamente progressivamente com locomoção26,27. Da mesma forma, compartimentada Ca2 + sinalização no interneurônio RIA integra a atividade de neurônios sensoriais e neurônios cabeça durante movimentos46de forrageamento. Comportamento de defecação é também acompanhado de uma mudança de precisa e estereotipada de locomoção que permite que os animais se afastar de seu lugar de forrageio antes de expelir resíduos47. Juntos, estes resultados sugerem que a breves gravações de atividade de circuito de animais imobilizados podem ser fundamentalmente diferentes dos obtidos em livremente, comportando-se animais.
Apesar de ser directamente por baixo de uma lamela, comportamento do worm é semelhante ao visto em placas padrão de NGM. Ovos descontraídos vai continuar a eclodir, e a pequena quantidade de comida depositada permite que as larvas L1 para se transformar em adultos (dados não mostrados). O tamanho de bloco de ágar grande permite a troca gasosa razoável e resiste a desidratação, embora muita comida aumentará a fluorescência de fundo. Enquanto este método funciona melhor para adultos, a técnica também pode ser usado para animais de L4 de imagem. No entanto, a espessura da camada aquosa entre o bloco e a lamela é tal que larvas menores têm dificuldade rastejando e muitas vezes podem ficar preso na sequência de um adulto em movimento.
Uma limitação dessa técnica de montagem é que a estimulação mecânica ou química direta para regiões precisas do corpo é difícil. Desenvolvimentos recentes em técnicas de iluminação modelado permitem a excitação separada da cabeça ou cauda-expresso opsins microbianas com iluminação separada e detecção de fluorescência GCaMP/mCherry da número48,49. Como resultado, pode ser possível superar este problema usando abordagens optogenetic.
Comparações com outro Ca 2 + Abordagens de imagem:
Este método funciona muito bem para gravar alterações no citoplasmática Ca2 + do único, resolvidas as células e as suas regiões sinápticas. Imagem em tempo real, volumétrica de neurônios na cabeça foi recentemente conseguida usando a posição do núcleo de células para a identificação da célula e para dosar alterações no auxílio de cálcio50,,51,52. A relação entre nuclear e sináptica Ca2 + permanece obscura. Nossos dados sugerem que as mudanças mais visíveis no HSN intracelular Ca2 + ocorrem na termini pré-sináptica longe a soma da célula (Figura 4). A termini pré-sináptica do HSN e os neurônios VC é incorporados os músculos vulvares pós-sináptica26. Não está claro se haveria resolução suficiente na dimensão Z mesmo com girando o disco ou técnicas de folha de luz de atribuem pré-sináptica Ca2 + sinais de células específicas, sem depender de alguma forma somático cálcio para identificação de célula . Usando as técnicas descritas aqui, cada 10 min, dois canais de gravação com 12.001 256x256 pixel 16-bit TIFF imagens é ~ 4 GB. Relação proporção e intensidade modulada canais o dobro do tamanho do arquivo para ~ 8 GB. Um experimento típico de gravação 10 animais de cada um dos dois genótipos (tipo selvagem e experimentais) gera cerca de 150 GB de dados primários e requer 20 h para coletar e analisar. Análises volumétrica com 10 fatias de Z por commit exigiria uma ordem de magnitude mais dados e tempo analítico, explicando por que tão poucos tais estudos foram concluídos.
Ferragem:
Podemos gravar e analisar sequências de imagem com alto desempenho, estações de trabalho dual processador placas de vídeo (por exemplo, jogos), 64 GB de RAM, e drives de estado sólido de alta performance (ver Tabela de materiais). Dados devem ser armazenados na rede matriz redundante de discos independentes (RAID) e backup para a nuvem em um centro de dados off-site.
Recomendamos que usando de alta potência colimado LEDs para a excitação da fluorescência pulsado sobre iodetos metálicos ou fontes de luz à base de mercúrio. Vários sistemas de LED multi cores disponíveis comercialmente estão disponíveis. Enquanto alguns desses sistemas de LED têm um custo inicial mais alto, eles têm uma longa vida (> 20.000 h), podem simultaneamente excitar quatro ou mais diferentes fluorophores e oferecem controle temporal preciso, usando um serial e/ou interface TTL com baixa latência (10-300 µs alternar tempo). Desencadeando garante que a amostra só acende quando na verdade estão sendo recolhidos. Normalmente usamos uma exposição de 10 ms cada 50 ms (20% taxa de serviço). Isso reduz a fototoxicidade e borrão de movimento durante a captura de imagem, como relatado anteriormente,43.
Utilizamos câmeras de sCMOS pela sua velocidade e grande matriz de pixels pequenos, sensíveis. Uma câmera do CCD-EM é uma alternativa mais cara, mas efeitos de 'flor' podem resultar em capturados photoelectrons derramando em pixels adjacentes. Nova sCMOS back-iluminado câmeras têm fotossensibilidade semelhante da EM-CCDs a custo significativamente reduzido. De qualquer maneira que sensor é usado, os canais GCaMP5 e mCherry devem ser obtidos simultaneamente. Captura sequencial em mover vermes vai levar a Mal registradas imagens impróprias para quantificação de ratiometric. Imagem de canal duplo pode ser realizada em uma única câmera após a divisão de canais usando um divisor de imagem (Figura 2) ou usando duas câmeras idênticas. Sobre imagens de 8 bits para quantificação exacta ratiometric, recomenda-se a gama dinâmica das imagens de 16 bits. Para imagens de brightfield do comportamento de worm, capturamos usando uma câmera de 1 pol. 4.1 MP infravermelho USB3 para capturar grandes sequências de imagem de 8 bits 1.024 x 1.024 binned de 2 x 2 após a compressão JPEG. O FOV maior disponível em modelos mais novos do microscópio permite um verme adulto ser visualizado em 20 x depois x 0.63 demagnification com apenas leve vinheta (Figura 4E).
Recomendamos usar os sinais de tensão padrão TTL para sincronizar a iluminação e a captura de quadro. Por latências potenciais em diferentes softwares, recomendamos aos usuários configurar a câmara de fluorescência com saídas de gatilho como mestre com saídas TTL, deixando todos os outros dispositivos. Desta forma, informações de posição brightfield e fase serão coletadas para cada medição de Ca2 + .
Fenda - ou ressonantes microscópios confocal ponto-digitalização, tipicamente encontrados em instalações confocal compartilhadas também dar excelente desempenho durante a ratiometric Ca2 + imagem latente. Tais instrumentos podem ser usados para capturar dois ou mais canais de fluorescência juntamente com brightfield24. Neste caso, o pinhole confocal deve ser aberto para seu diâmetro máximo, e um detector espectral deve ser usado para separar os sinais infravermelhos brightfield, mCherry e GCaMP5. Isso maximiza a luz coleção de uma espessa (~ 20 µm) fatia ao ainda permitir a rejeição da fluorescência fora de foco. Uma desvantagem é o FOV menor e mais restrições para personalização de hardware e software.
Software:
A maioria dos fabricantes do navio e instalar suas câmeras e microscópios com software proprietário, incluindo configuração de desencadeamento de entradas e saídas. Podem variar os recursos e desempenho deste software durante a gravação. Porque, movendo-se rápido vermes pode ser um desafio para rastrear, imagem exibir durante a gravação deve ser suave e estável a 20 Hz. Para melhorar o desempenho, sequências de imagem podem ser temporariamente salva na memória RAM com subconjuntos comportamentalmente relevantes, salvos no final do experimento. Esses arquivos de sequência de dois canais de imagem podem ser convertidos para o formato de imagem Cytometry padrão aberto (ICS) para importar para o software de quantificação de Ratiometric. OME-TIFF é um formato de imagem aberto mais recente, embora diferentes instalações podem ser incapazes de salvar sequências de imagem TIFF maior que 4 GB.
Uma característica fundamental do pipeline de quantificação é a geração do canal de relação e, em seguida, um procedimento de segmentação de imagem imparcial usando mCherry fluorescência para encontrar células de interesse. De cada objeto encontrado, o tamanho do objeto, posição do centroide XY e o mínimo, quer dizer, e calculam-se valores de intensidade de fluorescência máxima para cada canal (incluindo o canal de relação). Juntos, esses valores são usados para dosar alterações intracelulares Ca2 + em cada commit na gravação. Medições de objeto para cada commit são então exportadas como arquivo a.csv para análises subsequentes.
Uma limitação importante do protocolo descrito aqui é a dependência de mover os dados em diferentes formas, através de uma colcha de retalhos de produtos de software. Uma irritação adicional é que algum do software aberto e livre, enquanto os outros estão fechados, caro e desigualmente atualizado. Uma melhoria principal seria usar ou desenvolver uma parte de software (idealmente aberto) que fornece níveis semelhantes de desempenho e facilidade de uso de aquisição para análise. Conforme observado acima, análise ratiometric dobra o tamanho do arquivo e o tempo necessário para realizar um experimento. Geração de condutores de câmera que podem ser integrados em estruturas personalizável pelo usuário como Bonsai permitiria imagens e outros fluxos de dados sejam coletados e analisados em tempo real, melhora significativamente a taxa de transferência.
Perspectivas futuras:
Enquanto nós normalmente rastrear movimentos de worm manualmente, rastreamento de centroide worm detectado em gravações de infravermelho brilhante - ou campo escuro deve permitir para nós que fornecem loop fechado de ajuste da posição de palco e automatizados de processamento de imagem adicional rastreamento (Figura 3 e dados não mostrados). A maioria das gravações de fluorescência obtidos com este método é escuro e desprovida de biologicamente interessantes dados. No sensor ou em tempo real pós-aquisição processamento de imagem técnicas que sequências de imagem para objetos relevantes de culturas permitiria para aumento de resolução espacial e agilizar o pipeline de análise de dados, particularmente se Z-fatias adicionais são coletadas para cada Commit para visualizar a atividade dentro de todas as células pré e pós-sinápticas no circuito.

Um objetivo central da neurociência é compreender como os neurônios se comunicam em circuitos de comportamento animal unidade. Circuitos neurais integram uma gama de diversas pistas sensoriais a fim de mudar atividade do circuito, assim conduzir mudanças comportamentais necessárias para os animais respondem a seus ambientes. O nemátodo do Pinheiro, c. elegans, tem um sistema nervoso simples com 302 neurônios cujas conexões sinápticas têm sido completamente mapeado1. Além disso, os genes que codificam para proteínas envolvidas na neurotransmissão são altamente conservados entre c. elegans e mamíferos2. Apesar da simplicidade anatômica de seu sistema nervoso, ele exibe um repertório complexo de comportamentos conservados, fornecendo uma plataforma fértil para compreender como os neurônios regulam o comportamento3.
C. elegans é passível da aplicação de uma vasta gama de abordagens como a manipulação genética, célula ablação a laser, técnicas eletrofisiológicas, bem como na vivo óptico de imagem de4,5. Estudos recentes produziram mapas detalhados do neurotransmissor importante sinalização sistemas em c. elegans , incluindo o colinérgicos e redes neuronais gabaérgica. Estes estudos, juntamente com estudos em andamento para mapear a expressão dos receptores de proteína G-acoplado todos neuronais Coloque este modelo em uma posição única para alavancar estrutural altamente detalhada e mapas de conectividade neuronal funcional para entender completamente como esses sinal de neurotransmissores diferentes através de receptores diferentes e escalas de tempo diferentes aspectos de unidade de comportamento animal.
A fim de estudar os padrões de actividade neuronal dinâmico em qualquer sistema, um pré-requisito essencial é desenvolver metodologias robustas para registrar a atividade nos neurônios individuais ou circuitos inteiras durante comportamentos. Especialmente importante é a acessibilidade de tais abordagens óticas para visualizar a atividade pré-sináptica que impulsiona a fusão de vesículas sinápticas. Rápido e altamente sensíveis repórteres fluorescentes de intracelular Ca2 +, juntamente com a disponibilidade crescente de fotodetectores sensível, revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica em animais acordados, vivas durante o comportamento. Porque um resultado importante da atividade elétrica sináptica é regular os canais de Ca2 + , mudanças no intracelular Ca2 + são pensadas para fielmente comportamentalmente relevantes alterações no relatório na atividade das células.
Neste estudo, apresentamos uma abordagem para executar ratiometric Ca2 + imagem do HSN motor neurônios serotoninérgicos que promovem o comportamento de oviposição em c. elegans6,7. Esta abordagem baseia-se esforços anteriores para visualizar o Ca2 + atividade em c. elegans e o circuito de postura durante comportamento5,8,9,10,11 . O método permite simultaneamente correlacionar as mudanças observadas na atividade celular/circuito com eventos de postura, bem como alterações no estado de locomoção animal. Embora nós usamos esta abordagem para estudar a atividade em vermes adultos, trabalho não publicado de nosso laboratório mostra que essa abordagem pode ser estendida para animais juvenis na quarta larval (L4) fase também. É provável que a atividade de outros neurônios de c. elegans que funcionam em circuitos distintos e comportamentos deve ser da mesma forma acessível com esta técnica. Outros recentemente desenvolvido rápido Ca2 + indicadores com disjunto espectros de emissão12,13,14,15,16, ferramentas optogenetic17 e geneticamente codificado ópticas indicadores de membrana de tensão18, deverá permitir-nos realizar penetrantes 'all-optical' investigações como alterações na atividade de circuito neural dirige Estados de comportamento distinto.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; growth, cultivation, and mounting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; bacterial strain, OP50</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>OP50</td><td>Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5+mCherry worm strain</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>LX2004</td><td>Integrated transgene using &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.&amp;nbsp; Full genotype:&amp;nbsp;&lt;em&gt; vsIs183&lt;/em&gt; &lt;em&gt;[nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3&#039;UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3&#039;UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; X</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lite-1(ce314), lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; mutant strain for transgene preparation</td><td>author</td><td>LX1832</td><td>Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK&lt;em&gt; lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; rescue plasmid. Also bears the linked&lt;em&gt; lite-1(ce314)&lt;/em&gt; mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request</td></tr><tr><td>pL15EK&lt;em&gt; lin-15a/b&lt;/em&gt; genomic rescue plasmid</td><td>author</td><td>pL15EK</td><td>Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 &lt;em&gt;lite-1(ce314)&lt;/em&gt;,&lt;em&gt; lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; X strain. Available from author by request</td></tr><tr><td>pKMC299 plasmid</td><td>author</td><td>pKMC299</td><td>Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; promoter. Has&lt;em&gt; nlp-3&lt;/em&gt; 3&#039; untranslated region</td></tr><tr><td>pKMC300 plasmid</td><td>author</td><td>pKMC300</td><td>Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; promoter. Has &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; 3&#039; untranslated region</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-164&amp;nbsp;</td><td>For preparation of NGM plates</td></tr><tr><td>24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>Cover glass through which worms are imaged</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glasses, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Cover glass that covers the top of the agar chunk</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with transmitted light base</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting</td></tr><tr><td>Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>For worm transfer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Calcium imaging microscope&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration air table</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>Micro-g&#039; Lab Table 30&quot; x 48&quot; anti-vibration table with 4&quot; CleanTop M6 on 25mm top</td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 inverted microscope</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3 position)</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera</td></tr><tr><td>Tilt Back Illumination Carrier</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>For infrared/behavior imaging</td></tr><tr><td>Lamphousing 12V/100W w/ Collector</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>For infrared/behavior imaging</td></tr><tr><td>Halogen lamp 12V/100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter</td></tr><tr><td>32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior</td></tr><tr><td>6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized</td><td>Zeiss</td><td>424244-0000-000</td><td>For infrared/behavior imaging</td></tr><tr><td>Condenser &amp;amp; Shutter</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>For infrared/behavior imaging</td></tr><tr><td>Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>For infrared/behavior imaging</td></tr><tr><td>Eyepiece 10x, 23mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>For worm localization on the agar chunk</td></tr><tr><td>C-Mount Adapter 2/3&quot; 0.63x demagnifier</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>Mount for infrared CMOS camera</td></tr><tr><td>CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1&quot; sensor)</td><td>FLIR (formerly Point Grey Research)</td><td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Camera for brightfield imaging</td></tr><tr><td>USB 3.0 Host Controller Card</td><td>FLIR (formerly Point Grey Research)</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4 Ports</td></tr><tr><td>8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector&amp;nbsp;</td><td>FLIR (formerly Point Grey Research)</td><td>ACC-01-3000</td><td>Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance</td></tr><tr><td>6-cube Reflector Turret, Motorized</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>For fluorescence imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence Light Train, Motorized</td><td>Zeiss</td><td>423607-0000-000</td><td>For fluorescence imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence Shutter</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>For fluorescence imaging</td></tr><tr><td>GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope)</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging</td></tr><tr><td>LED illumination system</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination</td></tr><tr><td>GFP LED module (470 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation</td></tr><tr><td>mCherry LED module (590 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation</td></tr><tr><td>Iris stop slider for incident-light equipment</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view</td></tr><tr><td>C-Mount Adapter 1&quot; 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera</td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras</td></tr><tr><td>GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter)</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals</td></tr><tr><td>GFP emission filter (image splitter)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>Capturing GCaMP5 fluorescence</td></tr><tr><td>mCherry/ emission filter (image splitter)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging</td></tr><tr><td>sCMOS camera for fluorescence (1&quot; sensor)</td><td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter</td></tr><tr><td>Motorized XY Stage</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user</td><td>SCAN IM 130 x 100</td><td>Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2&amp;micro;m per step&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>XY Stage controller with joystick</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, XY joystick</td><td>Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud</td></tr><tr><td>Digital Acquisition board (DAQ)</td><td>Arduino</td><td>Uno</td><td>Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud</td></tr><tr><td>BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft</td><td>Hosa Technology</td><td>HOBB6</td><td>BNC connectors for TTL triggering</td></tr><tr><td>Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8&quot;)</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>To connect the fluorescence camera trigger outputs</td></tr><tr><td>BNC turn head adapter</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>BNC to Banana Plug Adapter (4mm)</td></tr><tr><td>BNC female to female connector</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug</td></tr><tr><td>Solderless flexible breadboard jumper wires</td><td>Z&amp;amp;T</td><td>GK1212827</td><td>To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.&amp;nbsp; Male to male.</td></tr><tr><td>High performace workstation</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives</td></tr><tr><td>M.2 Solid state drive</td><td>Samsung</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>High-speed streaming and analysis of image data</td></tr><tr><td>M.2 Solid state drive adapter&amp;nbsp;for workstations</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter</td></tr><tr><td>Network attached storage</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td><td>Imaging data storage and analysis</td></tr><tr><td>Hard disk drives</td><td>Western Digital</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Acquisition</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps</td></tr><tr><td>Brightfield Acquisition</td><td>FLIR (formerly Point Grey Research)</td><td>Flycapture</td><td>Recording of brightfield JPEG image sequences</td></tr><tr><td>Stage Serial Port Reader</td><td>Bonsai</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>Facilitates tracking of worms during behavior</td></tr><tr><td>LED controller software</td><td>Zeiss</td><td>Micro Toolbox Test 2011</td><td>To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit</td></tr><tr><td>ImageJ&amp;nbsp;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>&amp;nbsp;2002984-001-000001</td><td>For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis</td></tr><tr><td>Peak Finding</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>Script used for Ratio peak feature calculations</td></tr><tr><td>Ratiometric Quantitation</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Scripts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsai</td><td>Bonsai</td><td>TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader</td><td>Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).&amp;nbsp; X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

Tornou-se cada vez mais claro que atividade de circuito neural em se comportando animais difere substancialmente que visto em animais anestesiados ou imobilizados. Altamente sensíveis, geneticamente codificados repórteres fluorescentes de Ca2 + revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica usando abordagens ópticas não-invasiva em comportamento de animais. Quando combinado com genética e optogenetic técnicas, os mecanismos moleculares que modulam a atividade celular e do circuito durante o comportamento de diferente Estados-Membros pode ser identificados.
Aqui descrevemos os métodos para a ratiometric Ca2 + imagem latente de neurônios único em livremente se comportando vermes Caenorhabditis elegans . Podemos demonstrar uma técnica de montagem simples que gentilmente vermes de sobreposições, crescendo em um ágar padrão de nematódeo crescimento Media (NGM) bloqueiam com uma lamela de vidro, permitindo animais para ser gravado em alta resolução durante o movimento irrestrito e comportamento. Com essa técnica, nós usamos sensível Ca2 + repórter GCaMP5 para gravar as alterações no intracelular Ca2 + nos neurônios específico serotoninérgico hermafrodita (HSNs) como eles conduzem o comportamento de oviposição. Expressando co mCherry, uma Ca2 +-proteína fluorescente insensível, podemos rastrear a posição da HSN dentro ~ 1 µm e correto para flutuações na fluorescência causadas por mudanças no foco ou movimento. Imagem de infravermelho, simultânea brightfield permite gravação de comportamento e rastreamento de animais usando um palco motorizado. Integrando essas técnicas microscópicas e fluxos de dados, podemos gravar a atividade de Ca2 + no circuito de postura de c. elegans como progride entre Estados de comportamento ativo e inativo por dezenas de minutos.

A técnica de montagem simples descrita aqui (Figura 1) provoca mínimas alterações no ambiente da cultura de L4 e adulto c. elegans , permitindo alta resolução gravação em comportamento de animais através de uma lamela de vidro (Figura 4). Sincronização de fontes de luz LED, controladores de fase e exposições de câmera permite para aquisição de dados de vários fluxos a 20 frames/s para cima de 1 h. intermediário ampliação (20 x) com objectivos de abertura numérica elevada (0,7-0,8) fornece boa resolução espacial da região sináptica no circuito de comportamento de postura, mesmo com 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Aquisição simultânea de sinais de fluorescência GCaMP5 e mCherry (Figura 4A, B) é usada para gerar um canal de relação pixel por pixel que compensa as alterações na circulação de animais e foco (Figura 4-D). O terminus pré-sináptica HSN é tão grande como muitos corpos celulares neuronais, em c. eleganse mudanças na pré-sináptica HSN Ca2 + podem ser visualizado claramente. O FOV grande da câmera infravermelho brightfield permite que o worm ser manualmente controlados durante a gravação (Figura 4E). Para cada animal, mudanças no intracelular Ca2 + podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes na imagem brightfield, incluindo o lançamento de ovo e as alterações na locomoção (Figura 4E).
Quantificação de HSN Ca2 + e velocidade confirma que vermes mudam sua locomoção como eles transição para comportamento de oviposição. Existem diferenças significativas na velocidade de verme antes, durante e após o estado ativo de postura (Figura 5A). Isto não é causado pelo ruído inerente para a imagem ou o sistema de rastreamento. Zoom em uma postura evento, observamos uma forte mudança na fluorescência de GCaMP5 (ΔF/F) antes do evento de poedeiras, enquanto mCherry fluorescência é relativamente inalterada (Figura 5B). Medido mudanças na proporção de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) mostram claramente uma HSN Ca2 + transitória ~ 4 antes do s lançamento do ovo (Figura 5B). Uma clara desaceleração de locomoção worm coincidente com a contração muscular vulval, ocorre que termina com ovo libera. Resultados anteriores mostraram que os neurônios colinérgicos de motor VC, que são inervados pelos HSNs, mostrar atividade de pico durante as contrações musculares vulval forte e ovo lançamento 8,10,27. Também mostramos que a optogenetic de ativação dos neurônios VC leva uma desaceleração imediata da locomoção, sugerindo que os neurônios VC podem ser ativados pela contração muscular vulval, assim retardando a locomoção até receber feedback de lançamento de ovo27 .
A imagem latente e rastreamento sistema descrito permite a visualização da organização espacial de comportamento de oviposição (Figura 5-C). Como anteriormente indicado, vermes entram execuções sustentadas de locomoção para a frente antes de ser o estado ativo de32. Vermes gastam a maioria de seu tempo forrageando em bactérias no centro do pedaço de ágar. Antes da entrada em estado ativo, vermes mover-se longe da comida, que é coincidente com a aparência de infrequente HSN Ca2 + transientes. Atividade HSN então as transições para disparar rajada, com vários espaçadas HSN Ca2 + transientes que sustentam a postura eventos. As minhocas então muitas vezes virem, retomar a locomoção para frente e desovar o caminho de volta para sua posição inicial perto as bactérias OP50. Presumimos que podem estar influenciando mudanças no local O2 e/ou concentração de CO2 , onde os vermes se decidir colocar ovos33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> Figura 1. C. elegans montagem técnica para geração de imagens de alta resolução da atividade de circuito de postura e comportamento. Top, a montagem final do lado. No fundo, a montagem final como se fosse visto através do fundo da lamela grande. As setas indicam OP50 alimentar bacteriana, worms de c. elegans e ovos, imprensado entre o pedaço de ágar NGM e a lamela de grande 24 x 60 mm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Figura 2 . Widefield ratiometric Ca2 + imagem e comportamento de gravação em um microscópio de epifluorescência invertido. (A) posição de verme e comportamento é capturado em brightfield através um 20 x (0,8 NA) plano-Apochromat objetivo usando luz infravermelha (750-790 nm) (setas roxas) emitida por uma lâmpada de halogéneo através do pedaço NGM. Um joystick e palco motorizado controlador é usado para manter o verme no campo de visão durante a gravação. Posição de fase (Δx, Δy) é enviada para o PC pela porta serial. GCaMP5 e mCherry de proteínas expressadas no worm estão animadas usando 470 nm (setas azuis) e 590 nm (setas amarelas) diodos emissores de luz (LED). Emitido GCaMP5 (verde setas) e mCherry (setas laranja) fluorescência juntamente com a luz infravermelha passa através de um espelho dicroico multi-banda (ver Tabela de materiais). Um divisor de feixe de 80/20 envia 20% da luz através de um demagnifer x 0.63 para captura em uma câmera do CMOS infravermelho-sensíveis (seta roxa). Os restantes 80% da luz é enviado através da porta do lado do microscópio para um divisor de imagem que separa o GCaMP5 e mCherry de fluorescência para separar as metades de uma câmera de sCMOS enquanto retira a luz infravermelha brightfield. Dados de ambas as câmaras são transferidos para um PC via cabos USB3. As portas do disparador da câmera sCMOS fluorescência (azul) são usadas para enviar + 5V TTL aciona o sistema de iluminação LED, a câmera CMOS infravermelho brightfield e o dispositivo de aquisição Digital (DAQ). (B) gatilho 3 saída sinais TTL são detectados pelo DAQ no pino digital #8 e enviados para o PC através de uma conexão USB. Estas entradas digitais acionar um ' onde XY' comando serial de um roteiro de software de Bonsai (XY-fase-final) onde se lê o X e Y palco posição para cada imagem de fluorescência/infravermelho GCaMP5/mCherry capturada. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Figura 3 : Layout do script de comunicação serial-estágio de Bonsai XY-fase-final. O top DigitalInput nó (rosa) lê TTL disparadores entrando pin #8 do DAQ. Para cada TTL tensão positiva (verde), o DAQ faz um timestamp (azul) e grava uma sequência de 'Onde XY?' (rosa) para o controlador de fase através da porta serial (cinza). O nó de SerialStringRead (rosa) lê que o X e Y coordenam a resposta do controlador de palco. Essa sequência é então convertida em mícrons e separada em X e Y coordenadas de palco. Finalmente, esses quatro fluxos são combinados usando um nó de fecho de correr (azul) e um arquivo de quatro column.csv está escrito: uma contagem de quadro dos sinais TTL recebido (nó de gama, rosa), as coordenadas X e Y e o intervalo entre momentos subsequentes (tipicamente ~ 50 ms quando gravação a 20 Hz). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografias representativas de fluorescência HSN e todo animal brightfield durante o comportamento de oviposição. (–D) Imagem de ratiometric simultânea de fluorescência GCaMP5 e mCherry nos HSNs apenas antes da liberação do óvulo. Termini pré-sináptica HSN é indicadas com setas. (C) fusão de GCaMP5 e mCherry de fluorescência. (D) intensidade modulada GCaMP5:mCherry ratio; um rácio elevado (vermelho) indica alta intracelular Ca2 + no terminal pré-sináptica. (E) Brightfield imagem do verme inteira apenas depois que os ovos foram colocados. Setas indicam as metades anteriores e posteriores da vulva da qual os ovos são postos. Barra de escala para todas as imagens é 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Figura 5 : Gravação do HSN Ca2 + e locomoção velocidade durante o comportamento de oviposição. (A) vestígios de mudanças de relação GCaMP5:mCherry em resposta a intracelular Ca2 + transientes (ΔR/R; vermelho) juntamente com a velocidade instantânea do worm (µm/s; azul). Eventos de desova são indicados por setas. (B) vestígios de fluorescência GCaMP5 HSN (verde; ΔF/F), mCherry de fluorescência (vermelho; ΔF/F), relação de fluorescência GCaMP5:mCherry (preto; ΔR/R) e worm velocidade (azul) em torno do momento da liberação do óvulo. (C) organização espacial dos comportamentos de postura e locomoção durante a gravação inteira de 10 min. A faixa de worm foi obtida a partir das informações de fase XY que foi adicionadas para a posição do centroide da HSN obtido a partir da gravação de fluorescência mCherry. O timing de transientes HSN (círculos vermelhos), eventos de postura (setas pretas) e o início e fim da gravação (diamantes de verdes e azuis) são indicados. Barra de escala é 1 mm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

11.5K visualizações.  University of Miami School of Medicine. Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Vídeo: Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Neurociência

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bioquímica

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Comportamento

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Imagem de cálcio: um método para visualizar a atividade neural em C. elegans vivos

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...