Agradecemos a membros dos laboratórios Kopito, Luo e Pearce para muitas discussões útil durante o desenvolvimento desses métodos. Agradecemos também o Brian Temsamrit pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade das Ciências e as confianças Charitable W.W. Smith.

Os autores não têm nada para divulgar.

Como o número de pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas continua a aumentar, há uma necessidade urgente de aumentar a compreensão da patogênese molecular dessas doenças para que melhor terapias podem ser desenvolvidas. Aqui, descrevemos os métodos que permitem a monitorização do prião, como transmissão de agregados de proteínas patogênicas entre diferentes tipos de células no organismo modelo, Drosophila melanogaster. Recentemente usamos esta metodologia para demonstrar prião, como transmissão de mutante Htt agregados na vivo e identificar um receptor fagocítica que medeia a propagação destes agregados de neurônios, glia27. Nossa abordagem explora diversas vantagens do uso de drosófila para estudar doenças genéticas humanas: seu ciclo de vida curto e vasta toolset genética, que pode acelerar a descoberta de informações biológicas básicas terapeuticamente relevante.
Os métodos que descrevemos aqui oferecem duas grandes vantagens sobre outros animais existentes e celular modelos de cultura para a transmissão de príons, como: (1) o agente causador agregação (por exemplo, mutant Htt) é produzido em uma célula que residem em um tecido intacto e (2) expressão da versão normalmente dobrado da mesma proteína (por exemplo, selvagem-tipo Htt) em uma população de células separadas prevê príon como eventos prontamente acessível "repórter". Conseguimos fazer expressão de mutante e proteínas de Htt selvagem-tipo de não-sobreposição de populações de células dentro do mesmo organismo usando ferramentas sofisticadas de genéticas que estão bem estabelecidas em Drosophila40. Porque muitos diferentes tecido-específica Gal4 QF drivers e estão prontamente disponíveis, examinar o prião, como transferência entre essencialmente qualquer tipos distintos de células no corpo da mosca é viável.
Um componente crítico da abordagem é alcançar expressão segregado de mutante e proteínas de Htt selvagem-tipo em populações de células diferentes dentro do mesmo animal. Qualquer sobreposição de expressão precisa ser eliminado para que a agregação de Htt selvagem-tipo nas células destinatários com precisão relatórios citoplasmática penetração de príon como agregados originários de doadores células9,12,,27, 41. Isso pode ser feito através da introdução de ferramentas genéticas adicionais (por exemplo, Gal80 e QS repressores40) para aliviar esse problema. Uma vez que o genótipo ideal é projetado e selecionado, deve ser estabelecido um método sistemático para quantificar a partitura. Isto dependerá em grande medida o número de células que são rotulados, o número de agregados que aparecem e a relação sinal-ruído da amostra. Critérios como localização co e/ou FRET positiva podem ser usados para analisar os dados, como descrevemos aqui na Figura 4. No entanto, restringindo a seleção do selvagem-tipo Htt agregados baseados estas características podem levar a subestimação dos eventos de prião, como transferência, desde que algumas sementes de agregação Htt mutantes podem cair abaixo do limite de detecção do microscópio confocal.
A abordagem na vivo aqui descrita não é exclusiva para o comportamento de prião de agregados associados com HD ou até mesmo outros transtornos polyQ. Moscas transgênicas podem ser desenvolvidas para examinar o prião, como propagação de alfa-synuclein em PD, tau na AD e SOD1 ou TDP-43 em ALS utilizando o mesmo paradigma experimental. Para cada uma destas proteínas, um mutante propensas a agregação deve ser expresso em células do doador e uma versão solúvel da mesma proteína que agregados apenas quando nucleated devem ser expressos em células do destinatários. Este paradigma experimental também pode ser útil para investigar a ideia emergente que patogénicos proteínas associadas com doenças diferentes podem interagir através de um mecanismo de cruz-semeadura47. Finalmente, as inumeráveis ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila podem ser aplicadas para investigar e identificar o mecanismo (s) molecular subjacente citoplasma-para-citoplasma espalhamento de agregados de proteínas patogénicos associados a estas doenças fatais.

A hipótese do príon afirma que o agente infeccioso responsável para as encefalopatias espongiformes transmissíveis (por exemplo, doença de Creutzfeldt - Jakob nos seres humanos, o tremor epizoótico dos ovinos, doença desperdiçando crônica em cervos e alces e "doença da vaca louca" em bovinos ) é unicamente composto de proteína e desprovidos de ácidos nucleicos1. Em doenças de príon, a proteína príon celular (PrPC) pressupõe uma dobra não-nativas, estável (PrPSc) que é altamente beta folha-rico e pode propagar self convertendo e recrutamento monomérico PrPC moléculas em amiloide estável agregados. PrPSc agregados usam esse mecanismo de auto-replicação para espalhar entre diferentes células em um organismo e mesmo entre organismos individuais2.
Enrolamento de proteínas e agregação é também uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas (a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela))3. Formação das assembleias intra ou extra cellular agregados da proteína nestas doenças está intimamente associada com a citotoxicidade4 e progride ao longo de caminhos altamente reprodutíveis e doenças específicas, através do cérebro ao longo do tempo5, 6. estes padrões de propagação sugerem que agregados patogénicos associados a esses transtornos tem príon-como propriedades. Forte apoio agora existe para transmissão de príons, como dos agregados associados AD, PD, HD e ALS - espalham de célula para célula e modelo a mudança conformacional monomérico formas da mesma proteína em células anteriormente afetado7, 8.
A maioria dos estudos investigando o prião, como propagação de agregados de proteínas até à data têm sido realizada usando modelos de cultura de células de mamíferos, onde agregados transferir para o citoplasma das células ingênuo do espaço extracelular ou de outra célula citoplasma9,10,11,12,13,14,15, ou pela injeção de material agregado contendo em cérebro de rato e monitoramento agregar aparência fora a injeção local16,17,18,19,20,21,22, 23. mais recentemente, os animais transgénicos têm sido utilizados para demonstrar que agregados intracelulares se espalhar para outras células no cérebro intacto24,25,26,27, 28,29,30. Aqui, descrevemos um método para a visualização directa de transferência agregada entre células individuais do cérebro intacto de Drosophila melanogaster. Drosófila modelos de HD/polyglutamine (polyQ) doenças foram desenvolvidos primeiramente há quase duas décadas de31,32 e forneceram muitos insights inestimáveis sobre os mecanismos patogénicos subjacentes a estes distúrbios 33. HD é uma desordem neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene que códigos para a proteína huntingtina (Htt)34. Esta mutação resulta na expansão de um trecho de polyQ perto N-terminal do Htt, além de um limite de patogenicidade de ~ 37 glutaminas, fazendo com que a proteína misfold e agregado35,36. Proteínas de Htt do selvagem-tipo contendo < 37 glutaminas neste estiramento alcançar seu aprisco nativo, mas pode ser induzidas a agregada ao contacto físico directo com um Htt agregada "semente"12,,27,37. Exploramos este homotypic, nucleada agregação do selvagem-tipo Htt como uma leitura para transferência de príon-como e citoplasmática entrada dos mutantes Htt agregados originários de outras células.
Determinar os mecanismos pelos quais agregados de príon-como viagens entre células podem levar à identificação de novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas incuráveis. Levamos vantagem do ciclo de vida rápido, facilidade de uso e rastreabilidade genética da Drosophila melanogaster para definir mecanismos moleculares para propagação de célula para célula do mutant Htt agregados. Nossa estratégia experimental emprega dois sistemas de expressão binário disponíveis em Drosophila, o bem-estabelecida Gal4 específicas upstream ativando sequência (Gal4-UAS) sistema38 e o recentemente desenvolvido QF-QUAS sistema39. Estes dois sistemas independentes de acoplamento permite restringir a expressão dos mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes para populações de células distintas dentro da mesma voar40. Usando essa abordagem, nós examinamos príon como difusão do mutant Htt, monitorando a redistribuição de citoplasmática Htt selvagem-tipo de estado solúvel, normalmente difuso a um estado de agregados, uma consequência direta do contato físico com um mutante pré-formado Htt agregado "semente". Conversão de tipo selvagem Htt por mutant Htt pode ser confirmado usando bioquímicas ou transferência de técnicas biofísicas que relatam as interações da proteína-proteína, tais como energia de ressonância de fluorescência (FRET)9,,27,41 .
Importante, também podemos acessar um grande número de ferramentas genéticas em Drosophila para identificar genes e/ou caminhos que medeiam príon como propagação de agregados de proteínas. Temos recentemente usado essa abordagem para desvendar um papel-chave para o receptor de superfície ao tesouro de célula,42,Draper43, na transferência de mutante Htt agregados de axônios neuronais para glia fagocítica nas proximidades em Drosophila central sistema nervoso (SNC)27. Assim, a abordagem genética e imagem latente-baseada que descrevemos aqui pode revelar importantes informações biológicas básicas sobre um fenômeno doença relevantes no simples de usar mas organismo modelo poderoso, Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">AM9625</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">T9284-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:123px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:344px;">2904F24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">20% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:344px;">15713-S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal Goat Serum (NGS), filtered</td>
			<td style="width:123px;">Lampire Biological Laboratories</td>
			<td style="width:344px;">7332500</td>
			<td style="width:167px;">Aliquot and freeze upon receipt</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chicken anti-GFP</td>
			<td style="width:123px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:344px;">GFP-1020</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Rabbit anti-DsRed</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:344px;">632496</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td style="width:123px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:344px;">nc82</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FITC anti-chicken</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">SA1-7200</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A11011</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A21235</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Slowfade Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">12-550-143</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cover Glass (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:344px;">1404-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">503</td>
			<td style="width:167px;">use in non-dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">505</td>
			<td style="width:167px;">use in dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">LAS X image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

A agregação da proteína é uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela). Agregados de proteína estão intimamente associados com neuropatologia destas doenças, embora o mecanismo exato pelo qual a agregação da proteína aberrante interrompe a homeostase celular normal não é conhecido. Emergentes dados fornecer forte apoio para a hipótese que agregados patogénicos em AD, PD, HD, e ALS tem muitas semelhanças com os prions, que são somente proteína agentes infecciosos responsáveis para as encefalopatias espongiformes transmissíveis. Priões auto replicam por modelagem a conversão das versões nativamente-dobrado da mesma proteína, causando a propagação do fenótipo agregação. Como príons e proteínas de príon, como no anúncio, PD, HD e ALS mover de uma célula para outra é atualmente uma área de intensa investigação. Aqui, um modelo de Drosophila melanogaster que permite o monitoramento da transmissão príon-like, célula a célula do mutant huntingtin (Htt) agregados associados com HD é descrito. Este modelo aproveita-se de poderosas ferramentas para manipular a expressão do transgene em muitos tecidos diferentes da drosófila e utiliza uma proteína citoplasmática marcados fluorescentemente diretamente transferência de prião, como relatório de mutante Htt agregados. Importante, a abordagem que descrevemos aqui pode ser usada para identificar novos genes e vias que medeiam o espalhamento de agregados de proteínas entre célula diversos tipos em vivo. Informações obtidas a partir desses estudos irão expandir a compreensão limitada dos mecanismos patogénicos que fundamentam a doenças neurodegenerativas e revelar novas possibilidades de intervenção terapêutica.

Os métodos descritos aqui produzem dados robustos, demonstrando o prião, como transferência de agregados de proteína de Htt da população de uma célula para outra na mosca da intacta CNS. Conversão de tipo selvagem Htt de difusa para punctate é observado por fluorescência direta desta proteína de fusão YFP na glia destinatário como resultado da expressão de HttQ91-mCherry em ORNs doador (Figura 2A C e a Figura 4A, B). Relatórios precisos de eventos de prião, como transferência entre essas populações de dois célula exige cuidadosa seleção de moscas transgênicas e Gal4/QF drivers para produzir níveis de expressão forte de mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes sem qualquer sobreposição durante desenvolvimento ou na idade adulta. Além disso, projeto pensativo de transgenes de fusão a proteína fluorescente-Htt pode habilitar poderosas análises a jusante. Por exemplo, mutantes e selvagem-tipo Htt agregados podem ser quantificado como objetos punctate também manualmente (Figura 2C e Figura 4) ou usando o software de análise de imagem (Figura 3A, B), pode ser medido e caracteriza-se ainda mais como populações agregadas (Figura 3C), pode ser avaliado para localização co entre mutantes e selvagem-tipo proteínas (Figura 4A) e pode ser analisado para FRET27 (Figura 4 B). Essas análises exigem a fusão de mutante e selvagem-tipo Htt para etiquetas de proteína fluorescente com propriedades de fluorescência suficientemente separados, mas com suficiente sobreposição espectral para habilitar FRET entre doador e aceptor pares (por exemplo, PCP/YFP9 ou YFP/mCherry27).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> Figura 2 . Imagens confocal de prião, como conversão de HttQ25-YFP glia por neuronais agregados de HttQ91-mCherry. Máximo (A) projeção de intensidade de ~ 30 µm de fatias confocal mostrando um lóbulo da antena de uma mosca masculina expressando HttQ91-mCherry (vermelho) em axônios DA1 ORN usando Or67d-QF e HttQ25-YFP (verde) na glia usando repo-Gal4. Os limites aproximados do lóbulo da antena e glomérulo DA1, onde axônios DA1 ORN terminar, são indicados pelas linhas pontilhadas e sólidas, respectivamente. (B) máxima projeção de intensidade de ~ 20 µm de fatias confocal, mostrando uma visão ampliada da região glomerular DA1 da. (C) A única 0,35 µm confocal fatia mostrando uma única partitura HttQ25-YFP e seus associados (de sinal de HttQ91-mCherry indicado pela seta em cada canal). O sinal no canal vermelho foi aprimorado para visualizar localização co entre HttQ25-YFP e sinais de HttQ91-mCherry. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um objectivo de óleo 40 X 1.4NA. Barras de escala = 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> Figura 3 . Análise tridimensional de agregados de HttQ91-mCherry em axônios DA1 ORN. (A), um 3D representação dos agregados de HttQ91-mCherry expressado no glomérulo através de Or67d-QF usando os mesmos dados mostrados na Figura 2BDA1. (B) uma screenshot mostrando objetos individuais ou "pontos", identificados a partir dos dados brutos em (A) usando um pacote de software de análise de imagem. O software identificou 56 objetos de tamanhos variados nesta imagem/canal. O local indicado pela seta em (B) foi medido para ter um diâmetro de ~ 1,2 µm. setas apontam para locais onde dois objetos são imprecisamente mesclados em um ponto pelo software, provavelmente devido à proximidade da partitura individual. Para superar isso, configurações de limiarização diferentes devem ser testadas no software e/ou manchas mescladas devem ser separadas manualmente se possível. Barras de escala = 10 µm. histograma (C) mostrando a distribuição de diâmetros medidos pelo software para o HttQ91-mCherry "manchas", mostradas em (B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> Figura 4 . Co-localização e análise de traste de induzido agregados YFP-HttQ25. (A), A montagem de 4 0,35 µm confocal z-fatias individuais de um cérebro masculino de mosca expressando em DA1 ORNs usando Or67d-QF e HttQ25-YFP na glia usando repo-Gal4 HttQ91-mCherry. Os sinais foram ajustados para que mesmo pequenos agregados de HttQ91-mCherry são visíveis e induzida HttQ25-YFP agregados destacam-se em torno de sinal difuso. As fatias mostradas são cada um separado por ~ 1,0 µm (fatia número indicado no canto inferior direito das imagens mescladas) para que os vários agregados podem ser observados. As setas indicam HttQ25-YFP partitura que estavam determinados a ser em ou perto de foco em que z-fatia particular movendo manualmente através da z-pilha. Dos sete HttQ25-YFP partitura indicado aqui, seis têm associado um sinal de HttQ91-mCherry (ou seja, 86% dos agregados HttQ25-YFP co localizar com HttQ91-mCherry). Note que o sinal de mCherry associado com HttQ25-YFP partitura é muitas vezes mais fraco do que a maioria dos mCherry-positivo partitura no glomérulo DA1. Barra de escala = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-localizados punctum antes (painéis à esquerda) e depois (direita painéis) mCherry (aceitador) fotobranqueamento. O resultante aumento na fluorescência YFP (doador) foi usado para produzir uma imagem de eficiência (FRETFEP) FRET pixel por pixel usando o AccPbFRET plug-in para ImageJ46. Este agregado particular tem um total FRETFEP de 61%. Barra de escala = 1 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

7.9K visualizações.  University of the Sciences. Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Vídeo: Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condições que afetam Espaço Social em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

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Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em

Determinação da atividade locomotora espontânea em

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social

Condições que afetam Espaço Social em

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em

Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male