Agradecemos a los miembros de los laboratorios Kopito, Luo y Pearce para muchas discusiones útiles durante el desarrollo de estos métodos. También agradecemos a Brian Temsamrit para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Universidad de las Ciencias y las confianzas caritativas de W.W. Smith.

Los autores no tienen nada que revelar.

Sigue aumentando el número de pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas, hay una necesidad urgente de aumentar la comprensión de la patogenia molecular de estas enfermedades que se pueden desarrollar mejores terapias. Aquí, describimos los métodos que permiten monitoreo de transmisión del prión-como de agregados de proteínas patogénicas entre diferentes tipos de células en el organismo modelo Drosophila melanogaster. Recientemente hemos utilizado esta metodología para demostrar la transmisión del prión-como de mutantes Htt agregados en vivo y para identificar un receptor fagocítico que media la propagación de estos agregados de las neuronas glia27. Nuestro enfoque explota varias ventajas del uso de Drosophila para estudiar enfermedades genéticas humanas: su corto ciclo de vida y vasta herramientas genéticas, que pueden acelerar el descubrimiento de información biológica básica terapéuticamente relevante.
Los métodos que Describimos aquí ofrecen dos grandes ventajas sobre otros animales existentes y modelos de cultura para la transmisión del prión-como la célula: (1) el adición agente causal (por ejemplo, mutante Htt) se produce en una célula en un tejido intacto y (2) expresión de la versión normalmente plegado de la misma proteína (p. ej., tipo salvaje Htt) en una población separada de la célula proporciona un "reportero" accesible para-como prión. Expresión de mutante y el salvaje-tipo Htt proteínas en poblaciones de la célula no superpuestas en el mismo organismo hemos logrado mediante el uso de sofisticadas herramientas genéticas que están bien establecidos en Drosophila40. Porque muchos diferentes tejidos específicos Gal4 y QF conductores están fácilmente disponibles, examinar-como prión transferencia entre esencialmente cualquier tipos de distintas células en el cuerpo de la mosca es factible.
Un componente fundamental del enfoque es lograr expresión segregado del mutante y el salvaje-tipo Htt proteínas en diferentes poblaciones celulares en el mismo animal. Cualquier superposición de expresión debe eliminarse para que la agregación de Htt de tipo salvaje en células receptores con precisión informes de penetración citoplasmática de prion-como los agregados procedentes de donantes de células9,12,27, 41. Esto puede lograrse mediante la introducción de herramientas genéticas adicionales (e.g., Gal80 y QS represores40) para aliviar este problema. Una vez que el genotipo ideal es diseñado y seleccionado, se debe establecer un método sistemático para la cuantificación de puncta. Esto dependerá en gran medida el número de células que están etiquetados, el número de agregados que aparecen y la relación señal a ruido de la muestra. Criterios como la colocalización o traste positivo pueden ser utilizados para el análisis de los datos, como hemos indicado en la figura 4. Sin embargo, restringir la selección de tipo salvaje Htt agregados basados en estas características pueden provocar subestimación de eventos de transferencia-como prión, ya que algunas semillas agregadas de Htt mutantes podrían caer por debajo del límite de detección del microscopio confocal.
En vivo lo aquí descrito no es exclusivo de prion-como comportamiento de los agregados asociados a HD o incluso otras enfermedades de la poliQ. Moscas transgénicas se pueden desarrollar para examinar prion-como separarse de alfa-sinucleína en la EP, tau en AD y SOD1 o TDP-43 en ALS utilizando el mismo paradigma experimental. Cada una de estas proteínas, un mutante agregación propensos debe expresarse en células de un donante y una versión soluble de la misma proteína que sólo agregados cuando nucleadas deben expresarse en células del receptoras. Este paradigma experimental también puede ser útil para investigar la idea emergente que proteínas patógenas asociadas con diversas enfermedades pueden interactuar a través de un mecanismo siembra transversal47. Por último, las innumerables herramientas genéticas en Drosophila se pueden aplicar para investigar e identificar los mecanismos moleculares subyacentes de citoplasma a citoplasma que se separa de los agregados de proteína patógena asociadas a estas enfermedades mortales.

La hipótesis del prión afirma que el agente infeccioso responsable de las encefalopatías espongiformes transmisibles (p. ej., enfermedad de Creutzfeldt - Jakob en los seres humanos, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en ciervos y alces y "enfermedad de las vacas locas" en bovinos ) está exclusivamente compuesto de proteína y desprovista de ácidos nucleicos1. En enfermedades por prión, la proteína priónica celular (PrPC) asume un pliegue (PrPSc) no nativos, estable que es altamente beta ricos en hoja y puede uno mismo-propagar por conversión y reclutar moléculas monoméricas de PrPC en amiloide estable agregados. Agregados de PrPSc utilizan este mecanismo uno mismo-repliegue para difundir entre las diferentes células en un organismo e incluso entre los organismos individuales2.
Agregación y mal plegamiento de la proteína también es una característica central de la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y esclerosis lateral amiotrófica (ELA))3. Formación de asambleas de cellular intra o extra proteína agregada en estas enfermedades está íntimamente relacionada con la citotoxicidad4 y progresa a lo largo de caminos altamente reproducibles y específica de la enfermedad a través del cerebro en tiempo5, 6. estos patrones de propagación sugieren que agregados patógenos asociados con estos trastornos tienen propiedades similares a los priones. Ahora existe fuerte apoyo para transmisión del prión-como de agregados asociados a AD, PD, HD y la ELA - transmite de célula a célula y la plantilla el cambio conformacional de la forma monomérica de la misma proteína en células previamente inafectados7, 8.
La mayoría de los estudios que investigan propagación de prion-como de agregados de proteínas hasta la fecha se han realizado utilizando modelos de cultivo de células de mamífero, donde transferencia de agregados en el citoplasma de las células ingenuas desde el espacio extracelular o desde otra celda citoplasma9,10,11,12,13,14,la15, o por inyección de material que contiene el agregado en cerebros de ratón y control agregado apariencia fuera la inyección sitio16,17,18,19,20,21,22, 23. más recientemente, se han utilizado animales transgénicos para demostrar que agregados intracelulares se extensión a otras células en el cerebro intacto24,25,26,27, 28,29,30. Aquí, describimos un método para la visualización directa de la transferencia total entre las células individuales del cerebro intacto de Drosophila melanogaster. En primer lugar se desarrollaron modelos de Drosophila de HD/polyglutamine (poliQ) enfermedades hace casi dos décadas31,32 y han proporcionado muchos conocimientos invaluables en los mecanismos patogénicos que subyacen a estos trastornos 33. HD es un trastorno neurodegenerativo hereditario causado por una mutación dominante autosómica en el gen que codifica para la proteína huntingtina (Htt)34. Esta mutación da lugar a la ampliación de un tramo de la poliQ cerca N-terminal de Htt, más allá de un umbral patógeno de ~ 37 glutaminas, haciendo que la proteína misfold y agregado35,36. Proteínas de Htt de tipo salvaje que contienen < 37 glutaminas en este tramo lograr su pliegue natural, pero puede ser inducidas a agregado al contacto físico directo con un Htt agregada "la semilla"12,27,37. Aprovechamos este homotípicos, nucleada agregación de Htt de tipo salvaje como una lectura para transferencia-como prión y entrada citoplasmática de agregados de Htt mutantes procedentes de otras células.
Determinar los mecanismos por los que agregados-como prión viajes entre células pueden conducir a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para enfermedades neurodegenerativas incurable. Tomamos ventaja del ciclo de vida rápido, facilidad de uso y maleabilidad genética de Drosophila melanogaster para definir mecanismos moleculares para la propagación de célula a célula de agregados Htt mutantes. Nuestra estrategia experimental emplea dos sistemas de expresión binaria disponibles en Drosophila, la bien establecida Gal4 específicos aguas arriba activar secuencia (Gal4-UAS) sistema38 y el recientemente desarrollado QF-QUAS sistema39. Estos dos sistemas independientes de acoplamiento permite restringir la expresión de los transgenes de Htt mutantes y el salvaje-tipo poblaciones celulares distintas dentro de la misma mosca40. Usando este acercamiento, examinamos prion-como separarse del mutante Htt mediante el control de la redistribución de los citoplásmico Htt de tipo salvaje de su estado soluble, normalmente difuso a un estado agregado, consecuencia directa del contacto físico con una forma mutante Htt agregado "semilla." Conversión de tipo salvaje Htt por mutante Htt puede confirmarse mediante bioquímica o transferencia de técnicas biofísicas que informe las interacciones proteína-proteína, como la energía de resonancia de fluorescencia (FRET)9,27,41 .
Lo importante, también podemos acceder a un gran número de herramientas genéticas en Drosophila para identificar genes o vías que median la propagación del prión-como de agregados de proteína. Recientemente hemos utilizado este enfoque para desvelar un papel clave para el receptor scavenger superficial, Draper42,43, en la transferencia agregados Htt mutantes de axones neuronales a glia fagocitaria cercana en Drosophila central sistema nervioso (CNS)27. Así, el enfoque basado en la proyección de imagen y genética que se describe aquí puede revelar importante información biológica básica sobre un fenómeno de enfermedad relevante en simple-to-use pero organismo modelo de gran alcance, Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">AM9625</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">T9284-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:123px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:344px;">2904F24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">20% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:344px;">15713-S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal Goat Serum (NGS), filtered</td>
			<td style="width:123px;">Lampire Biological Laboratories</td>
			<td style="width:344px;">7332500</td>
			<td style="width:167px;">Aliquot and freeze upon receipt</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chicken anti-GFP</td>
			<td style="width:123px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:344px;">GFP-1020</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Rabbit anti-DsRed</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:344px;">632496</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td style="width:123px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:344px;">nc82</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FITC anti-chicken</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">SA1-7200</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A11011</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A21235</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Slowfade Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">12-550-143</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cover Glass (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:344px;">1404-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">503</td>
			<td style="width:167px;">use in non-dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">505</td>
			<td style="width:167px;">use in dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">LAS X image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

Agregación de la proteína es una característica central de la mayoría las enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (HD). Agregados de proteína están estrechamente asociados con neuropatología en estas enfermedades, aunque no se conoce el mecanismo exacto por el cual la agregación de la proteína aberrante interrumpe homeostasis celular normal. Surgiendo datos proporcionar fuerte apoyo para la hipótesis de patógenos agregados en TDA, PD, y ALS tienen muchas similitudes a los priones, que son sólo proteínas agentes infecciosos responsables de las encefalopatías espongiformes transmisibles. Priones autoreplicarse por plantillas la conversión de forma nativa doblado versiones de la misma proteína, causando la propagación del fenotipo de agregación. Cómo los priones y las proteínas del prión-como en AD, PD, HD y ALS se mueven de una celda a otra es actualmente un área de intensa investigación. Aquí, se describe un modelo de Drosophila melanogaster que permite monitoreo de transmisión del prión-como, célula a célula de agregados de la huntingtina (Htt) asociados con el HD. Este modelo se aprovecha de potentes herramientas para manipular la expresión de transgenes en muchos diversos tejidos de Drosophila y utiliza una proteína citoplásmica fluorescencia etiquetada transferencia directamente de prion-como del informe de agregados Htt mutantes. Lo importante, el enfoque se describe aquí puede utilizarse para identificar nuevos genes y vías que median la separarse de agregados de proteína entre célula diversos tipos en vivo. Información obtenida de estos estudios será ampliar la limitada comprensión de los mecanismos patogénicos que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas y revelar nuevas oportunidades para la intervención terapéutica.

Los métodos descritos aquí producen datos robustos demostrando a-como prión transferencia de agregados de la proteína Htt de población de una célula a otra en la mosca intacta del CNS. Conversión de tipo salvaje Htt de difuso a punteado se observa por fluorescencia directa de esta proteína de fusión YFP en glia receptor como resultado de la expresión HttQ91-mCherry en donantes ORNs (A-C de lafigura 2y figura 4A, B). Informes precisos de eventos del prión-como transferencia entre estas poblaciones dos celulares requiere una cuidadosa selección de moscas transgénicas y controladores Gal4/QF para producir niveles de fuerte expresión de los transgenes de Htt mutantes y el salvaje-tipo sin ningún solapamiento durante el desarrollo o en la edad adulta. Además, diseño pensativo de los proteína fluorescente-Htt fusión transgenes puede habilitar potente análisis aguas abajo. Por ejemplo, el mutante y el salvaje-tipo Htt agregados pueden ser cuantificado como objetos punteados o bien manualmente (figura 2C y figura 4) o utilizando software de análisis de imagen (figura 3A, B), puede ser medido y caracteriza más como población total (figura 3C), pueden evaluarse para colocalización entre mutante y el salvaje-tipo proteínas (figura 4A) y puede analizarse para traste27 (figura 4 B). Estos análisis requieren fusión de Htt mutante y el salvaje-tipo a etiquetas de proteína fluorescente con propiedades de fluorescencia suficientemente separados, pero con suficiente traslape espectral para traste entre pares donador y aceptor (p. ej., PPC/YFP9 o YFP/mCherry27).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> Figura 2 . Imágenes confocales de prion-como conversión de glial HttQ25-YFP por neuronales agregados mCherry HttQ91. (A) máxima proyección de intensidad de ~ 30 μm de rebanadas confocales muestra un lóbulo antenal de una mosca macho expresando mCherry HttQ91 (rojo) en axones de DA1 ORN en glia con repo-Gal4 QF Or67d y HttQ25-YFP (verde). Los límites aproximados del lóbulo antenal y DA1 glomérulo, donde terminan axones DA1 ORN, están indicados por las líneas sólidas y punteadas, respectivamente. (B) máxima proyección de intensidad de ~ 20 μm de rebanadas confocales mostrando una vista magnificada de la región glomerular DA1 de a. (C) A sola 0.35 μm confocal rebanada mostrando un solo orificio de HttQ25-YFP y sus asociados (señal) HttQ91 mCherry indicado por la flecha en cada canal). La señal en el canal rojo fue realzada para visualizar colocalización entre señales mCherry HttQ91 y HttQ25-YFP. Todas las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de aceite de 40 X 1.4NA. Barras de la escala = 10 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> Figura 3 . Análisis tridimensional de HttQ91 mCherry agregados en axones DA1 ORN. (A) A 3D representación de agregados mCherry HttQ91 expresado en el glomérulo de DA1 a través Or67d-QF utilizando la misma información que se muestra en la figura 2B. (B) una captura de pantalla que muestra los objetos individuales o "manchas" identificadas a partir de los datos en bruto (A) usando un paquete de software de análisis de imagen. El software había identificado 56 objetos de diferentes tamaños en este canal o imagen. Se midió el lugar indicado por la flecha en (B) para tener un diámetro de ~ 1,2 μm. las flechas apuntan hacia lugares donde dos objetos inexacto se fusionan en un mismo lugar por el software, probablemente debido a la proximidad cercana de la puncta individual. Para superar esto, debe analizarse en el software de configuración de umbral diferentes o combinados puntos deben estar separados manualmente si es posible. Barras de la escala = 10 μm. (C) histograma muestra la distribución de los diámetros medidos por el software para el HttQ91-mCherry "puntos" se muestra en (B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> Figura 4 . Co-localización y traste análisis de inducida por agregados de YFP HttQ25. (A) A montaje de 4 0,35 μm confocal z-sectores individuales de un cerebro de mosca masculino expresando HttQ91 mCherry en DA1 ORNs usando QF Or67d y HttQ25-YFP en glia con repo-Gal4. Las señales fueron ajustadas para que incluso pequeños HttQ91-mCherry agregados son visibles y agregados HttQ25-YFP inducidos sobresalen alrededor de señal difuso. Las rebanadas se muestra cada uno separadas por ~ 1.0 μm (segmento número indicado en la esquina inferior derecha de las imágenes fusionadas) por lo que pueden observarse múltiples agregados. Las flechas indican HttQ25-YFP puncta que estaban decididos a estar en o cerca de enfoque en ese particular rodaja z moviendo manualmente a través de la pila de z. De los siete puncta HttQ25-YFP indicadas aquí, seis han asociado perceptible HttQ91 mCherry señal (es decir, el 86% de los agregados de HttQ25-YFP Co localizar con HttQ91 mCherry). Tenga en cuenta que la señal de mCherry asociada a HttQ25-YFP puncta a menudo es más débil que la mayoría de los puncta mCherry-positivo en el glomérulo de DA1. Barra de escala = 5 μm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-localizada punctum antes (paneles de la izquierda) y después de photobleaching de mCherry (aceptador) (paneles de la derecha). El aumento en fluorescencia de YFP (donante) se utilizó para producir una imagen de eficiencia (effdel traste) traste pixel por pixel con el plug-in AccPbFRET para ImageJ46. Este agregado particular tiene un total de trasteeff de 61%. Barra de escala = 1 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.

Monitoreo de la transmisión de célula a célula de los agregados de la proteína Prion-como en Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

7.9K vistas.  University of the Sciences. Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condiciones que afectan Espacio Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

El alimentador de ensayo capilar para analizar el consumo de alimentos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.