Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di Universiti Putra Malaysia.

Nota: Tutti i reagenti chimici e biochimici per essere utilizzati devono essere di purezza analitica e utilizzato senza ulteriore purificazione. Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua deionizzata sterile. Autoclave tutti i bicchieri prima della sterilizzazione.
Attenzione: Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si eseguono attività di laboratorio, compreso l'uso di controlli (cappa, glovebox) tecnici e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni di lunghezza completa, chiuse scarpe).
1. fabbricazione e caratterizzazione di elettrodo per volta utilizzando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparazione e caratterizzazione di PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di soluzione di citrato di sodio (38,8 mM) a 100 mL di soluzione di acido cloroaurico acquosa (1 mM) di ebollizione rapidamente e raffreddare fino a temperatura ambiente. Osservare i cambiamenti nel colore nella soluzione preparata AuNPs che inizia come giallo, modifiche a nerastro e infine termina come rosso rubino scuro.</li>
		<li>Posizionare i pellet PLA in uno stampo di acciaio inox per il processo di fusione e li preriscaldare a una temperatura di 190 ° C per 10 min. Segui la procedura di pressatura: metterli sotto una pressione di 2,2 MPa per 1 min come parte della preparazione foglio PLA. Il foglio PLA sarà pronto per l'uso dopo il raffreddamento per circa 3 ore.</li>
		<li>Mescolando energicamente, sciogliere 0,68 mg dei fogli PLA in 5 mL di cloroformio a temperatura ambiente. Mescolare il PLA disciolto con 10 mL di soluzione AuNPs precedentemente preparata e mescolate in modo omogeneo a temperatura ambiente. Le miscele omogenee possono quindi essere denotate come PLA-AuNPs e caratterizzato usando UV-Vis, XRD, TEM e FESEM con EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione e caratterizzazione di elettrodi di carbonio serigrafato modificate Nota: Il SPCE utilizzato in questo studio comprende un sistema di tre elettrodi: un elettrodo contatore, un elettrodo di lavoro di carbonio e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.<ol>
<li>Dispensare 25 µ l della soluzione omogenea di PLA-AuNPs sul SPCE e quindi aria asciugare rapidamente per 24 h prima dell'uso.</li>
		<li>Elettrochimicamente caratterizzano gli elettrodi modificati, SPCE/PLA-AuNPs-ferro cianuro del potassio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) per misurare la superficie attiva, spettroscopia di impedenza elettrochimica, ripetibilità, riproducibilità e stabilità30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sviluppo del biosensore elettrochimico del DNA
<ol><li>
Preparazione della sonda Nota: Le sequenze del DNA complementare e ssDNA sonda sono stati scelti sulla base delle informazioni dal centro nazionale per database Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Acquisto di oligonucleotidi sintetici (20-mer ssDNA sonda, DNA complementare 20-mer, 20-mer malassortiti DNA e DNA non-complementare 21-mer) come polvere liofilizzata da laboratori commerciali, basato su sequenze seguenti: chitosani ssDNA sonda: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementare: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - DNA non corrispondente uno-base: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - tre basi DNA non corrispondente: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA non complementari: 3 ′ 5 ′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Preparare soluzioni di riserva di tutti gli oligonucleotidi (100 µM) utilizzando una soluzione TE sterile (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), suddivisa in porzioni analitiche. Tenere questo a-4 ° C e quindi apportare le appropriate diluizioni appena prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottimizzazione di immobilizzazione e ibridazione Nota: Un SPCE modificato con PLA-AuNPs, denotato come SPCE/PLA-AuNPs, è stato utilizzato per questo studio e un metodo di fusione di goccia è stato utilizzato per l'immobilizzazione del DNA e l'ibridazione.<ol>
<li>In primo luogo, immobilizzare 25 µ l di sonda ssDNA chitosani su SPCE/PLA-AuNPs e poi aria la asciugare per 24 ore a temperatura ambiente, dopo di che essa verrà infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione utilizzando tre fattori: la concentrazione di ssDNA (che vanno da 0,2 a 1,4 µM), tempo (variabile da 30 a 210 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipettare 25 µ l di DNA complementare sopra alla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA di svolgere l'evento di ibridazione dopo di che può essere infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione ibridazione tramite i due fattori di tempo (da 5 a 30 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Immergere l'immobilizzato e ibridati elettrodi in µM 20 MB per 30 min. rimuovere il DNA non specifico adsorbito e MB in eccesso mediante lavaggio con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquo con acqua deionizzata. Misurare la corrente di picco del MB riduzione usando tecnica DPV. Eseguire la misura di DPV con 0.1 M PBS (pH 7) non contenente nessun indicatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione del biosensore DNA fabbricato
	<ol>
<li>Immergere il SPCE/PLA-AuNPs in µM 20 MB per 30 min, lavare con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquare con acqua deionizzata prima della misura. Seguire una procedura simile per tutte le interazioni tra cui la sonda DNA, DNA complementare, DNA non corrispondente e non complementari campioni di DNA.</li>
		<li>Misurare la riduzione elettrochimica. Nota: Abbiamo misurato DPV utilizzando un Autolab commercialmente manufactured con software di interfaccia. Le misurazioni di DPV della riduzione elettrochimica MB eseguita presso un potenziale che vanno da -0.5 V a 0,25 V, con un passo di potenziale di 0.005 V, ampiezza di modulazione di 0.05 V e una velocità di scansione di 7,73 mVs-1 in 0.1 M PBS (pH 7), non contenente nessun indicatore. La selettività, sensibilità, riproducibilità e stabilità al calore del biosensore DNA fabbricato più ulteriormente sono stati studiati. Risultati riferiti sono stati presentati come media valore misurazioni in tre repliche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. convalida del biosensore fabbricato del DNA utilizzando campioni reali
<ol><li>Preparazione dei ceppi batterici
	<ol>
<li>Selezionare batterici campioni basati sulla loro significativa contaminazione dei frutti di mare31,32 . Nota: V. parahaemoliticus come ceppi di riferimento e 8 altri ceppi batterici (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, polmonite da Klebsiella Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse alginolyticus del vibrione) delle epidemie alimentari comuni patogeni sono stati impiegati per la validazione di biosensori elettrochimica del DNA in questo studio.</li>
		<li>Condurre una routine sub-cultura di ceppi batterici su loro rispettivi agar ogni due settimane per mantenere la loro vitalità, consultare la tabella 1 per le condizioni di coltura.</li>
		<li>Mantenere la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici nei loro rispettivi brodi crescenti contenente 20% (v/v) glicerolo a-80 ° C come glicerolo protegge i batteri impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che possono danneggiarli durante il processo di congelamento. Successivamente, inoculare un ciclo della cultura di cellula batterica conservati negli stock di glicerolo nei rispettivi brodi. Incubare i brodi secondo le loro rispettive crescita tempo e temperatura quando il bisogno di far rivivere i batteri.</li>
		<li>Determinare la quantità di V. parahaemoliticus celle utilizzando una piastra di diffusione tecnica33, standard e un metodo ben noto per l'enumerazione dei microrganismi derivate da una serie di diluizioni.<ol>
<li>Cultura V. parahaemoliticus in brodo di soia Trypticase (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C in una condizione di agitazione 140 giri/min. Quindi, trasferire 1 mL di coltura delle cellule di batteri in 9 mL di TSB + 3% NaCl per ottenere un fattore di diluizione 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere questo passaggio nove volte per ottenere una serie completa di fattore di diluizione fino a 10-10 . Successivamente, si sono diffuse 0,1 mL di ciascun fattore di diluizione (a partire da 10-1 a 10-10) sulla piastra di agar selettivo di un Vibrio per Colonia contando, rispettivamente. Incubare le piastre incubate a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Utilizzare un contatore per contare diverse colonie e poi retro-calcolare (conteggio la quantità CFU/pipettato x fattore di diluizione) per ottenere un'unità formanti colonie per millilitro densità (CFU mL-1). Derivare la concentrazione della Colonia formando unità (CFUs) in sospensioni di cellule di batteri dalla trama di calibrazione di CFU mL-1 assorbanza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del test PCR
	<ol>
<li>Estrarre DNA genomic seguendo un modificato bollito Lisi procedura34. Primo, streak un batterica individuale ceppo agarizzati e inoculare in media di brodo, seguita da incubazione e alla sua condizione di crescita relativa, un 140 giri/min agitazione condizione.</li>
		<li>Dispensare una cultura di 1 mL di brodo in una provetta da centrifuga micro. Questo Centrifugare a 4830 x g e a 4 ° C per 1 min ottenere pellet. Utilizzare circa 500 µ l di tampone sterile TE per risospensione con il pellet. Tenere la sospensione risultante per 10 min a 98 ± 2 ° C in un blocco di riscaldamento e raffreddare immediatamente a-18 ° C per 10 min lisare le cellule e liberare il DNA.</li>
		<li>Centrifugare il DNA genomico a 4830 x g e a 4 ° C per 3 minuti ottenere una sospensione di chiara e tenere il supernatante a-20 ° C per un ulteriore uso. Utilizzare una misurazione biofotometro con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce) per determinare la concentrazione e la purezza dell'Estratto il DNA genomico e quindi identificare tutti i ceppi utilizzando saggi biochimici standard35 e loro verifica tramite 16S rRNA gene sequenziamento36. Infine, denaturare il DNA genomico a 92 ° C per 2 min e raffreddarlo rapidamente in acqua di ghiaccio prima dell'applicazione per il biosensore.</li>
		<li>Confermare ulteriormente la presenza V. parahaemoliticus usando la PCR per il gene toxR di destinazione. Eseguire questa procedura in un termociclatore utilizzando una coppia di primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Ottimizzare l'amplificazione di PCR in un volume di reazione totale di 25 µ l composto da acqua sterile (15,5 µ l), buffer (5 µ l), primer (1 µ l, 10 µM), miscela del dNTP (1 µ l), mascherina del DNA (2 µ l) e la Taq DNA polimerasi (0,2 µ l, 10 x).</li>
		<li>Mescolare bene i componenti e organizzare l'amplificazione di PCR della sequenza dell'obiettivo in un termociclatore programmato per 30 cicli di amplificazione. Nel nostro studio, ogni ciclo consisteva di tre fasi reazioni i. e., denaturazione iniziale (94 ° C, min 3) seguita da 30 cicli di denaturazione (94 ° C, 1 min), ricottura (63 ° C, min 1,5) ed estensione (72 ° C, min 1,5), seguito dall'estensione finale (72 ° C, min 7).</li>
		<li>Determinare i prodotti amplificati e le loro dimensioni tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%. Catturare le immagini di gel con un sistema gel-documentazione prodotta commercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei campioni di cockle
	<ol>
<li>Ottenere campioni freschi. Nota: Il nostro freschi vongole (Anadara granosa) erano ottenuti dal mercato bagnato in Serdang, Selangor e rapidamente portati al laboratorio in una scatola più fredda del ghiaccio per l'analisi. Dividere i campioni in 2 gruppi, vale a dire il gruppo trattato e non trattato, supponendo che le vongole sono state raccolte in modo uniforme dall'inizio della vendemmia fino alla loro immissione in cella frigorifera.</li>
		<li>Pretrattare le vongole nel gruppo curato memorizzandole a-20 ° C per 24 h, seguita dall'esposizione alla luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA. Nota: La temperatura di congelamento e l'esposizione UV utilizzato per la controllata gruppo uccide o almeno limita il naturalmente ad accumulare V. parahaemoliticus nelle vongole. Non applicare un regime di pastorizzazione più alto di 70 ° C come l'obiettivo della condizione controllata in questo studio è quello di imitare la situazione reale dei cardi freschi. Nel frattempo, analizzare campioni direttamente al gruppo non trattato senza alcun pre-trattamento, non appena arrivano in laboratorio.</li>
		<li>Sottocultura un ceppo di V. parahaemoliticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Determinare il livello di cellule vitali nell'inoculo tramite placcatura di appropriate diluizioni della TSB (3% NaCl) su CA al fine di ottenere un inoculo di 104 CFU mL-1 di V. parahaemoliticus. Lavare ogni cockle in acqua distillata e lo scrub privo di sporco prima di utilizzare pinze sterili in un'unità a flusso laminare per rimuovere i tessuti dalla shell.</li>
		<li>Circa 10 g di campioni di tessuto di cockle di omogeneizzare con un omogeneizzatore in 90 mL di TSB sterile (3% NaCl) per 60 s. Aggiungi una quantità nota di V. parahaemoliticus a 9 mL di brodo campione omogeneizzato per i campioni arricchiti. Utilizzare gli esempi sono come controllo negativo. Stimare i conteggi delle cellule di V. parahaemoliticus a spillo per i campioni di cockle da 0,1 mL dei campioni su CA di placcatura, e successivamente, Pipettare 1 mL di campioni in una microcentrifuga per DNA campione estrazione, da utilizzarsi nel biosensore e analisi di PCR.</li>
		<li>Estrarre il DNA genomico del V. parahaemoliticus dai campioni a spillo e sono seguito modificato bollito Lisi procedura36. Infine, determinare la concentrazione di DNA e la purezza tramite una misurazione di Fotometro bio con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce).</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I passaggi critici in un quadro di sviluppo positivo di questo tipo di biosensore elettrochimico sono selezione di elementi di riconoscimento biologico appropriato per il trasduttore (acido nucleico o DNA qui); approccio chimico per la costruzione di strato sensibile del trasduttore; materiale di trasduzione; ottimizzazione di immobilizzazione del DNA ed ibridazione; e convalida del biosensore sviluppato utilizzando campioni reali.
Core per il corretto sviluppo di un biosensore elettrochimico sensibile e selettivo di DNA, è l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione e l'ibridazione. In questo lavoro, abbiamo usato MB come il complesso di redox. Ci sono vari principi delle interazioni MB-DNA: (i) di interazione elettrostatica della carica cationica MB con la carica anionica del backbone di fosfato di ssDNA e dsDNA; (ii) di intercalazione MB attraverso esito positivo inserimento di MB tra alternando coppie di basi G-C a dsDNA; (iii) con legame covalente alla fine del ssDNA di destinazione, che produce una densità bassa etichetta (uno o due MB molecole al filo del DNA); e (iv) dalle interazioni MB con una base a ssDNA di guanina non associata. Abbiamo applicato il quarto principio, che identifica con precisione V. parahaemoliticus da cross reattività di batteri e vongole fresche. Dopo ossidazione di particolare interesse, c'era una forte affinità tra MB e ssDNA. L'ibridazione di ssDNA con la sua sequenza complementare sostituisce le molecole bonded di MB e così riduce il segnale.
La serie di risultati sperimentali presentati sopra si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Il primo passo è la sintesi e la caratterizzazione polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle di oro (PLA-AuNPs) per la modifica dell'elettrodo (figure 1-6 e tabella 2). La qualità delle nanoparticelle d'oro è stata valutata mediante diffrazione di raggi x (XRD), microscopia elettronica di scansione di emissione di campo (FESEM), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), voltammetria ciclica (CV) e Analisi di impedenza. La seconda parte dello sviluppo coinvolti una caratterizzazione elettrochimica dell'elettrodo modificato (figure 7-12 e tabella 3-4) che ha determinato il successo potenziamento dell'elettrodo modificato rispetto l'elettrodo nuda in termini di rilevare l'evento di ibridazione.
La terza fase dello sviluppo di biosensori basati DNA si basava sull'ottimizzazione delle condizioni sperimentali dell'evento di ibridazione e l'applicazione del biosensore sviluppato per la rilevazione dell'agente patogeno effettivo (figure 13-20). L'evento di ibridazione che hanno determinato il successo della rilevazione dell'agente patogeno è stata valutata utilizzando impulso differenziale voltammetria (DPV). Attraverso la riduzione della corrente è stata indicata l'esistenza positiva dell'agente patogeno mirato. La sensibilità del biosensore sviluppato è stata valutata attraverso la costruzione di una trama di calibrazione e il calcolo di LOD (Figura 15). Il fabbricato biosensore è stato in grado di distinguere in particolare V. parahaemoliticus da altri agenti patogeni sulla base dei diversi livelli di riduzione di corrente (figure 17 e 18). La valutazione della fattibilità del biosensore sviluppato per il rilevamento di V. parahaemoliticus in campione di cibo effettivo è presentata in figure 19 e 20 e l'esistenza positiva dell'agente patogeno mirato è indicato dalla riduzione della corrente . Il positivo sviluppo di biosensori basati sul DNA è fortemente dipendente dalla selezione sonda DNA, potenziamento dell'elettrodo modificato, nonché l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali. La sonda di DNA qui è stata adattata dal precedente lavoro di Nakano67. Valorizzazione degli elettrodi modificati è stato effettuato utilizzando nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico per attivare la standardizzazione della nanosize. La funzione di nanoparticelle d'oro come materiale catalitico di electro68 e atto per aumentare la velocità di trasferimento dell'elettrone e forniscono anche una superficie su cui ancorare la sonda di DNA. I parametri sperimentali sono stati ottimizzati in termini di temperatura e incubazione del tempo che è fondamentale per DNA di modulo fronte/retro. La temperatura di ibridazione interessa la separazione tra l'adsorbimento non specifico e questo aumenta la selettività del sensore. Tempo di incubazione dell'ibridazione aumenta le probabilità della formazione duplex. La procedura di immobilizzazione deve essere ottimizzata al fine di assicurarsi che la sonda di DNA sarà in orientamento adatto per la formazione di duplex al form.
Tabella 5 confronta un campione di recentemente sviluppato elettrochimico DNA biosensori69,70,71,72,73,74,75 ,. Biosensori basati sul DNA sono un metodo promettente per la sostituzione di tecniche molecolari di base anche se ci sono alcune limitazioni che devono essere affrontate prima che il metodo può essere abbastanza portatile per l'utilizzo in loco. Il limite principale è l'estrazione di DNA di elaborazione del campione come la purezza e la quantità di DNA estratto sul sito non è probabile che sia buono come che estratte con il metodo di base di laboratorio standard. È, tuttavia, una promettente alternativa se la PCR ed elettroforesi su gel può essere sostituito con sistema di pretrattamento del campione come microfluidica.
Biosensori basati sul DNA sono potenzialmente utili per molte applicazioni tra cui diagnostica medica, monitoraggio ambientale e controllo di prodotti alimentari. Questa tecnica consentirà il monitoraggio on-line dei processi di controllo qualità, nonché di point-of-care monitoraggio dei pazienti. La portabilità del sistema intero sensore consentirà il decentramento dei processi diagnostici dove il consumatore può utilizzare il sistema di rilevamento nel comfort della propria casa.

Un importante argomento di dibattito pubblico e scientifico negli ultimi anni, l'intossicazione alimentare è principalmente associata con 3 agenti: microrganismi1, prodotti chimici2e parassiti3. Alimenti contaminati possono causare conseguenze gravi per la salute negli esseri umani, soprattutto nel gruppo di rischio più elevato di quelli con un sistema immunitario debole, anziani, donne incinte, neonati e bambini piccoli4. Con più di 1 milione casi di diarrea acuta che accadono annualmente nei bambini sotto i 5 anni in Africa, Asia e America Latina, l'intossicazione alimentare è una malattia globale principale5,6 e l'organizzazione mondiale della sanità ha stabilito microrganismi come il più importante collaboratore7. Vibrio parahaemolyticus spicca i più ampiamente riconosciuti ceppi virulenti. Solitamente si trova in ambienti costieri, estuari e marino8, è un batterio gram-negativo, che diventa attiva in ambienti sale alti e provoca gravi gastroenteriti umana quando mangiato nella Marina non adeguatamente cotta, maltrattato o cruda prodotti9. Inoltre, condizioni mediche esistenti in alcune persone li rendono inclini a infezioni, setticemia o orecchio infezione derivante da V. parahaemolyticus10della ferita. I fattori di virulenza di V. parahaemoliticus emolisine sono divisi in due tipi che contribuiscono alla patogenesi della malattia: termostabile emolisina diretta (TDH) codificati da geni tdh ed emolisina TDH-correlati codificati da geni di trh11. I marcatori di virulenza (geni tdh e trh) di V. parahaemoliticus si trovano principalmente in campioni clinici piuttosto che in campioni ambientali.
V. parahaemoliticus possiede la capacità di sopravvivere in una vasta gamma di condizioni, rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali12. Il suo meccanismo di proliferazione intensifica il potenziale di rischio aumenta la sua tossicità in parallelo con cellula massa13. Peggio ancora, il cambiamento climatico sta fornendo questi batteri con ampio condizioni per accelerare la loro crescita di popolazione cellulare14. A causa della sua alta frequenza, V. parahaemoliticus deve essere monitorato lungo la catena di approvvigionamento alimentare, in particolare nel commercio e produzione di frutti di mare dal momento che tali prodotti sono dove si trovano in enormi quantità15,16 in tutto il mondo. Attualmente i batteri vengono identificati e isolati utilizzando una gamma di metodi tra cui prove biochimiche, arricchimento e selettivi17, enzima-collegata immunomagnetica sorbente assay (ELISA)18, elettroforesi del gel di impulso-campo (PFGE) 19, test di agglutinazione al lattice e della polimerasi reazione a catena (PCR) test20. Solitamente, questi metodi richiedono personale qualificato, sofisticati strumenti e tecniche laboriose che non forniscono informazioni sulla contaminazione immediatamente. Questo limita fortemente la probabilità di rilevare prontamente contaminazione nociva e applicazioni in loco. Strumenti di rilevazione rapida rimangono una sfida eccezionale.
Biosensoristica sta emergendo come un'opzione di promessa per la rilevazione di patogeni di origine alimentare, perché offre un risparmio di tempo, conveniente, pratico e in tempo reale analisi metodo21,22,23,24 . Tuttavia, anche se ci sono stati molti risultati positivi di rilevazione di analita in campioni arricchiti e soluzione standard utilizzando biosensori, c'è ancora una mancanza di ricerca applicata a campioni reali in miscele acquose o estratti organici25. Recentemente, biosensori elettrochimici tramite rilevazione diretta e/o indiretta dell'acido deossiribonucleico (DNA) hanno ricevuto maggiore attenzione tra gli scienziati, a causa della loro specifica per la rilevazione di complementare di destinazione tramite un evento di ibridazione26 , 27 , 28 , 29. questi approcci unici sono più stabili rispetto ai biosensori basati su enzima, offrendo così una tecnologia promettente per la miniaturizzazione e la commercializzazione. L'obiettivo dello studio segnalato qui è quello di costruire uno strumento veloce che può rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività, sensibilità e praticità, basata sulla specificità di sequenza di DNA durante l'ibridazione. Strategie di identificazione comportano la combinazione di polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle d'oro (PLA-AuNPs)30 ed elettrodi di carbonio serigrafato (SPCEs) in presenza di indicatore di ibridazione, blu di metilene (MB). Il potenziale del costrutto rilevamento sviluppati è ulteriormente esplorato utilizzando campioni di batteri DNA cockle lisato e fresco.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemoliticus) è un agente patogeno comune di origine alimentare che contribuisce a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, significativamente che colpiscono il tasso di morbosità e di mortalità umana. I metodi convenzionali per il rilevamento di V. parahaemoliticus quali metodi basati su cultura, analisi immunologiche e metodi molecolari basati richiedono manipolazione complicate e sono che richiede tempo, noioso e costoso. Recentemente, biosensori hanno dimostrato di essere un promettente e completo metodo di rilevamento con i vantaggi di rilevamento rapido, economicità e praticità. Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Nel lavoro, caratterizzazione di nanoparticelle d'oro stabilizzato in acido polilattico sintetizzato (PLA-AuNPs) è stata ottenuta utilizzando la diffrazione dei raggi x (XRD), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), emissione di campo Microscopia elettronica a scansione (FESEM) e la voltammetria ciclica (CV). Inoltre abbiamo effettuato ulteriori test di stabilità, sensibilità e riproducibilità di PLA-AuNPs. Abbiamo trovato che il PLA-AuNPs formata una solida struttura di nanoparticelle stabilizzate in soluzione acquosa. Inoltre abbiamo osservato che la sensibilità migliorata grazie il più piccolo valore di resistenza (Rct) trasferimento carica ed un aumento della superficie attiva (0,41 cm2). Lo sviluppo del nostro biosensore di DNA si basava sulla modificazione di un elettrodo di carbonio serigrafato (SPCE) con PLA-AuNPs e utilizzando il blu di metilene (MB) come l'indicatore redox. Abbiamo valutato gli eventi immobilizzazione e ibridazione mediante voltammetria impulso differenziale (DPV). Abbiamo trovato che non-complementari, complementari e non corrispondenti oligonucleotidi specificamente si distinguevano per il biosensore fabbricato. Inoltre ha mostrato in modo affidabile sensibile rilevamento negli studi di reattività crociata contro vari agenti patogeni di origine alimentare e nell'identificazione di V. parahaemoliticus in vongole fresche.

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  Universiti Putra Malaysia. Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Video: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow microago-based sensore per Multiplexed transdermico elettrochimica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Oculare piattaforma per testare Lenti a contatto

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.