Agradecemos Bryne Ulmschneider contribuições para o protocolo e Diane Barber para sugestões sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Instituto Nacional de subvenção de saúde GM116384 ao Nystul de T.G. e D.L. Barber.

Nota: para medir pHi na linhagem FSC, podemos calcular a relação das intensidades de fluorescência da pHluorin para mCherry em células de folículo em condições fisiológicas, pFCs e FSCs e converter os rácios em valores de pHi com padrão as curvas de calibração para cada célula tipo 7. Primeiras, viver experiências de imagem são realizadas para medir intensidades de fluorescência de pHluorin e mCherry em germaria dissecado em um buffer que contém NaHCO 3, que imita condições fisiológicas 1 , 7. curvas padrão, próxima são geradas por medir intensidades de fluorescência pHluorin e mCherry em um at +-livre, K + tampão contendo o ionóforo nigericin ajustado para dois valores de pH diferentes, 6,5 e 7,5. Na presença de nigericin, pHi se equilibra o pH da reserva através da membrana de plasma, causando pHi coincidir com o pH extracelular. Por último, as curvas padrão são usadas para converter pHluorin para mCherry rácios para valores estimados pHi.
 1. pré-julgamento: preparação antes de medição pHi In Vivo Nota: para medir pHi na vivo, o transgene mCherry::pHluorin deve ser expressos no tipo de célula de interesse. Abaixo estão algumas maneiras comuns para gerar pHluorin transgénico voa na linhagem do FSC. A geração de clones mCherry::pHluorin é particularmente útil para identificar FSCs, que estão localizados na extremidade anterior de um clone do FSC. Tecido mCherry::pHluorin específicos expressão é útil para medir pHi em todo o tecido inteiro e também é mais conveniente quando se combina com a expressão de um RNAi ou transgene.
<ol><li>Geração de transgênico pHluorin voa <ol><li>mCherry::pHluorin-rotulados FSC clones <ol><li>tornar mCherry::pHluorin FSC clones, cruzar UAS-mCherry::pHluorin 1 para um ato-Gal4 flipout ações ou outro o estoque com um Gal4 inducible Flp/FRT.</li>
			<li>Para fazer heatshock clones inducible, heatshock adultos F1s para 2 dias pós eclosão em frascos vazios para 1 h em um banho de água de 37 ° C, quatro vezes aproximadamente cada 12 h.</li>
			<li>Para garantir o crescimento normal e taxas máximas de oogénese durante este período, manter moscas fornecendo molhado de fermento fresco (aproximadamente partes iguais secar padeiro &#39; s fermento e água) diariamente pelo menos 6 dias após a indução de clone.</li>
		</ol></li> <li>Expressão de mCherry::pHluorin específicas de tecido</li> <li>Cruz UAS-mCherry::pHluorin 1 de um folículo celular driver específico, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).</li>
		<li>3 dias depois que moscas começam eclosing, coletar e colocá-los em frascos contendo fermento molhado, pelo menos 24 h antes da dissecação.</li>
	</ol></li> <li>Fazendo soluções Nota: é importante preparar os buffers de seguintes no dia do experimento, porque as concentrações de pH e soluto no buffer podem mudar ao longo do tempo.
	<ol><li>Buffers de bicarbonato, nigericin e dissecação de preparar. Adicione os componentes na ordem listada para evitar formação de precipitados (consulte a tabela 1, tabela 2 e tabela 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Julgamento: Medição pHi na linhagem FSC Nota: A dissecação, montagem e ao vivo de imagens as etapas para o tampão de bicarbonato e as condições de reserva de nigericin dois talvez precise ser executada duas vezes: uma vez para determinar o microscópio configurações e uma segunda vez para coletar dados experimentais. Consulte a seção 2.2 abaixo para obter mais informações.
<ol><li>, Dissecção e montagem Nota: para materiais necessários para executar este passo, consulte a Figura 1 e Tabela de materiais. Para câmaras 3D montagem de impressos, arquivos de impressora 3D são fornecidos como arquivo suplementar 1 e 2 de arquivo suplementar.
	<ol><li>Dissecação: <ol><li>câmaras de montagem Prepare aplicando uma fina camada de graxa de vácuo para o lado mais liso da 3D impresso câmara de montagem. Coloque esse lado sobre uma lamela de 22 x 40 mM para selar a lamela para a câmara de montagem.</li>
		</ol></li> <li>Dissecar os ovários da fêmeas adultas moscas no buffer de dissecação 500 µ l (tampão bicarbonato ou nigericin, tabela 3) <ol><li>anestesiar moscas de 3-4 usando gás de CO 2 e transferência voa sobre uma placa mosca perfundida com CO 2 gás.</li>
			<li>Pegar uma mosca anestesiada com pinça e coloque na mídia dissecação.</li>
			<li>Beliscar o tórax de uma mosca com uma pinça, enquanto puxando a ponta de seu abdômen até que seus ovários estão expostos.</li>
			<li>Depois de descolar os ovários de outros órgãos, arreliar distante o ovarioles usando 22 1/2 agulhas de seringa. Cuidadosamente separada do músculo da bainha dos ovários e ovarioles individuais separadas do cluster de ovarioles. Uma técnica eficiente para isolar a bainha do músculo é usar uma agulha de seringa para segurar o cluster de ovarioles no lugar em sua extremidade anterior e curso para baixo ao longo do comprimento do único ovarioles.</li>
			<li>Incubar os ovários dissecados na mídia de dissecação por exatamente 10 min antes de prosseguir para a etapa de montagem, para que haja tempo suficiente para o pHi de células totalmente equilibrar o pH dos meios de comunicação dissecação nigericin. 
			Nota: Certifique-se que a bainha do músculo é removida o ovarioles. A bainha do músculo pode atenuar o sinal de fluorescência, o que torna difícil identificar células individuais usando Concanavilin-A e pode causar ovarioles mover-se espontaneamente durante a geração de imagens ao vivo.</li>
		</ol></li> <li>De montagem <ol><li>colocar uma pequena gota de mídia de dissecação no sentido da lamela de vidro no interior da câmara de montagem.</li>
			<li>Transferência separada ovarioles usando fórceps.</li>
			<li>Separar câmaras de ovo de fase posteriores do germaria associado com câmaras de ovo de fase anteriores e tentar garantir que o germaria dissecado são colocados no centro da gota mídia dissecação.</li>
			<li>Adicionar duas pequenas gotas de esmalte para lados opostos de uma lamela de 12mm redonda e deixe secar por cerca de 10 s.</li>
			<li>Lugar a rodada lamela sobre a entrega de mídia de dissecação contendo separados germaria tal que daquele lado com esmaltes virado para baixo e entra em contato com a mídia de dissecação. Pressione as partes da borda com os esmaltes para achatar e fixar o germaria em posição. Nós recomendamos usar esmaltes mais velho porque ele mancha menos sobre a superfície da lamela como está sendo segura no lugar.</li>
			<li>Encha a câmara de montagem com meios adicionais de dissecação. Buffer de condição específica que não contenha Concanavalina-A tintura pode ser usado para encher a câmara de. 
			Nota: O tempo total gasto dissecando e montagem não deve exceder 15 min. Isto é importante para minimizar os efeitos do dano tecidual e morte da pilha.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imagens ao vivo: Nota: nesta etapa, primeiro recolher imagens da condição de bicarbonato e as duas condições de nigericin para determinar as configurações de microscópio apropriado; ajustar as configurações de microscópio, se necessário, e coletar imagens para os dados experimentais. Usar um microscópio confocal capaz de imagem em 3 canais: GFP (emissão de excitação 475/509), mCherry (emissão de excitação/610 575) e far-red (633 emissão de excitação/647). 
	Nota: Definir configurações de microscópio: as intensidades pixel das imagens coletadas irão ser quantificadas para determinar as estimativas de pHi, por isso é importante que os valores de intensidade do sinal em cada conjunto de imagem é muito baixa nem saturados. A gama de intensidades que podem ser capturados em uma imagem é definida pela profundidade de bits da imagem. Em muitos casos, imagens de 8 bits são geradas por padrão, mas recomendamos adquirir os dados como imagens de 16 bits, que têm um alcance dinâmico mais amplo. É importante assegurar que a interferência entre canais fluorescentes é minimizada, então as configurações devem ser ajustadas para que o espectro de emissão coletados de cada fluoróforo não se sobreponha. Para testar essas configurações, pegue uma imagem de amostra utilizando o espectro de excitação para as boas práticas agrícolas e recolher no espectro de emissão para mCherry e vice versa. Se as configurações foram ajustadas corretamente, não deve haver nenhum sinal em ambos os casos. Defina as configurações de microscópio (i.e., configurações de tensão em uma varredura a laser confocal, tamanho poder e pinhole de laser) para que as intensidades de pixel do sinal em todos os conjuntos de três imagens estão dentro da faixa dinâmica do arquivo de imagem. Para todas as nossas experiências, foi utilizado um laser de luz branco microscópio confocal com um objectivo de 40x para adquirir imagens de 16 bits em formato de × 1.024 1.024, enquanto nós aperfeiçoamos o ganho de tensão para cada experimento, conforme necessário. Por exemplo, em um experimento, podemos definir o ganho de tensão de GFP, mCherry e far-red como 37,8% 72,9% e 260%, respectivamente.
	<ol><li>Imagem ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 6,5 e ajustar as configurações, tais que as intensidades pixel das imagens pHluorin e mCherry são baixas, mas não abaixo os limites de detecção da câmera.</li>
		<li>Imagem um outro conjunto de ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 7,5 e ajustar as configurações de tal forma que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry são altas, mas não saturados.</li>
		Ovários de imagem <li>na dissecação de bicarbonato buffer e certifique-se de que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry não estão saturadas com as configurações escolhidas. Se os pixels são saturados, ajuste as configurações conforme necessário. 
		Nota: Microscópio parâmetros de configuração podem diferir com base na configuração do microscópio exata sendo usada e deve ser otimizado para cada experimento. Depois de microscópio configurações foram definidas, não alterá-los para o restante do experimento. As configurações devem coadunar-se através de controle e condições experimentais. Em nossos experimentos iniciais pHi, geramos 2 e 3 curvas de calibração de ponto nigericin e não encontrada nenhuma diferença significativa entre pHi calculado usando qualquer método. No entanto, em geral, a adição de mais pontos na curva de calibração seria esperada para melhorar a precisão. Portanto, é recomendável gerar curvas com diferentes números de pontos para determinar quantas são necessárias para um determinado conjunto de condições experimentais.</li>
	</ol></li> <li>Coleta de dados: <ol><li>faz dissecação, montagem e a imagem das amostras nas condições tampão bicarbonato e nigericin. Depois de dissecção e montagem, o tempo máximo de um conjunto de amostras de imagens não devem exceder 45 min para garantir que as medições de intensidade de fluorescência são feitas em tecido vivo, saudável.</li>
		<li>Para cada condição, adquirir imagens pelo menos 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Pós-julgamento: Análise de imagem <ol><li>intensidades de fluorescência medida em células de folículo, PFC e FSCs <ol><li>fundo subtração: <ol><li>Open in natura imagens em FIJI com cada canal em uma janela separada ( a Figura 4).</li>
			<li>Usar a ferramenta retângulo para desenhar uma região de interesse (ROI) na janela do canal pHluorin em uma parte da imagem sem sinal.</li>
			<li>Opcional passo: definir o limite inferior do limiar para que os pixels com valores de intensidade abaixo de fundo são excluídas e definir o limite superior do limiar máximo. Quando o limite é definido desta forma, as áreas da imagem sem sinal em sua maioria são azuis e o sinal é claramente visível ( Figura 4A).</li>
			<li>Medir a intensidade de fluorescência média no ROI. Se o limite foi definido na etapa 3, certifique-se de verificar o &#34; limite de limiar &#34; caixa na caixa de diálogo Definir medições.</li>
			<li>Subtrair a intensidade de fundo medido de cada canal e fatia da imagem usando a função Subtract, encontrada no processo de &#8594; menu matemática.</li>
			<li>3.1.1.2-6 passos de repetição para a janela de canal mCherry exceto que, na etapa 3.1.1.2, em vez de desenhar um novo retângulo com a ferramenta retângulo, use a função de seleção de restauração, encontrado no editar &#8594; menu de seleção, adicionar um retângulo com o mesmo dimensões e posição na imagem.</li>
		</ol></li> <li>FSCs identificar, pFCs e células de folículo: <ol><li>identificar a FSCs, pFCs e células do folículo por morfologia e localização usando o Concanavalina-A coloração para encontrar os limites da célula ( Figura 2).</li>
			<li>FSCs são finas células triangulares localizadas na borda do germarium na fronteira região 2a/2b. Se o mCherry::pHluorin é expresso em um clone do FSC, FSC também pode ser identificado como a célula mais anterior do clone.</li>
			<li>PFC é células de forma irregulares na região 2b, imediatamente adjacente e a jusante da FSCs.</li>
			<li>Folículo são células quadradas ou colunares que cercam o cisto de células germinativas na região 3.</li>
		</ol></li> <li>Obtenção rácios de intensidade de fluorescência <ol><li>escolher uma ou mais fatias no qual a célula de interesse tem maior intensidade de fluorescência no canal de mCherry e certifique-se que a coloração Concanavalina-A, vi no canal de far-red, é em foc Nós dentro da fatia selecionada.</li>
			<li>Desenhar ROI em torno de cada medida a intensidade de fluorescência média de pHluorin e mCherry em todos os gomos escolhida para medições e FSC.</li>
			<li>Dividir a intensidade média de fluorescência do canal pHluorin pela intensidade média de fluorescência do canal mCherry para calcular a proporção de pHluorin para mCherry fluorescência.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>PHi derivar valores e gerar imagens pseudocolored <ol><li>derivar valores de pHi <ol><li>em todos os casos, a curva de regressão linear deve ser gerada usando ovários de moscas com o mesmo genótipo para ambos experimental e controlar as condições. Gere uma curva de regressão linear para cada tipo de célula, usando os dados de duas condições de reserva nigericin ( Figura 3). No Excel, isso pode ser feito plotando os dados em um gráfico e adicionando uma linha de tendência linear. Como alternativa, consulte:</li> <li>uso a inclinação e a interseção y da curva de regressão linear calculados a partir das condições de nigericin e a equação de uma linha (y = mx + b) converter o pHluorin de mCherry relação valores calculados das amostras no bicarbonato de condição para valores de pH. Nesta equação, substituir a forma de inclinação (a intercepção de y) para b, colocar o valor em relação x e resolver para y.</li>
		</ol></li> <li>Gerar uma imagem pseudocolored, refletindo os valores de relação em FIJI.
		<ol><li>, Siga o procedimento acima para subtração de fundo (etapa 3.1.1 e Figura 4).</li>
			<li>Dividir o canal de pHluorin do canal mCherry usando a função de calculadora de imagem, no menu processo. Certifique-se o &#34; criar nova janela &#34; e &#34; resultado de 32-bit (flutuar) &#34; as caixas de seleção são ambos verificadas. Alterar a tabela de pesquisa (LUT), encontrado no menu imagem, térmica ou LUT de escolha. Consulte a Figura 4 para outras opções apropriadas.</li>
			<li>Na caixa de diálogo ajustar brilho e contraste (imagem &#8594; ajuste &#8594; brilho/contraste), clique o &#34; definido &#34; botão. Conjunto o mínimo exibido o valor como 0 e o máximo exibido valor para uma relação que melhor capta os dados, geralmente 1.0-2.0 ( Figura 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método para medir o pHi de células na linhagem FSC dentro sua tecido. Este protocolo foi desenvolvido e refinado nos últimos cinco anos, desde que primeiro começamos a estudar pHi em tecido ovariano de Drosophila . Durante esse tempo, o protocolo tem sido usado com sucesso por vários investigadores em nosso laboratório e em pelo menos quatro diferentes girando disco e microscópios de exploração do laser. Reprodutibilidade da nossa observação original, que aumenta de pHi como células na linhagem FSC diferenciarem as células-tronco para o pFC para o estado de células do folículo, através desses vários ensaios demonstra ambos que este fenómeno biológico é robusto e que a metodologia é confiável. No entanto, em nossa experiência, este é um procedimento desafiador ao mestre. Requer muita atenção aos detalhes em cada etapa e execução rápida, altamente proficiente da dissecação, montagem e passos de imagem. Conforme o protocolo, o processo de dissecção e montagem inclui uma incubação de 10 min, mas não deve exceder 15 min total e o procedimento de imagem deve ser concluído em 45 min. Sob condições ideais, Drosophila ovarioles podem ser mantidas em cultura para até 14 h17, mas achamos que o tecido começa a morrer muito mais rapidamente nos buffers de nigericin usados para gerar as curvas padrão. Nossas diretrizes garantir que todos os dados são coletados enquanto o tecido é ainda bem dentro da janela de tempo que parece saudável e morfologicamente normal. Isto não deixa muito tempo para cada etapa, embora, por isso é importante planejar com antecedência garantir que tudo está pronto para avançar de um passo para o próximo. Na verdade, é muito mais eficiente se duas pessoas trabalham juntas na dissecação, montagem, e imagem latente de procedimentos, com uma pessoa executando um passo enquanto a outra pessoa se prepara para a próxima etapa.
Uma vez pHi pode ser sensível para as manipulações experimentais necessárias para a imagem do tecido ex vivo, tais como temperatura e buffer de composição, esse método é melhor para identificar alterações relativas em pHi. Dado que a sonda consiste de duas proteínas fluorescentes distintas, suas propriedades de fluorescência como rendimento quântico, propriedades de tempo de vida e dobramento podem ser afetadas de forma diferente em diferentes tipos de células. Portanto, é essencial incluir amostras tratadas com as condições de reserva nigericin e usá-los para gerar uma nova curva de calibração para cada tipo de célula em cada julgamento. A fim minimizar fontes adicionais para a variabilidade, manter todas as condições consistentes durante o curso de geração de imagens é enfatizada. Amostras em nigericin condições de reserva devem ser preparadas e fotografadas no mesmo dia, como aqueles em condição de buffer o bicarbonato e a aquisição de imagem e preparação de todas as amostras devem ser mantidas tão consistentes quanto possível. Isto é importante porque as medições de pHi baseiam-se numa comparação entre a imagem de moda, diferenças tão experimentais que afetam a detecção do mCherry e pHluorin em um ou mais dos conjuntos de imagem pode diminuir a precisão das estimativas pHi. Fatores como alterações nas configurações de tensão de tubos fotomultiplicadores (se estiver usando um laser scanning confocal) ou tempos de exposição (se estiver usando um disco girando confocal) ou uma lente suja que reduz a quantidade de luz atingindo a câmera, claramente afetarão os resultados . Mas há uma infinidade de outros fatores mais sutis que podem variar de dia a dia e também poderia influenciar os resultados, como se as moscas estão bem alimentadas, a idade de moscas, e quanto tempo os lasers estão na antes da imagem latente. Preparando e todas as três condições de imagem no mesmo dia minimiza estas diferenças e, portanto, produzirá os resultados mais consistentes. Notavelmente, cada vez que nós mudamos para um novo microscópio ou componentes do microscópio foram atualizados, era necessário reotimizar as configurações no novo equipamento. Muitas vezes o que resultou em uma mudança nos valores médios das medições individuais, mas, enquanto novas curvas de calibração foram geradas com cada julgamento, as mudanças no equipamento tinham um impacto mínimo sobre as estimativas de pHi. Além disso, a comparação relevante é muitas vezes entre diferentes tipos de células que estão dentro do mesmo tecido (por exemplo, os FSCs, pFCs e folículo de células) e, portanto, são internamente controlada para variações experimentais.
Embora este protocolo centrou-se na medição pHi do tecido de sua, a metodologia é compatível com o padrão drosófila métodos para manipular a expressão de gene, como expressão de RNAi ou um transgene usando UAS/Gal4 e análise de mosaico. Desde que mCherry::pHluorin é impulsionado por um promotor UAS, sempre será co expressa com o RNAi ou transgene e MARCM18 pode ser usado para gerar clones mutantes homozigotos com mCherry::pHluorin como o marcador clonal. Pelas razões descritas acima, sua tecido deve ser analisado como um controle ao lado de cada julgamento com um genótipo mutante. Por último, os princípios gerais descritos aqui podem ser aplicados para o uso de mCherry::pHluorin para medir pHi em outros tecidos também. Com efeito, este protocolo foi adaptado de um protocolo para o uso de mCherry::pHluorin para medir pHi no Drosophila olho7, e nós usamos metodologia semelhante à imagem mCherry::pHluorin no cérebro larval. Em geral, as ferramentas e métodos descritos aqui fornecem novas oportunidades para investigar muitas funções diversas de pHi na vivo em tecido vivo, intacto.

Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação proteínas ou reações químicas necessárias para diferenciação. Futuros estudos têm o potencial para revelar mais a introspecção as muitos papéis diferentes do pHi dinâmica na vivo. No entanto, um dos desafios de estudar pHi durante a diferenciação na vivo é a obtenção de medições precisas de pHi. Ao contrário de outras características de diferenciação, tais como alterações na morfologia celular e expressão gênica, pHi é uma propriedade química lábil da célula que não é preservada em células que foram fixadas e permeabilizadas com métodos padrão. Além disso, pHi pode não ser estável em células que estão estressadas ou morrendo como resultado de manipulação experimental. Assim, é importante manter as células viva e mais saudável possível quando se mede o pHi. Vários corantes vitais estão disponíveis que funcionam bem para medir o pHi de células em cultura3, mas em muitos casos eles não são adequados na vivo estuda porque eles não penetram o tecido profundamente ou uniformemente o suficiente para fornecer medições precisas .
Para contornar o problema da penetração de corantes pobre, nós e os outros usaram uma sonda geneticamente codificada, mCherry::pHluorin4,5,6,7, que pode ser expressa especificamente na célula tipos de interesse e imagem em tecido vivo. pHluorin é uma variante do GFP com uma mais elevada pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) que dobra mais facilmente em um pH mais elevado; Então, a intensidade de fluorescência total emitida por uma população de moléculas de pHluorin na célula aumenta com o aumento de pHi8. Importante, a fluorescência é linear dentro da normalidade citosólica dos valores de pHi. Em contraste, a fluorescência de mCherry (pKa ~ 4.5) é insensível a mudanças de pH dentro do intervalo citosólica. Estes dois repórteres estão covalentemente ligados juntos como uma única proteína quimérico, codificada por um frame de leitura aberto único, para que eles sempre estão presentes em quantidades iguais. Portanto, a relação de pHluorin para mCherry intensidade de fluorescência fornece uma medida da pHi que é normalizado para a concentração de sonda em cada célula. Os rácios podem ser então convertidos a estimativas de valores de pHi usando uma curva padrão que é gerada, obtendo o pHluorin mCherry rácios de tecidos que tenham sido incubados para valores de pH conhecido.
Aqui, descrevemos os métodos para usar o mCherry::pHluorin para medir o pHi da linhagem epitelial de FSC no ovário drosófila . Este tecido bem caracterizado tem sido usado para modelar diversos aspectos da biologia epitelial, tais como células-tronco auto-renovação e diferenciação9,10,11, migração celular coletiva12 , o desenvolvimento e a manutenção da célula polaridade13,14. O epitélio do folículo é produzido por dois FSCs que residem na borda anterior do tecido em uma estrutura chamada de15,o germarium16. Estas células se dividem regularmente durante a vida adulta para auto renovar e produzir descendência, chamadas células prefollicle (PFC), que podem re-introduzir o nicho e se tornar um FSC ou se diferenciar em um dos três tipos de células do folículo diferentes: as células polares, células do caule, ou células do folículo do corpo principal. Mostramos anteriormente que no tecido de sua, o pHi aumenta progressivamente durante os primeiros estágios de diferenciação, de um pHi de aproximadamente 6,8 na FSCs para 7.0 no PFC, para 7,3 em células de folículo2. Bloquear este aumento por RNAi nocaute de um trocador de sódio/próton ubiquitously expressa, DNhe2, severamente prejudica a diferenciação de pFC, Considerando que aumentando pHi superexpressão de DNhe2 provoca uma leve diferenciação em excesso fenótipo. Estes resultados demonstram que pHi estàvel é mantida na linhagem precoce do FSC e experimentalmente que pode ser aumentado ou diminuído na vivo. Os métodos descritos aqui podem ser usados para medir pHi em sua tecido ou várias formas de tecidos mutantes, incluindo knockdown RNAi ou superexpressão usando um Gal4 de interesse e clones mitóticas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fly Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act-Gal4 flipout stock</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Buffer preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7088</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP362</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C21421</td>
			<td>0.25 mg/ml dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and mounting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9473431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 23-gauge syringe needles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z192457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 40 mM glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12545C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-D mounting chamber</td>
			<td>custom manufactured</td>
			<td></td>
			<td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-620-183A</td>
			<td>Model: Accumet AB15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>0H11436</td>
			<td>Model: SZ2-ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&#215; objective with a numerical aperture of 1.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Mudanças no pH intracelular (pHi) desempenham um papel importante na regulação de muitas funções celulares, incluindo o metabolismo, proliferação e diferenciação. Normalmente, pHi dinâmica é determinada em culturas de células, que são passíveis de medição e manipular experimentalmente pHi. No entanto, o recente desenvolvimento de novas ferramentas e metodologias tornou possível estudar a dinâmica de pHi no tecido intacto, ao vivo. Para a investigação de Drosophila , um desenvolvimento importante foi a geração de uma linha de transgénica carregando um biossensor pHi, mCherry::pHluorin. Aqui, descrevemos um protocolo que usamos rotineiramente para imagem ao vivo Drosophila ovarioles para medir pHi na linhagem de células-tronco (FSC) folículo epiteliais em linhas transgénicas tipo selvagem de mCherry::pHluorin; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para outros tecidos, incluindo os discos de asa e o epitélio do olho. Descrevemos técnicas para expressar mCherry::pHluorin na linhagem FSC, mantendo o tecido ovariano durante a imagem latente, ao vivo e aquisição e analisando imagens para obter valores de pHi.

Aqui descrevemos o processo de medição pHi no epitélio do folículo, que envolve várias etapas. Primeiro, os ovários são dissecados de moscas do genótipo apropriado usando ferramentas para dissecar e montagem (Figura 1). Os ovarioles são então fotografadas usando microscopia de fluorescência quantitativa e as imagens são analisadas para obter medições de pHi. Para cada imagem, os tipos de células de interesse são identificados conforme descrito na secção 3.1 (Figura 2). A relação entre as intensidades de fluorescência em canais de GFP e mCherry é convertida em valores de pHi usando uma curva padrão (Figura 3A), conforme descrito na seção 3.2. Usando esse método, nós encontramos que aquele pHi aumenta com diferenciação na FSC linhagem precoce, de 6,8 na FSCs, de 7.0 nas células prefollicle, para 7,3 nas células do folículo (Figura 3B). Os valores de pHi de cada tipo de célula podem ser representados graficamente, como na Figura 3B, ou como uma micrografia pseudocolored que mostra as diferenças no pHluorin de relações mCherry (Figura 4 e Figura 5). Nestas imagens, diferenças no pHluorin mCherry rácios são exibidas como diferenças na cor, tal como definido por uma LUT. É importante selecionar um LUT e valores máximos e mínimos para o intervalo de cores para produzir uma imagem que é o mais representativo dos dados. Embora, em geral, a escolha de configurações de LUT e gama não vai dar a aparência de diferenças que não estão presentes na imagem, uma escolha menos adequada de LUTs pode obscurecer as diferenças pHi presentes na Micrografia (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig1.jpg"> 
Figura 1: Materiais para dissecção e montagem Drosophila ovarioles. (A), uma imagem apresentando: (1) esmaltes; (2) dica de gordura, proveta e pipeta vácuo usada para aplicar graxa; (3) 23-calibre seringa de agulhas; (4) pinça de Inox Dumont, tamanho 5; (5) 3D impresso câmara de montagem; (6) 22 x 40 mM as lamelas de vidro; (7) ronda as lamelas de vidro, diâmetro de 12 mm, 0.13-0.16 mm de espessura; e (8) 9-poço vidro dissecando o prato. (B) A imagem de close-up da câmara 3D montagem impressas. (C) uma imagem mostrando um par dissecado de sua ovários. (D) uma imagem mostrando ovarioles bem separados. (E), A imagem da câmara 3D com ovários dissecados montado sob uma lamela de vidro redonda. Os pontos pretos são gotas de esmalte usado para prender a lamela redonda no lugar. (F), uma imagem de ovarioles dissecado por baixo de uma rodada lamela de vidro após a montagem. A caixa-preta indica uma região da imagem com uma única ovariole dissecado. Barras de escala representam cerca de 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig2.jpg"> 
Figura 2: identificando as células do folículo, pFCs e FSCs. Dois exemplos de germaria com UAS-mCherry::pHluorin e 10930-Gal4 manchadas com Concanavilin-A. Um ROI delineando um FSC, um soldado e uma célula de folículo é mostrado em cada imagem. As intensidades de fluorescência média nos canais de pHluorin e mCherry são usadas para calcular o pHluorin de relações mCherry. Barras de escala representam aproximadamente 10 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig3.jpg"> 
Figura 3: pHi aumenta durante a diferenciação na linhagem FSC. Resultados representativos tirados de Ulmschneider et al . mostrando 2 : curva (A), uma regressão linear típico usada para calcular valores de pH de pHluorin a mCherry rácios; e (B), o pHi calculado valores com intervalos de confiança de 95% para FSCs, pFCs e células do folículo. Esta figura foi adaptada depois da permissão, de Ulmschneider et al . 2. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig3large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig4.jpg"> 
Figura 4: usando FIJI para gerar uma imagem de ratiometric pseudocolored. (A) imagens que mostram os resultados de cada etapa no processo de subtração de fundo. Começando com uma imagem não processada (painéis à esquerda), o primeiro passo é definir os limites de limiar para que os pixels com valores de intensidade abaixo de fundo são excluídos. O limite superior do limiar situa-se no máximo. FIJI será de cor os excluídos pixels azul, resultando em uma imagem com um fundo azul e um germarium claramente visível (painéis de médios). Note que este passo é opcional. A segunda etapa é desenhar um ROI em uma parte da imagem sem medida de sinal (quadrados vermelhos em painéis de médios), a intensidade média de fluorescência do ROI e subtraia o valor de toda a imagem, resultando em um plano subtraído imagem (painéis de direito). O terceiro passo é usar a função de cálculo de imagem para dividir a imagem no canal de pHluorin pela imagem no canal mCherry. O resultado será uma imagem exibida com a tabela de pesquisa de Greys e os valores de exibição de imagem definido para abranger todo o intervalo dinâmico fornecido pela profundidade de bits da imagem. A etapa final é para ajustar as configurações de exibição de imagem para uma gama mais adequada e selecione uma tabela de pesquisa. (B) mostrando o resultado de um cálculo de imagem com o mínimo de imagens de amostra exibir valor definido como 0 e o valor de exposição máximo definido como 2.5 usando quatro tabelas de pesquisa diferente. O retângulo ao lado de cada imagem mostra as cores usadas em toda a gama dinâmica para cada tabela de pesquisa. Observe que para HiLo, 16 cores e térmica, cores diferentes são usadas para pixels com um valor de intensidade de 0 ou máximo (por exemplo, azul e vermelho, respectivamente, em HiLo). Isso fornece uma referência visual fácil dos limites do intervalo dinâmico, permitindo que o espectador vê que o sinal está dentro do intervalo dinâmico. (C) captura de tela mostrando as opções selecionadas ao importar um arquivo em ImageJ usando o plug-in importação Bio-formatos. escala barras representam 10 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Lass = "jove_content" fo:keep-together.within-página = "1" &gt;<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig5.jpg"> 
Figura 5: definindo a imagem valores de exibição de imagens ratiometric pseudocolored. Os valores de exibição de imagem de mínimo e máximo devem ser definidos para que o sinal em imagens da condição de bicarbonato, bem como de ambas as condições nigericin estão dentro do intervalo dinâmico. Para ilustrar este ponto, duas imagens de cada uma das três condições são mostradas com quatro configurações de exibição de imagem diferentes (0-0,5, 0-1, 0-2,5 e 5-0) usando a tabela de pesquisa térmica. Observe que, para todas as três condições experimentais, quando as imagens são exibidas com o conjunto de valor máximo indicado para 0,5, grande parte o sinal está próximo do máximo da escala colorimétrica e quando ele estiver definido para 5.0, grande parte o sinal está próximo do mínimo na cor escala de imetric. Em ambos os casos, as diferenças no pHluorin mCherry relação entre o tecido não podem ser facilmente apreciadas para que essas configurações não são ideais. Em contraste, valores de exposição máxima de 1.0 ou 2.5 são muito mais apropriados. Com essas configurações, as diferenças nas relações entre o tecido podem ser facilmente apreciadas, e os sinais nas imagens de todas as três condições experimentais são exibidos nas cores que estão dentro do intervalo dinâmico da escala colorimétrica. Barras de escala representam aproximadamente 10 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K visualizações.  University of California, San Francisco. Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

Vídeo: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...