אנו מודים Bryne Ulmschneider על תרומתה הפרוטוקול ואת מספרה דיאן לקבלת הצעות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי מכון הלאומי של בריאות גרנט GM116384 Nystul ת. ג, די. אל הספר.

הערה: כדי למדוד פי בשושלת FSC, לנו לחשב את היחס שבין עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin כדי mCherry, FSCs, pFCs ותאים זקיק בתנאים פיזיולוגיים, ולהמיר את היחס פי ערכים עם תקן עקומות כיול עבור כל תא הקלד 7. הראשון, לחיות ניסויים הדמיה מבוצעות למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של pHluorin ו mCherry ב germaria גזור לתוך מאגר המכיל NaHCO 3, אשר מחקה בתנאים פיזיולוגיים 1 , 7. הבא, רגיל עקומות מופקים על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin ו- mCherry נה +-K + מאגר המכיל את nigericin ionophore חינם, התרגלו שני ערכי pH שונים, 6.5 ו- 7.5. בנוכחות nigericin, פי equilibrates עם ה-pH של המאגר על פני קרום פלזמה, גורם פי להתאים את ה-pH חוץ-תאית. לבסוף, העיקולים רגילים משמשים כדי להמיר pHluorin mCherry יחסי לערכים פי המשוער.
 1. קדם משפט: הכנה לפני מדידה פי Vivo ב הערה: כדי למדוד פי ויוו, חייב להביע את transgene mCherry::pHluorin בסוג התא עניין. להלן כמה דרכים נפוצות כדי ליצור pHluorin הטרנסגניים זבובים בשושלת FSC. יצירת שיבוטים mCherry::pHluorin שימושי במיוחד לזיהוי FSCs, אשר ממוקמים בקצה הקדמי שיבוט FSC. רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי שימושי למדידת פי על פני הרקמה כולה, והוא גם נוח יותר בעת שילוב עם ביטוי של RNAi או transgene.
<ol><li>דור של pHluorin הטרנסגניים זבובים <ol><li>mCherry::pHluorin-ידי FSC שיבוטים <ol><li>כדי להפוך mCherry::pHluorin FSC שיבוטים, חצו UAS-mCherry::pHluorin 1 flipout Act-Gal4 במלאי או אחרים מניות עם Gal4 inducible Flp/והשפלתם.</li>
			<li>כדי להפוך heatshock inducible שיבוטים, heatshock F1s למבוגרים במשך יומיים לפרסם וגיחתו ב ריקה vials h 1 בתוך אמבט מים 37 ° C, ארבע פעמים כ כל ה 12</li>
			<li>כדי להבטיח צמיחה רגיל שיעור מרבי של oogenesis בתקופה זו, לשמור על זבובים על-ידי מתן שמרים רטובה (בחלקים שווים בקירוב יבש בייקר &#39; s שמרים ומים) מדי יום במשך לפחות 6 ימים לאחר אינדוקציה שיבוט.</li>
		</ol></li> <li>רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי</li> <li>קרוס UAS-mCherry::pHluorin 1 כדי זקיק תא מנהל ספציפי, 1 w y *; P {GawB} 10930/ארגון הקתולים הצעירים (בלומינגטון מזהה: 7023).</li>
		<li>3 ימים לאחר זבובים להתחיל eclosing, לאסוף ומניחים בקבוקונים המכילים שמרים רטובה, במשך לפחות 24 שעות לפני ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>שהופך פתרונות הערה: חשוב להכין המאגרים הבאים ביום של הניסוי, כי ריכוז ה-pH ו ממס במאגר יכולים להשתנות לאורך זמן.
	<ol><li>הכן ביקרבונט, nigericin, ניתוח מאגרי. הוסף הרכיבים לפי הסדר הרשום כדי למנוע היווצרות פוחת משקעים (עיין טבלה 1, בטבלה 2 של טבלה 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. משפט: מדידת פי בשושלת FSC הערה: הקרע, הרכבה והדמיה חי את השלבים עבור המאגר ביקרבונט ותנאי מאגר nigericin שני ייתכן שתצטרך לבצע פעמיים: פעם אחת כדי לקבוע את המיקרוסקופ הגדרות של פעם נוספת כדי לאסוף נתונים ניסיוני. עיין בסעיף 2.2 להלן לקבלת מידע נוסף.
<ol><li>לנתיחה, הרכבה הערה: החומרים הדרושים לביצוע שלב זה עיין באיור 1 ו לטבלה של חומרים. עבור הרכבה מודפס 3D צ'יימברס, ניתנים הקבצים במדפסת תלת-ממד כמו משלימה קובץ 1 ו- 2 קובץ משלים.
	<ol><li>ניתוח: <ol><li>הכן צ'יימברס גובר על-ידי החלת ציפוי דק של גריז ואקום לצד להחמיא של 3D מודפס הרכבה קאמרית. למקם את הצד הזה coverslip 22 x 40 מ מ כדי לאטום את coverslip אל התא הרכבה.</li>
		</ol></li> <li>לנתח השחלות של נקבות הזבוב הבוגר במאגר 500 µL לנתיחה (ביקרבונט או nigericin מאגר, טבלה 3) <ol><li>עזים ומתנגד 3-4 זבובים באמצעות גז 2 CO וזבובים העברה על גבי משטח לטוס perfused עם CO 2 גז-</li>
			<li>להרים של זבוב anesthetized עם מלקחיים ומקום לתוך כלי התקשורת לנתיחה.</li>
			<li>לצבוט את בית החזה של הזבוב עם forcep אחד, בזמן המשוחררים על קצה הבטן שלה עד השחלות שלה חשופים.</li>
			<li>לאחר ניתוק השחלות מן האיברים האחרים, להקניט לגזרים את ovarioles באמצעות 22 1/2 מחטי מזרקים. מעטפת השריר בקפידה נפרד מן השחלות נפרד ovarioles בודדים מהאשכול של ovarioles. טכניקה יעילה כדי לבודד למעטפת השרירים היא להשתמש מחט מזרק אחת כדי להחזיק את האשכול של ovarioles במקום בקצה הקדמי שלו, ולטף כלפי מטה לאורך יחיד ovarioles.</li>
			<li>דגירה את שחלות והטרף בתקשורת לנתיחה בדיוק 10 דקות לפני שתמשיך לשלב הרכבה על כך שאין מספיק זמן פי תאים equilibrate באופן מלא עם ה-pH של התקשורת דיסקציה nigericin. 
			הערה: ודא כי נדן שריר מוסר את ovarioles. שריר נדן עשוי להחליש את האות פלורסצנטיות, מה שהופך את זה קשה לזהות תאים בודדים באמצעות Concanavilin-A, עלול לגרום ovarioles להעביר באופן ספונטני במהלך דימות בשידור חי-</li>
		</ol></li> <li>הרכבה <ol><li>מקום טיפה קטנה של מדיה דיסקציה coverslip זכוכית בתוך החדר הרכבה.</li>
			<li>העברת מופרדים באמצעות מלקחיים ovarioles.</li>
			<li>להפריד תאי ביצה בשלב מאוחר יותר germaria המשויך צ'יימברס ביצה בשלב מוקדם יותר, ולנסות להבטיח germaria גזור ממוקמים במרכז הירידה מדיה לנתיחה.</li>
			<li>להוסיף 2 טיפות קטנות של לק צידי coverslip 12-מ מ עגול, לתת לו אוויר יבש כ-10 ס</li>
			Coverslip <li>מקום בסיבוב על המסירה של דיסקציה המדיה המכילה מופרדים germaria כך את הצד הזה עם לק פונה כלפי מטה ואנשי קשר התקשורת לנתיחה. לחץ כלפי מטה החלקים של הקצה עם לק לשטח ולאבטח את germaria בעמדה. אנו ממליצים על שימוש לק בוגרים כי זה מכפיש פחות על coverslip פני כמו זה המאובטחת במקום.</li>
			<li>למלא תא הרכבה עם מדיה נוספים לנתיחה. מאגר ספציפי תנאי שאינו מכיל צבע Concanavalin-A יכול לשמש כדי למלא התא. 
			הערה: הזמן הכולל בילה לנתח, הרכבה לא יעלה על 15 דקות. זה חשוב למזער את ההשפעות של נזק לרקמות ותא מוות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>הדמיה בשידור חי: הערה: בשלב זה, קודם לאסוף תמונות מן התנאי ביקרבונט, שני תנאים nigericin כדי לקבוע את הגדרות מיקרוסקופ נכונה; לכוונן את הגדרות מיקרוסקופ לפי הצורך, . ולאחר מכן לאסוף תמונות עבור המידע מהניסוי השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי המסוגל הדמיה 3 ערוצים: GFP (פליטת עירור 475/509), mCherry (575 פליטה עירור/610), ואת מרחיקת אדום (633 עירור/647 פליטה). 
	הערה: ערכת מיקרוסקופ הגדרות: ניתן לכמת עוצמות פיקסל תמונות שנאספו כדי לקבוע את ההערכות של pHi, לכן חשוב כי ערכי העוצמה של האות בערכת כל תמונה היא לא נמוכה מדי ולא רוויים. טווח ממידות ניתן ללכוד תמונה מוגדרת על-ידי עומק הסיביות התמונה. במקרים רבים, תמונות של 8 סיביות נוצרות כברירת מחדל, אך אנו ממליצים על רכישת הנתונים כתמונות 16 סיביות, אשר יש טווח דינאמי רחב יותר. חשוב להבטיח כי crosstalk בין ערוצי פלורסנט ממוזער, אז צריך ניתן להתאים את ההגדרות כך ספקטרום הפליטה שנאסף בכל fluorophore לא חופף. כדי לבדוק את הגדרות אלה, קח תמונה לדוגמה באמצעות הקשת עירור GFP ולאסוף ספקטרום הפליטה של mCherry, ולהיפך. אם ההגדרות הותאמו כהלכה, צריך להיות בלי קליטה בכל מקרה. קבע את הגדרות מיקרוסקופ (כלומר, הגדרות מתח על סריקתה לייזר קונפוקלי, גודל הכוח ואת חריר לייזר) כך פיקסל עוצמות האות כל תמונה שלוש ערכות הם בתוך הטווח הדינמי של קובץ התמונה. עבור כל הניסויים שלנו, השתמשנו לייזר אור לבן מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד 40 x סורק כדי לרכוש תמונות 16 סיביות בתבנית 1,024 × 1,024, בעוד אנחנו ממוטב מתח הרווח עבור כל ניסוי לפי הצורך. לדוגמה, בניסוי אחד, נוכל להגדיר את הרווח מתח עבור ה-GFP, mCherry, ו מרחיקת אדום כמו 37.8%, 72.9% ו- 260%, בהתאמה.
	<ol><li>התמונה ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 6.5, והתאם את הגדרות כאלה פיקסל עוצמות של תמונות pHluorin ו- mCherry נמוכים, אך לא מתחת לגבולות של זיהוי של המצלמה.</li>
		<li>תמונה קבוצה נוספת של ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 7.5 והתאם את ההגדרות כאלה עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry הם גבוהה, אבל לא רוויים.</li>
		<li>השחלות תמונה של ביקרבונט לנתיחה מאגר ולהבטיח כי עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry לא רוויים עם ההגדרות שבחרת. אם הפיקסלים רוויים, להתאים את ההגדרות לפי הצורך. 
		הערה: מיקרוסקופ הגדרת פרמטרים עשויות להשתנות בהתבסס על הכיוונון מיקרוסקופ המדויק בשימוש, חייב להיות אופטימיזציה עבור ניסוי. לאחר מיקרוסקופ הוגדרו הגדרות, אל תשנה אותם לאורך כל הניסוי. הגדרות צריכות להיות עקביים על-פני שליטה ומצבים ניסיוני. בניסויים פי הראשונית שלנו, אנחנו שנוצר 2 ו 3 עקומות כיול נקודת nigericin ומצא הבדל משמעותי בין פי מחושב באמצעות כל אחת מהשיטות. עם זאת, באופן כללי, התוספת של יותר נקודות בתוך עקומת כיול יהיה צפוי לשפר את דיוק. לכן, אנו ממליצים להפקת העקומות עם מספר שונה של נקודות כדי לקבוע כמה נדרשים קבוצה נתונה של תנאי הניסוי-</li>
	</ol></li> <li>איסוף נתונים: <ol><li>לבצע ניתוח, הרכבה, והדמיה של הדגימות בתנאים מאגר ביקרבונט ו- nigericin. לאחר ניתוח, הרכבה, הזמן המרבי הדמיה ערכה אחת של דגימות לא יעלה על 45 דקות על מנת להבטיח כי המדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עשויים ברקמת בשידור חי, בריא.</li>
		<li>עבור כל תנאי, לרכוש תמונות לפחות 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. שלאחר המשפט: ניתוח תמונות <ol><li>למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב FSCs, pFCs, ותאים זקיק <ol><li>רקע חיסור: <ol><li>פתוח לא מעובדת תמונות בפיג'י עם כל ערוץ (בחלון נפרד איור 4C).</li>
			<li>השתמש בכלי מלבן כדי לצייר אזור בעל עניין (ROI) בחלון ערוץ pHluorin בחלק של התמונה ללא האות.</li>
			שלב <li>אופציונלי: להגדיר את הגבול התחתון של הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע הם לא נכלל והגדר את הגבול העליון של הסף המרבי. הסף מוגדר באופן זה, האזורים של התמונה ללא האות הם בעיקר כחול, האות הוא נראה בבירור ( איור 4A).</li>
			<li>למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של רועי. אם הסף הוגדר בשלב 3, הקפד לבדוק &#34; הגבלה על סף &#34; תיבה בתיבת הדו-שיח הגדרת המידות.</li>
			<li>להפחית את עוצמת רקע נמדד מן הערוץ כל פרוסה של התמונה באמצעות הפונקציה הפחת, נמצא בתהליך &#8594; תפריט במתמטיקה-</li>
			<li>חזור על צעדים 3.1.1.2-6 עבור החלון ערוץ mCherry חוץ מזה, בשלב 3.1.1.2, במקום ציור מלבן חדש עם הכלי מלבן, השתמש בפונקציה הבחירה שחזור, נמצאו ערוך &#8594; תפריט הבחירה, כדי להוסיף מלבן עם אותם המידות והמיקום על התמונה.</li>
		</ol></li> <li>FSCs לזהות, pFCs ותאים זקיק: <ol><li>לזהות את FSCs, pFCs ותאים זקיק לפי תאור ומיקום באמצעות ההכתמה Concanavalin-A כדי למצוא תא לגבולות התא ( איור 2).</li>
			<li>FSCs הם תאים משולשים דקים ממוקם על קצה germarium בגבול אזור 2a/2b. אם mCherry::pHluorin מתבטאת של שיבוט FSC, FSC גם ניתן לזהות של התא הקדמי ביותר של השיבוט.</li>
			<li>pFCs הם תאים בצורת לא סדיר ב אזור 2b, מיד בסמוך ויוצאת של FSCs.</li>
			<li>זקיק תאים הם תאים מרובע או טורי המקיפים ציסטה תא הנבט 3 אזור.</li>
		</ol></li> <li>קבלת קרינה פלואורסצנטית יחסי העוצמה <ol><li>בחרו פרוסה אחת או יותר שבו התא של עניין יש עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה בערוץ mCherry ולוודא כי כתמים Concanavalin-A, ראיתי בערוץ מרחיקת אדום, יש foc אותנו בתוך הפרוסה שנבחר.</li>
			<li>לצייר רועי סביב כל FSC ולמדוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע pHluorin ו mCherry כל פרוסות שבחרת למדידות.</li>
			<li>לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע בערוץ pHluorin על ידי עוצמת קרינה פלואורסצנטית אכזרי של הערוץ mCherry כדי לחשב יחס של pHluorin כדי mCherry זריחה.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Derive פי ערכים, ליצור תמונות pseudocolored <ol><li>Derive פי ערכים <ol><li>בכל המקרים, העקומה רגרסיה ליניארית צריך להיווצר באמצעות שימוש השחלות מהזבובים של גנוטיפ באותה לשניהם ניסיוני ולשלוט תנאים. יוצרות עקומה רגרסיה ליניארית לכל סוג התא באמצעות הנתונים nigericin שני מאגר תנאים ( איור 3). ב- Excel, זה יכול להיעשות על-ידי התוויית הנתונים על גרף והוספת קו מגמה ליניארי. לחלופין, לראות:</li> <li>שימוש המדרון וחיתוך y של העקומה רגרסיה ליניארית שמחושבים התנאים nigericin, המשוואה של קו (y = mx + b) כדי להמיר את pHluorin mCherry יחס ערכי שמחושבים דוגמאות ביקרבונט מצב ערכי pH. במשוואה הזו, תחליף את הטופס מדרון (החיתוך-y) b, לשים את הערך יחס עבור x ו לפתור עבור י'</li>
		</ol></li> <li>ליצור תמונת pseudocolored המשקף את ערכי יחס בפיג'י.
		<ol><li>בצע ההליך לעיל על רקע חיסור (שלב 3.1.1 ואיור 4).</li>
			<li>לחלק את הערוץ pHluorin מערוץ mCherry באמצעות הפונקציה תמונת מחשבון, למצוא בתפריט תהליך. ודא &#34; יצירת חלון חדש &#34; ו &#34; 32-bit (float) תוצאה &#34; תיבות סימון מסומנות שתיהן. לשנות את טבלת בדיקת מידע (LUT), נמצאו תחת תפריט תמונה, תרמית או LUT של בחירה. ראה איור 4 אפשרויות מתאימים אחרים.</li>
			<li>כוונון הבהירות והניגודיות בתיבת הדו-שיח (תמונה &#8594; התאם &#8594; בהירות/ניגודיות), לחץ על &#34; להגדיר &#34; לחצן. קבע המינימום מוצג הערך 0 ותוצג המרבי ערך לכל יחס הטובים ביותר לוכדת את הנתונים, בדרך כלל 1.0-2.0 ( איור 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH.">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling.">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+pH+probes.">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches.">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li><li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+stem+cell+niches:+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation.">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li><li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia:+parallels+and+diversity.">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li><li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells.">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li><li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement.">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה למדידת על פי של תאים בשושלת FSC בתוך רקמת wildtype. פרוטוקול זה פותחה, מעודן בחמש השנים האחרונות, מאז אנחנו הראשונים החלו ללמוד פי ברקמת השחלה דרוזופילה . במהלך זמן זה, הפרוטוקול שימש בהצלחה על ידי מספר חוקרים במעבדה שלנו, על פחות ארבעה דיסק מסתובב שונים ועל סריקת מיקרוסקופ לייזר. הפארמצבטית ההתבוננות שלנו המקורי, כי גדל פי כמו תאים בשושלת FSC להבדיל מתא גזע טוראי המדינה תא זקיק, על פני אלה ניסויים מרובים מדגים הן תופעה ביולוגית זו היא חזקה וזה המתודולוגיה היא אמינה. עם זאת, מניסיוננו, זהו תהליך מאתגר להתמחות. זה דורש תשומת לב לכל פרט בכל שלב, ביצוע מהיר, מיומן מאוד הקרע, הרכבה, והדמיה צעדים. כאמור בפרוטוקול, ההליך לנתיחה, הרכבה כולל הדגירה 10 דקות אך לא יעלה על 15 דקות סה כ, יש להשלים את ההליך הדמיה בעוד 45 דקות. בתנאים אידיאליים, דרוזופילה ovarioles יכול להישמר בתרבות עבור עד 14 h17, אבל מצאנו כי הרקמה מתחילה למות מהר יותר במאגרי nigericin המשמש להפקת העקומות סטנדרטי. ההנחיות שלנו להבטיח כי כל הנתונים נאספים בעוד הרקמה הוא עדיין בתוך החלון של פעם שהוא מופיע מורפולוגית תקין. זה לא מותיר הרבה זמן עבור כל שלב, אף, לכן חשוב לתכנן מראש לוודא שהכל מוכן להמשיך משלב אחד למשנהו. למעשה, זה הרבה יותר יעיל אם שני אנשים עובדים ביחד על הקרע, הרכבה, הדמיה נהלים, עם אדם אחד ביצוע שלב תוך האדם האחר מכין עבור השלב הבא.
מאז פי עשוי להיות רגיש המניפולציות ניסיוני נדרשים תמונה של רקמות ex-vivo, כגון טמפרטורה, מאגר הרכב, שיטה זו היא הטובה ביותר לזהות שינויים יחסית pHi. בהינתן כי המכשיר מורכב שני חלבונים פלורסנט ברורים, תכונותיהם פלורסצנטיות כמו תשואה קוונטית, חיים, ומתקפלים עשויים להיות מושפעים באופן שונה סוגי תאים שונים. לכן, זה חיוני כדי לכלול דגימות שטופלו התנאים מאגר nigericin וכדי להשתמש בהם כדי לייצר עקומת כיול חדש עבור כל סוג התא בכל משפט. על מנת למזער את מקורות נוספים עבור השתנות, שמירה על כל התנאים עקבי במהלך דימות מודגשת. דוגמאות בתנאים מאגר nigericin צריך להיות מוכן, עם תמונה באותו יום כמו אלה התנאי מאגר ביקרבונט ההכנה ותמונה רכישת כל דוגמאות יש לשמור עקבי ככל האפשר. זה חשוב כי המדידות פי מבוססים על השוואה בין קבוצות תמונות, הבדלים אז ניסיוני המשפיעות על הגילוי של mCherry pHluorin אחד או יותר של ערכות התמונה עשויה להקטין את הדיוק של הערכות-פי. גורמים כגון שינויים בהגדרות מתח של הצינורות האופטיקה (אם משתמש לייזר קונפוקלי סורק) או פעמים חשיפה (אם משתמשים דיסק מסתובב קונאפוקלית) או עדשה מלוכלך מקטין את כמות האור להגיע למצלמה, תשפיע על תוצאות . אבל יש מספר עצום של גורמים אחרים יותר עדין עשוי להשתנות היומיומית, עשויה גם להשפיע על התוצאות, כגון אם הזבובים הם מוזן היטב, הגיל של הזבובים ולאחר כמה הלייזרים זמן על לפני הדמיה. הכנת הדמיה כל שלושה תנאים באותו יום ממזער את ההבדלים הללו, ובכך יפיקו את התוצאות הכי עקבי. ראוי לציין, בכל פעם העברנו מיקרוסקופ חדש או רכיבים של המיקרוסקופ שודרגו, היה צורך reoptimize את ההגדרות על הציוד החדש. לעיתים קרובות כתוצאה מכך שינוי הערכים ממוצע של מדידות אבל, כל עוד עקומות כיול חדשים נוצרו בכל ניסוי, השינויים בציוד הייתה השפעה מינימלית על פי ההערכות. בנוסף, ההשוואה הרלוונטית לעיתים קרובות בין סוגי תאים שונים בתוך הרקמה זהה (למשל, FSCs, תאים pFCs ואת זקיק), ולכן הם פנימי נשלטת וריאציות ניסיוני.
למרות פרוטוקול זה התמקדה מדידה פי רקמת wildtype, המתודולוגיה הוא תואם בשיטות הרגילות דרוזופילה מניפולציות ביטוי גנים, כגון הביטוי של RNAi או של transgene באמצעות UAS/Gal4, וניתוח פסיפס. מאז mCherry::pHluorin נדחף על ידי יזם UAS זה תמיד יהיה ביטוי במשותף עם RNAi או transgene, MARCM18 יכול לשמש כדי ליצור שיבוטים מוטציה homozygous עם mCherry::pHluorin כמו דה מרקר המשובטים. מהסיבות שתוארו לעיל, רקמת wildtype צריך להיות מנותח כפקד לצד כל משפט עם גנוטיפ מוטציה. לבסוף, ניתן להחיל את עקרונות כלליים המתוארים כאן על השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי ברקמות אחרות גם כן. אכן, פרוטוקול זה מקורי עבור שימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי ב העין דרוזופילה 7פרוטוקול, השתמשנו מתודולוגיה דומה כדי תמונה mCherry::pHluorin במוח זחל. בסך הכל, הכלים והשיטות המתוארים כאן מספקים הזדמנויות חדשות לחקור פונקציות מגוונות רבות של pHi ויוו בתוך רקמת חי, ללא פגע.

מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות3, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .
כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי8. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.
כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית12 , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה15,germarium16. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק2. חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fly Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act-Gal4 flipout stock</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Buffer preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7088</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP362</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C21421</td>
			<td>0.25 mg/ml dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and mounting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9473431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 23-gauge syringe needles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z192457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 40 mM glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12545C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-D mounting chamber</td>
			<td>custom manufactured</td>
			<td></td>
			<td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-620-183A</td>
			<td>Model: Accumet AB15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>0H11436</td>
			<td>Model: SZ2-ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&#215; objective with a numerical aperture of 1.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

שינויים ב- pH תאיים (פי) תפקיד חשוב בוויסות תאיים רבים, כולל מטבוליזם, התפשטות של בידול. בדרך כלל, דינמיקה פי נקבעים בתאים בתרבית, אשר נתונות מדידה וטיפול השפעול pHi. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיות וכלים חדשים איפשרה בחקר דינמיקה פי בתוך רקמת ללא פגע, בשידור חי. דרוזופילה מחקר, פיתוח חשוב אחד היה הדור של קו הטרנסגניים נושאת ביוסנסור על פי, mCherry::pHluorin. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בהם אנו עושים שימוש שגרתי הדמיה ovarioles דרוזופילה בשידור חי כדי למדוד את פי בשושלת זקיק אפיתל תאי גזע (FSC) בקווים הטרנסגניים פראי סוג mCherry::pHluorin; עם זאת, בשיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות בשביל לרקמות אחרות, כולל דיסקים כנף עין האפיתל. אנו מתארים שיטות לביטוי mCherry::pHluorin בשושלת FSC, שמירה על רקמות השחלה במהלך חיים הדמיה, ואת רכישת וניתוח תמונות כדי להשיג פי ערכי.

כאן תארנו את התהליך של מדידת פי בתוך האפיתל זקיק, אשר כרוך במספר שלבים. ראשית, השחלות הן גזור מהזבובים של גנוטיפ המתאים באמצעות כלים לנתח, הרכבה (איור 1). Ovarioles ואז הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות כמותית, הדימויים מנותחות לקבל מדידות של פי פי. עבור כל תמונה, סוגי תאים עניין מזוהים כמתואר בסעיף 3.1 (איור 2). היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים GFP, mCherry מומר על פי ערכים באמצעות עיקול רגיל (איור 3 א), כפי שמתואר בסעיף 3.2. באמצעות שיטה זו, מצאנו שאת פי עולה עם בידול בשושלת מוקדם FSC, מ- 6.8 ב FSCs, אל 7.0 בתאים prefollicle, כדי 7.3 בתאים זקיק (איור 3B). פי הערכים של כל סוג התא יכול להיות מיוצג מבחינה גרפית, כמו באיור 3B, או כמו מיקרוסקופ pseudocolored המציג את ההבדלים pHluorin אל mCherry יחס (איור 4 , איור 5). בתמונות האלה, הבדלים pHluorin אל mCherry יחס מוצגים ההבדלים בצבע, כמוגדר פבואר. חשוב לבחור LUT ואת הערכים מינימלי ומקסימלי של טווח הצבעים לייצר דימוי זה נציג רוב הנתונים. למרות זאת, באופן כללי, הבחירה של הגדרות LUT וטווח לא ייתן את המראה של הבדלים שלא נמצאים בתמונה, מבחר LUTs פחות מתאים עשוי לטשטש הבדלים פי נוכח micrograph (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig1.jpg"> 
איור 1: חומרים עבור ניתוח מכשירי הרכבה דרוזופילה ovarioles. (א) תמונה מראה: (1) לק; (2) עצה גריז, כוס כימית, pipet ואקום המשמש להחלת גריז; (3) 23-מד מזרק מחטים; (4) דומונט Inox מלקחיים, גודל 5; (5) 3D מודפס לחדר הרכבה; (6) 22 X 40 מ מ coverslips זכוכית דקה; (7) סביב coverslips זכוכית דקה, בקוטר 12 מ מ, 0.13-0.16 מ"מ עובי; (8) 9-ובכן זכוכית לנתח מאכל. (B) א תמונה של צילום המקרוב של תא הרכבה מודפס 3D. (ג) תמונה המציגה זוג wildtype שחלות והטרף. (ד) תמונה מראה מופרדים היטב ovarioles. (E) של תמונה של החדר 3D עם שחלות והטרף מותקן תחת coverslip זכוכית עגול. הנקודות השחורות הן טיפות לק נהגו להחזיק את coverslip עגול במקום. Coverslip הזכוכית (F) תמונה של ovarioles גזור מתחת סיבוב לאחר הרכבה. הקופסה השחורה מציינת אזור בתמונה עם ovariole גזור יחיד. סולם העמודות מייצגות כ 500 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig2.jpg"> 
איור 2: זיהוי FSCs, pFCs ותאים זקיק. שתי דוגמאות germaria עם UAS-mCherry::pHluorin ו- 10930 Gal4 מוכתם Concanavilin-א רועי בהתוויית FSC של טוראי ראשון, תא זקיק מוצג כל תמונה. עוצמות קרינה פלואורסצנטית רשע בערוצים pHluorin ו- mCherry משמשים כדי לחשב את pHluorin אל mCherry יחס. סולם העמודות מייצגות כ 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig3.jpg"> 
איור 3: פי עולה במהלך התמיינות בשושלת FSC. נציג התוצאות שנלקחו Ulmschneider. et al. 2 מראה: עקומה (A) רגרסיה ליניארית טיפוסית המשמשת לחישוב ערכי pH מ pHluorin כדי mCherry יחסי; וערכים (B) פי מחושב עם 95% מרווחי ביטחון FSCs, pFCs ותאים זקיק. איור זה היה מותאם לאחר אישור, Ulmschneider. et al. 2. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig4.jpg"> 
איור 4: שימוש פיג'י כדי להפיק תמונה רציומטרי pseudocolored. תמונות (A) מציג את התוצאות של כל שלב בתהליך חיסור רקע. החל מתמונה שלא עובדו (לוחות שמאלה), הצעד הראשון הוא להגדיר את גבולות הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע אינם נכללים. הגבול העליון של הסף נקבע ל מרבי. פיג'י צבע הפיקסלים נשלל כחול, ונוצרת תמונה עם רקע כחול, של germarium נראה בבירור (לוחות האמצעי). שימו לב, שלב זה הוא אופציונלי. השלב השני הוא לצייר רועי בחלק של התמונה ללא האות (ריבועים אדומים פאנלים האמצעי), מידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית אומר רועי, ואת הפחת את הכמות כזו של התמונה כולה, וכתוצאה מכך רקע המופחת תמונה (לוחות נכון). השלב השלישי הוא להשתמש בפונקציה חישוב התמונה כדי לחלק את התמונה בערוץ pHluorin לפי התמונה בערוץ mCherry. התוצאה תהיה תמונה המוצגת עם טבלת בדיקת המידע ' אפורים ' והגדר ערכי התצוגה של התמונה כדי להקיף את כל הטווח הדינמי שמספק עומק סיביות של התמונה. השלב הסופי הוא כדי לכוונן את הגדרות התצוגה של התמונה אל טווח יותר מתאים בחר טבלת בדיקת מידע. (B) תמונות לדוגמה מראה את התוצאה של חישוב תמונה עם המינימום להציג ערך מוגדר 0 וערך התצוגה מרבי מוגדר כ- 2.5 באמצעות ארבע טבלאות בדיקת מידע שונים. המלבן ליד כל תמונה מראה הצבעים על פני הטווח הדינמי המשמשים כל טבלת בדיקת מידע. שים לב כי חילו, 16 צבעים של תרמית, שצבעים שונים משמשים הפיקסלים בעוצמה שערכו 0 או מקסימום (למשל, כחול ואדום, בהתאמה, בהילו). זה מספק עזר חזותי קל גבולותיו של הטווח הדינמי, ומאפשר לצופה לראות האות בתוך הטווח הדינמי. (ג) מסך ירה מציג את האפשרויות שנבחרו בשעת ייבוא קובץ לתוך ImageJ באמצעות יישום plug-in ייבוא של ביו-תבניות. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
לאס = "jove_content" fo:keep-together.within-דף = "1" ><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56316/56316fig5.jpg"> 
איור 5: הגדרת התמונה ערכי תצוגה של תמונות רציומטרי pseudocolored. יש להגדיר את ערכי התצוגה של התמונה המינימלי והמקסימלי כך האות בתמונות מן התנאי ביקרבונט, כמו גם בין שני התנאים nigericin הם בתוך הטווח הדינמי. כדי להמחיש נקודה זו, שתי תמונות מכל שלושת התנאים מוצגים עם ארבע הגדרות התצוגה תמונה שונה (0-0.5, 0-1, 0-2.5 ו- 0-5) באמצעות טבלת בדיקת המידע תרמי. שים לב כי עבור כל שלושה תנאים ניסיוני, התמונות מוצגות עם ערכת הערך המוצג המרבי ל 0.5, הרבה של האות ליד או מקסימום בסולם ערכי צבע מוחלטים, כאשר זה מוגדר כ- 5.0, הרבה של האות ליד מינימום על הצבע או סולם imetric. בשני המקרים הללו, ההבדלים pHluorin יחס mCherry על פני הרקמה לא יכול להיות בקלות מוערכת אז הגדרות אלה אינן אידיאלי. לעומת זאת, ערכי תצוגה המרבי של 1.0 או 2.5 מתאימים יותר. עם הגדרות אלו, ניתן להערכה הבדלי יחסי על פני הרקמות בקלות, האותות של תמונות של כל שלושת התנאים ניסיוני מוצגים צבעים שנמצאים בתוך הטווח הדינמי של הסולם ערכי צבע מוחלטים. סולם העמודות מייצגות כ 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56316/56316fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Views.  University of California, San Francisco. אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכ?...

Video: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...