Reconhecemos o apoio prestado pelas oficinas e a instalação animal do Instituto de Neurofisiologia. Este trabalho foi apoiado por Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune e Deutsche Stiftung für Herzforschung.

O manuseio de animais deve ser conforme às diretrizes do comitê local de bem-estar animal e à Diretiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu. 1. Prepare Soluções <ol><li> Preparar a solução de Tyrode sem Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monoxime (BDM) 30. Ajustar o pH para 7,4 Com NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução de Tyrode com Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH a 4 ° C. </li><li> Prepare 4% de agarose com baixo teor de fusão: Coloque 0.6 g de agarose com baixo teor de fusão em 15 mL de solução de Tyrode sem Ca 2+ . Aqueça a mistura em um forno de microondas duas vezes a 750 W por 10-15 s até que a agarose seja dissolvida. Mantenha a solução a uma temperatura constante de 37 &amp;# 176; C e mexa continuamente. </li><li> Mantenha o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) sem soro a 37 ° C com borbulhante com 5% de CO 2 , 95% de O2). </li></ol> 2. Prepare o Microtome <ol><li> Ligue o microtome. </li><li> Encha a câmara externa do microtomo com gelo. </li><li> Preencha a câmara interna do microtomo com solução de Tyrode gelada sem Ca 2+ e oxigene continuamente a solução com 100% de O2. </li><li> Coloque uma lâmina de aço no suporte da lâmina do microtomo. </li></ol> 3. Isolamento do coração do mouse <ol><li> Injete 2,500 U de heparina por via subcutânea. Aguarde 15 min. </li><li> Sacrifique o animal pela luxação cervical. </li><li> Abra o tórax por esternotomia. </li><li> Dispare cuidadosamente o pericárdio usando pequenas tesouras e uma pinça # 5. </li><li> Inserir uma cânula na aorta ascendente e perfundir as artérias coronárias in situ com o gelo TyrodeSolução sem Ca 2 + até o sangue restante ser removido. </li><li> Respete suavemente o coração com uma pinça e uma tesoura e transfira o coração na solução gelada de Tyrode montada sem Ca 2+ . </li><li> Separe os átrios dos ventrículos com um bisturi ou uma tesoura. </li></ol> 4. Incorporação dos Ventrículos em 4% de Agarose com baixo ponto de fusão <ol><li> Coloque os ventrículos com o ápice voltado para cima no molde de agarose ( Figura 1 ). Coloque o pino no meio do molde na câmara ventricular esquerda. </li><li> Encha o molde com 4% de agarose de baixo teor de fusão a 37 ° C, até que o coração esteja completamente coberto. </li><li> Coloque o molde no gelo para um endurecimento mais rápido da agarose, evitando a flutuação do tecido. </li><li> Remova o bloco de agarose contendo os ventrículos do molde com um bisturi. </li><li> Gire o bloco de cabeça para baixo e cubra as câmaras ventriculares e o espaço na parte traseira do bloco de agarose, que euS deixado pelo pino da muda, com 4% de agarose de baixo teor de fusão usando uma seringa com uma agulha de 20 G. </li><li> Corte o bloco de agarose com um bisturi para conseguir um fundo plano do bloco e posição vertical do ápice cardíaco. </li></ol> 5. Cortando o tecido ventricular <ol><li> Corrija o bloco no suporte de amostra do microtome com uma gota de cola de cianoacrilato. Enfrente o ápice cardíaco para cima. </li><li> Coloque o suporte de amostra na câmara de amostra interna do microtomo, que é preenchido com Tyrode gelado sem Ca 2+ . Cubra completamente o bloco de agarose com a solução de Tyrode. </li><li> Prepare fatias de eixos curtos com uma espessura de 150-400 μm, dependendo da aplicação adicional (para gravações de eletrodos afiados de 150-200 μm), mantenha a freqüência de vibração da lâmina a 60-70 Hz e mova a lâmina para frente o mais rápido possível . </li><li> Use uma escova fina para remover cuidadosamente a agarose restante das fatias. </li><li> Gentilmente transfeR fatiga com uma pipeta Pasteur na solução de Tyrode com Ca2 + 0,9 mM arejado com 100% de O2 e armazená-los durante pelo menos 30 minutos em gelo para recuperar do processo de corte. </li><li> Depois, mantenha as fatias durante 30 min em DMEM a 37 ° C, arejado com carbógeno, para lavar o BDM antes de continuar a usar. </li></ol> 6. Preparando a Configuração do Eletrodo Sharp <ol><li> Para pré-aquecimento, ligue todos os dispositivos elétricos 30 min antes do início das gravações. </li><li> Coloque um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento colocada no microscópio invertido. </li><li> Coloque o eletrodo de anel personalizado ( Figura 2 ) no prato e conecte os fios de aterramento do pré-amplificador e o eletrodo de estimulação. </li><li> Ligue os tubos flexíveis do sistema de perfusão ao prato. </li><li> Encha o reservatório do sistema de perfusão com DMEM, arejado com carbógeno. </li><li> Ligar a bomba de perfusão e ajustar a perfusãoA 2-3 mL / min. </li><li> Ajuste a temperatura do DMEM no prato a 37 ° C, regulando o aquecedor de fluxo e a placa de aquecimento. </li></ol> 7. Gravações de Ação Potencial <ol><li> Coloque uma fatia ventricular no prato cheio de DMEM. </li><li> Verifique a integridade estrutural e a viabilidade (com base na função contrátil) do tecido com o microscópio invertido. </li><li> Preencha um eletrodo de vidro de gravação com KCL de 3 M. </li><li> Preencha um eletrodo de estimulação com DMEM. </li><li> Coloque o eletrodo de gravação e o eletrodo de estimulação nos suportes dos eléctrodos. </li><li> Coloque o eletrodo de estimulação cuidadosamente na fatia e ligue o estimulador elétrico. Comece com uma frequência de estimulação de 1-2 Hz. </li><li> Mova o eletrodo de gravação com o micromanipulador sobre a posição de gravação pretendida. </li><li> Abaixe lentamente o eletrodo de gravação até a ponta tocar o tecido. </li><li> Aplique um curto impulso elétrico retangular através doGravação de eletrodo para penetrar a membrana celular. </li><li> Desconexe cuidadosamente o eletrodo de gravação até garantir um sinal estável. </li><li> Comece a gravar os potenciais de ação. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

As fatias ventriculares permitem estudos eletrofisiológicos, farmacológicos e mecânicos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e acesso direto da tecnologia de medição a todas as regiões do coração. As propriedades potenciais de ação fisiológica foram demonstradas em fatias embrionárias, neonatais e adultas 9 , 10 , 11 . A vitalidade das fatias, com exceção das camadas superficiais diretamente danificadas pelo procedimento de corte, foi confirmada pela coloração da vitalidade 9 . As gravações de potencial de ação dentro das fatias usando eletrodos de vidro afiados podem ser usadas para investigar a integração e maturação de cardiomiócitos transplantados como descrito aqui, ou para estudos farmacológicos após a adição de compostos cardioativos. As gravações de longo prazo com duração de uma hora ou mais em uma célula individual são possíveis. Esta duração da gravação é suficiente para testarO impacto de diferentes compostos farmacológicos em uma célula por perfusão sequencial e lavagem. Passos de preparação crítica Para otimizar a qualidade da fatia, o dano tecidual isquêmico deve ser evitado. Portanto, a perfusão do coração in situ com a solução de Tyrode, ressecção rápida do coração e preservação imediata na solução de Tyrode oxigenada e gelada são considerados cruciais. A imobilização do coração batendo usando monoxime de 2,3-butanodiona pode ainda reduzir a susceptibilidade à isquemia e é necessária para uma incorporação sólida em agarose de baixo teor de fusão. A incorporação de agarose de baixo teor de fusão pode dificultar o fornecimento de tecido por limitação da difusão, mas é essencial para estabilizar o tecido do coração suave antes de cortar. Pequenas cavidades dentro do bloco de espécimes, por exemplo , câmaras ventriculares não preenchidas completamente com agarose ou bolhas de ar remanescentes, podem dificultar a estabilização do tecido. O tecido miocárdico não estabilizado não oferece resis suficientePara a lâmina vibratória, o que provoca graves rupturas e danos nos tecidos. Para garantir um corte claro e minimizar os danos nos tecidos, as lâminas devem ser afiadas ( ou seja, não reutilizadas mais do que três vezes), e o movimento para a frente da lâmina através do bloco da amostra deve ser o mais lento possível, uma vez que as lâminas opacas ou o excesso de velocidade podem afrouxar Ventrículos embutidos ou lacerar o tecido. Para garantir resultados confiáveis ​​e reprodutíveis, a qualidade das fatias deve atender a critérios específicos, incluindo a integridade estrutural do tecido, que pode ser confirmada por microscopia e resposta à estimulação elétrica em freqüências de batimento fisiológico até 10 Hz. As fatias podem ser cortadas com uma espessura de 150-400 μm, dependendo da aplicação adicional. Enquanto fatias mais finas podem evitar condições hipóxicas no núcleo do tecido e permitem a detecção mais fácil de células transplantadas com um microscópio de fluorescência, bem como um posicionamento mais preciso deOs eletrodos de gravação 15 , fatias mais espessas podem proporcionar uma melhor integridade da estrutura do tecido e uma maior estabilidade do tecido, o que será vantajoso para medidas de força 10 e processamento histológico posterior após gravações. Para evitar potenciais influências das altas concentrações de BDM nos canais iónicos e proteínas de manuseio de Ca 2 + 16 , 17 , lavagem de BDM por incubação de fatias em DMEM livre de BDM durante pelo menos 30 min antes de recomendar o uso adicional. Surpreendentemente, a contração e o movimento subseqüente do tecido após o lavado BDM não impedem registros afiados de eletrodos. Limitações Em contraste com os modelos comuns de cultura celular, as fatias fornecem uma estrutura de tecido intacta, incluindo conexões celulares e celulares preservadas, matriz extracelular e distribuição de cardiomiopatiaTes e não miócitos dentro do tecido nativo 6 . No entanto, as fatias de tecido cardíaco não correspondem exatamente à situação in vivo , uma vez que são apenas de 150 a 400 μm de espessura, fornecidas por meio artificial e podem ser danificadas durante o processo de preparação. A coloração com azul de Trypan e a avaliação imuno-terapêutica do caspase-3 ativo e do fragmento PARP p85 revelaram que as células dentro das fatias embrionárias, exceto aquelas nas camadas superficiais, eram viáveis ​​após o corte 9 . O sistema de condução não é preservado em fatias ventriculares, e a propagação de excitação é bidimensional em vez de tridimensional nas fatias planas. As fatias de corações embrionários mostram espancamento espontâneo por até duas semanas em cultura 9 . Também podem ocorrer contrações espontâneas de fatias adultas, e não está claro se elas são induzidas por células do sistema de condução ou podem indicar danos celulares e Ca 2+ overlOad 18 . Aplicações futuras Além de estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados e arrays de microeletrodos, que podem ser utilizados para experimentos farmacológicos para analisar o impacto de drogas sobre propriedades potenciais de ação e propagação de excitação 11 , estudos de desenvolvimento 19 ou caracterização de cardiomiócitos transplantados 15 como mostrado acima, fatias ventriculares de neonatal Os corações foram utilizados para medidas de contração forçada 10 , que também podem ser aplicadas em fatias adultas. Outras aplicações futuras potenciais incluem (I) estudos de microscopia de longo prazo em fatias cultivadas, por exemplo , para avaliar a integração estrutural de cardiomiócitos derivados de células estaminais injetadas, (II) injeção de corantes permeáveis ​​de junção gap para estudos de acoplamento intercelular investigados (III) de endotélias E função vascular da coronaDentro das fatias. Em conclusão, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso com estrutura in vivo preservada, o que pode ajudar a superar as limitações dos modelos comuns de cultura celular e é aplicável a uma ampla gama de estudos farmacológicos, fisiológicos, de desenvolvimento e de terapia celular.

As fatias de tecido fino têm sido utilizadas com freqüência na ciência básica, uma vez que Yamamot e Mcllwain mostraram em 1966 que a atividade elétrica de fatias de cérebro é mantida in vitro 1 . Desde então, estudos eletrofisiológicos e farmacológicos foram realizados em fatias do cérebro 2 , fígado 3 , pulmão 4 e tecido miocárdico 5 , 6 , 7 . As primeiras gravações de patch-clamp em fatias ventriculares de corações de ratos neonatais foram descritas em 1990 8 , mas essa técnica caiu no esquecimento por algum tempo. Mais de uma década depois, nosso grupo estabeleceu um novo método para preparar as fatias de coração de embrião murino 9 , neonatal 10 e adulto 11 . Estas fatias de tecido viáveis ​​podem ser usadas para experiências agudas (fatias adultasS podem ser cultivadas por várias horas) ou experiências culturais de curto prazo (fatias embrionárias e neonatais podem ser cultivadas por alguns dias). As fatias mostram in vivo como características eletrofisiológicas e uma dispersão de excitação homogênea conforme avaliado pelo potencial de ação de eletrodo afiado e gravações de microeletrodos 11 . Devido à sua morfologia &quot;bidimensional&quot;, eles permitem o acesso direto dos eletrodos de gravação a todas as regiões do ventrículo, o que os torna uma ferramenta interessante para investigações eletrofisiológicas e levanta novas opções experimentais em comparação com os corações inteiros de perfumes de Langendorff. A resposta ao fármaco das fatias aos bloqueadores dos canais iônicos, como o verapamil (bloqueador de canal Ca 2+ ), lidocain (bloqueador de canais de Na + ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal K + não -seletivo dependente da tensão) e linopirdina (KCNQ K + -Bloqueador de canal) 9 , 11 </suP&gt; correspondeu a efeitos conhecidos em cardiomiócitos dissociados. As medidas da força isométrica revelaram uma relação de freqüência de força positiva e sugeriram fortemente a função contrátil intacta 10 . Esses achados demonstraram que as fatias ventriculares murinas são adequadas como um modelo de tecido in vitro para estudos fisiológicos e farmacológicos. Além disso, as fatias ventriculares de corações receptores em combinação com gravações afiadas de eletrodos provaram ser uma ferramenta muito útil para caracterizar a integração elétrica e mecânica, bem como a maturação dos 12 cardiomiócitos transplantados 12 , 13 , 14 e derivados de células-tronco. Em resumo, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso e bem estabelecido e devem ser consideradas complementares a cardiomiócitos dissociados e corações perfundidos por LangendorffNa pesquisa cardiovascular, com a principal vantagem de fornecer uma estrutura de tecido in vivo (em contraste com células dissociadas), bem como acesso direto de tecnologias de medição, como gravações de eletrodos afiados para todas as regiões do coração (em contraste com preparações de coração inteiro).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtome with vibrating blade.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blades</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; size 6 (4/32&quot;)</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Preparation table</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>Molt for embedding ventricles in agarose</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small scissor</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen gas (medical grade O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low magnification Micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>High magnification, three-axis micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic perfusion pump</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-channel temperature controller</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Os cardiomiócitos murinos têm sido amplamente utilizados para estudos in vitro de fisiologia cardíaca e novas estratégias terapêuticas. No entanto, as preparações multicelulares de cardiomiócitos dissociados não são representativas da estrutura complexa in vivo de cardiomiócitos, não miocitos e matriz extracelular, que influencia as propriedades mecânicas e eletrofisiológicas do coração. Aqui descrevemos uma técnica para preparar fatias ventriculares viáveis ​​de corações de mouse adultos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e demonstrar sua adequação para gravações eletrofisiológicas. Após a excisão do coração, os ventrículos são separados dos átrios, perfundidos com solução livre de Ca2 + contendo monoxime de 2,3-butanodiona e incorporados em um bloqueio de agarose com baixo teor de fusão a 4%. O bloco é colocado em um microtomo com uma lâmina vibratória, e fatias de tecido com uma espessura de 150-400 μm são preparadas mantendo a vibração freDa lâmina a 60-70 Hz e movendo a lâmina para a frente o mais lentamente possível. A espessura das fatias depende da aplicação adicional. As fatias são armazenadas na solução de Tyrode gelada com Ca2 + 0,9 mM e monoxime de 2,3-butanodiona (BDM) durante 30 min. Depois, as fatias são transferidas para DMEM a 37 ° C durante 30 min para lavar o BDM. As fatias podem ser usadas para estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados ou arrays de microeletrodos, para medidas de força para analisar a função contrátil ou para investigar a interação de cardiomiócitos derivados de células estaminais transplantadas e tecido hospedeiro. Para gravações de eletrodos afiados, uma fatia é colocada em um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento de um microscópio invertido. A fatia é estimulada com um eletrodo unipolar, e os potenciais de ação intracelular de cardiomiócitos dentro da fatia são registrados com um eletrodo de vidro afiado.

O infarto do miocárdio leva a uma perda praticamente irreversível de cardiomiócitos. A terapia de reposição celular com cardiomiócitos derivados de células estaminais para regeneração cardíaca exógena é uma abordagem terapêutica promissora. A integração e a maturação elétrica das células transplantadas são cruciais para a segurança e eficiência da terapia de reposição celular. Para avaliar a integração e maturação, transplantamos cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCM, 2 injeções de 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) expressando proteína fluorescente verde melhorada (eGFP) em corações saudáveis ​​de camundongos adultos (ver Peinkofer et al. Para uma descrição detalhada dos métodos 15 ). Seis dias após o transplante, as fatias ventriculares dos corações receptores foram preparadas usando o protocolo descrito. Uma gravação representativa é mostrada emFigura 3. Uma fatia contendo iPSCM transplantado foi colocada em DMEM a 37 ° C e estimulada focalmente por um eletrodo unipolar colocado no tecido hospedeiro ( Figura 3A , esquerda). Os potenciais de ação intracelular foram registrados com microeletrodos de vidro afiados preenchidos com KCl 3 M em iPSCM transplantado de eGFP positivo e tecido hospedeiro vizinho dentro das fatias ( Figura 3A , direita). A persistência ea integração elétrica de iPSCM transplantado em corações receptores poderiam ser demonstradas. O iPSCM foi considerado eletricamente integrado, se uma interdependência temporal de artefatos de estimulação e potenciais de ação registrados intracelularmente em cardiomiócitos transplantados estava presente ( Figura 3B ). A qualidade da integração elétrica pode ser quantificada pelo atraso da ativação elétrica, ou seja , o atraso entre o estímulo e o início do processo.Ataque de potencial de ação e a freqüência de estimulação máxima sem blocos de condução, ou seja , a freqüência de estimulação máxima que leva a uma geração de potenciais de ação de 1: 1 após cada estímulo. O iPSCM transplantado neste experimento representativo foi eletricamente integrado, como indicado por uma freqüência de estimulação máxima sem blocos de condução de cerca de 5 Hz ( Figura 3B , direita), mas a qualidade do acoplamento não foi tão boa quanto dentro do tecido hospedeiro conforme indicado pelo longo Atraso entre artefato de estimulação e aumento de ação potencial (tecido do hospedeiro: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Os potenciais de ação dos cardiomiócitos hospedeiros tiveram amplitude de 84 mV, potencial diastólico máximo de -74 mV, duração de 11 ms com repolarização de 50%, duração de 108 ms com repolarização de 90% e velocidade de movimento ascendente de 114 V / s. Aumentar a freqüência de estimulação de 1 a 5 Hz leva a uma diminuição do potencial de ação duratIon em 90% de repolarização (86 ms). O iPSCM transplantado mostrou diferenças significativas nas propriedades de potencial de ação. Em comparação com as células hospedeiras, a amplitude foi menor (53 mV), potencial diastólico máximo menos negativo (-54 mV), duração a 50% de aumento de repolarização (14 ms), duração a 90% de repolarização menor (90 ms) e velocidade ascendente Mais lento (57 V / s). Um aumento na frequência de estimulação de 1 a 5 Hz causou uma diminuição da duração do potencial de ação em 90% de repolarização (67 ms). Em conclusão, neste exemplo representativo aos 6 dias após o transplante, o iPSCM analisado mostrou características típicas de cardiomiócitos imaturos. Este achado anedótico está em linha com as medidas em um número estatisticamente suficiente de células e preparações, que foram relatadas antes de 15 . <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> Figura 1: </Forte&gt; Molde feito sob encomenda para incorporar ventrículos em Agarose. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> Figura 2: Eletrodo de anel feito sob encomenda (terra) para gravações de eletrodos afiados. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> Figura 3: Integração elétrica do iPSCM transplantado . ( A ) Fatia de coração ventricular (esquerda) contendo iPSCM positivo eGFP (à direita). SE:Eletrodo de estimulação. Pontos vermelhos marcam a localização das gravações. ( B ) Gravações de potencial de ação em tecido hospedeiro saudável (traços superiores) e iPSCM transplantado (traços mais baixos). A fatia foi focalmente estimulada com um eletrodo de estimulação colocado no tecido do hospedeiro em torno de 2 Hz (vestígios esquerdos) e 5 Hz (traços certos). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis ​​de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .

Faixas de coração ventricular de eixo curto murino para estudos eletrofisiológicos

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K visualizações.  University of Cologne.  Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis ​​de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro . 

Vídeo: Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Neurociência

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Bioengenharia

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Medicina

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried out in large animals. Considering the complex anatomy of the heart, interspecies differences, and the types of compensatory and pathological reactions, consistent protocols are challenging to implement. The utilization of multiple dissection protocols is usually adapted to suit the prosector's experience, and personal preference continues to be a source of experimental and interobserver variability. Here, the aim is to present the main anatomical features and landmarks, dissection protocols, and histological sampling standards of the heart in some commonly used species (including dogs, pigs, ruminants, and cats) as models of cardiovascular diseases.
Two standard gross examination protocols are presented here. First, the inflow-outflow method, which follows the physiological blood flow direction through the heart and large vessels (frequently used in dogs, ruminants, and pigs), and second, the four-chamber dissection technique (exemplified in cats). Both techniques can be adapted to any species in certain experimental circumstances. The sampling protocols include all the areas of interest (sinoatrial node, ventricles, interventricular septum, atria, valves, and aorta), and if properly carried out, improve both the reproducibility and reliability of experimental studies.

Due to the complex anatomy, a consistently reproducible dissection and harvesting protocol for cardiac samples can be challenging to implement. This manuscript presents the key elements of some standard cardiac dissection protocols, highlighting both the gross examination approaches and the sampling sites commonly used for histopathologic examination.

Técnicas de Dissecção e Amostragem Histológica do Coração em Modelos de Grandes Animais para Doenças Cardiovasculares

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, an ex vivo way to cultivate myocardial slices obtained from human heart samples was demonstrated, while approaching in vivo condition of myocardial contraction. These samples originate mostly from heart transplantations or left-ventricular assist device placements. Using a vibratome and a specially developed cultivation system, 300 &#181;m thick slices are placed between a fixed and a spring wire, allowing for stable and reproducible cultivation for several weeks. During cultivation, the slices are continuously stimulated according to individual settings. Contractions can be displayed and recorded in real-time, and pharmacological agents can be readily applied. User-defined stimulation protocols can be scheduled and performed to assess vital contraction parameters like post-pause-potentiation, stimulation threshold, force-frequency relation, and refractory period. Furthermore, the system enables a variable pre- and afterload setting for a more physiological cultivation.
Here, we present a step-by-step guide on how to generate a successful long-term cultivation of human left ventricular myocardial slices, using a commercial biomimetic cultivation solution.

We present a protocol for ex vivo cultivation of human ventricular myocardial tissue. It allows for detailed analysis of contraction force and kinetics, as well as the application of pre- and afterload to mimic the in vivo physiological environment more closely.

Preparação do tecido miocárdio humano para cultivo a longo prazo

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Biologia

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

Source: Ou, Q. et. al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60913">Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

Geração de fatias ventriculares suínas: uma técnica baseada em vibratoma para preparar fatias ultrafinas de tecido cardíaco de porco

Source: Ou, Q. et. al., Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based ...