Financiamento concedido pela Universidade de Slippery Rock. Nós gostaríamos de agradecer T. Boron III (Slippery Rock University) e C. Haney (Universidade da Pensilvânia) para seus insights.

1. A hidrólise do complexo de Ni-base de Schiff <ol><li> Dissolve-se 1 mmol do complexo de Ni-PBP-base de Schiff em 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) com agitação num balão de 250 ml de fundo redondo à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 60 ml de solução aquosa de EDTA 0,2 M, pH 4,5. </li><li> Usando uma barra de agitação magnética e agitou-se placa, agita-se a solução combinada durante a noite. Como o complexo de base de Schiff é hidrolisado, a cor vai mudar de um vermelho escuro para branco. </li><li> Depois de se completar a reacção, conforme indicado pela ausência de qualquer coloração vermelha, transferir a reacção para um funil de separação de 250 mL. </li><li> Adicionar 50 mL de diclorometano, a tampa do funil de separação, e misturar. Drenar a lavagem orgânico em um copo de resíduos. Repetir este processo três vezes para remover PBP e qualquer complexo de Ni-PBP-base de Schiff residual. Recolher a camada aquosa restante em um balão de fundo redondo de 250 mL. </li></ol> 2. Protecção Fmoc de Hidrolisado de Aminoácidos <ol><li&gt; Ajustar a camada aquosa isolada a partir do passo 1.5 descrito acima para pH 7 utilizando bicarbonato de sódio sólido. Verificar o pH periodicamente usando tiras de teste do pH. </li><li> Adicionar 168 mg de bicarbonato de sódio (2,00 mmol, 2 equiv) à solução e agita-se utilizando uma barra de agitação magnética e agitar placa. </li><li> Dissolve-se 337 mg de éster hidroxisuccinimida de Fmoc N (1,00 mmol, 1 equiv) numa quantidade mínima de dioxano (cerca de 4 ou 5 mL) num frasco de 10 mL. Transferir esta solução à solução aquosa e agita-se durante a noite. </li><li> Depois de deixar a reacção a agitar durante a noite, acidifica-se a solução resultante para pH 2 com ácido clorídrico 1 M. Verificar o pH periodicamente usando tiras de teste do pH. </li><li> Transferir a mistura reaccional para um funil de separação de 250 ml e adicionar 50 ml de acetato de etilo. Tapar o funil de separação, misturar bem, e recolher a camada orgânica num frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Repetir este processo mais duas vezes, combinando-se os extractos orgânicos. Secam-se os extractos orgânicos combinados com cerca de 3 g de magnésio sulfate. </li><li> Concentra-se os extractos orgânicos combinados, utilizando um evaporador rotativo para proporcionar o aminoácido protegido com Fmoc em bruto. </li></ol>

<ol>
	<li>Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Enantio-+and+Diastereoselective+Mannich+Reactions+of+Chiral+Ni(II)+Glycinates+with+amino+sulfones.+Efficient+asymmetric+synthesis+of+aromatic+&#945;,&#946;-diamino+acids.">Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic &#945;,&#946;-diamino acids.</a> J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).</li><li>Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+synthesis+of+sterically+and+electronically+demanding+linear+&#969;,-trifluoromethyl+containing+amino+acids+via+alkylation+of+chiral+equivalents+of+nucleophilic+glycine+and+alanine.">Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear &#969;,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine.</a> J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).</li><li>Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+diastereo-+and+enantioselective+synthesis+of+syn-&#946;,-substituted+tryptophans+via+asymmetric+Michael+addition+of+a+chiral+equivalent+of+nucleophilic+glycine+and+sulfonylindoles.">Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-&#946;,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles.</a> Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).</li><li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+catalytic+synthesis+of+&#945;,-amino+acids+under+phase-transfer+conditions+with+a+novel+catalyst/substrate+pair.">Highly efficient catalytic synthesis of &#945;,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).</li><li>Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enantioselective+synthesis+of+2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl+glycine+derivatives+via+oxidative+cross-dehydrogenative+coupling+of+tertiary+amines+and+chiral+nickel(II)+glycinate.">Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate.</a> J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).</li><li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+&#945;,-amino+acids+via+asymmetric+phase+transfer-catalyzed+alkylation+of+achiral+nickel(II)+complexes+of+glycine-derived+Schiff+bases.">Synthesis of &#945;,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).</li><li>Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+large-scale+synthesis+of+picolinic+acid-derived+nickel(II)+complexes+of+glycine.">Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine.</a> Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).</li><li>Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+syntheses+of+Fmoc-protected+non-proteogenic+amino+acids:+useful+building+blocks+for+combinatorial+libraries.">Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries.</a> Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).</li><li>Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;One-pot&amp;#34;,+preparation+of+N-carbamate+protected+amino+acids+via+the+azide.">&amp;#34;One-pot&amp;#34;, preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide.</a> Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).</li><li>Hart, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).</li><li>Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+convenient+synthesis+of+tert-butyl+ethers+of+Fmoc-serine,+Fmoc-threonine,+and+Fmoc-tyrosine.">Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine.</a> J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).</li><li>Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-turnover+isotopic+labeling+of+Fmoc-+and+Boc-protected+amino+acids+with+oxygen+isotopes.">Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes.</a> Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).</li><li>Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+building+blocks+for+solid-phase+synthesis+of+&#945;,-peptide-&#946;,-peptoid+chimeras.">Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of &#945;,-peptide-&#946;,-peptoid chimeras.</a> Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito acima é útil na sua capacidade para facilitar o isolamento de um esqueleto de aminoácidos a partir de um complexo de Ni-base de Schiff em condições de pH leves e subsequente protecção Fmoc deste aminoácido isolado por meio de dois passos críticos. O primeiro passo envolve a agitação de uma solução de DMF / água contendo EDTA para facilitar a libertação do aminoácido a partir do complexo. Residuais subprodutos orgânicos complexos ou pode ser facilmente removido com extracção. O segundo passo deste protocolo envolve uma protecção Fmoc do aminoácido que se encontra na camada aquosa após isolamento por extracção no primeiro passo. Demonstrámos a possibilidade de modificar este procedimento em um intervalo de pH 4,5-7,5, permitindo uma flexibilidade significativa que pode ser necessária para alguns grupos de protecção de cadeia lateral sensível a pH. Uma limitação potencial desta técnica é a baixa concentração de reacção de protecção Fmoc do aminoácido isolado. Como facilitando ehidrólise ficiente requer vários equivalentes de EDTA em relação ao substrato, as condições reaccionais requerem uma solução aquosa quantidade significativa de EDTA (60 ml de uma reacção de 1 mmol de escala). Usando este volume de solvente numa resultados de protecção com Fmoc de uma concentração relativamente baixa (~ 0,015 M) de reagentes. Enquanto uma reacção de prova de conceito utilizando estas condições produziu o produto com um rendimento de 55% promissor apesar das condições de reacção diluída, pode ser necessário aumentar esta concentração quando se utiliza aminoácidos com reduzida nucleophilicty relação à glicina, resultante do aumento do volume estérico. Em resumo, demonstrámos a utilidade do EDTA para promover a hidrólise de um complexo de base de Schiff-Ni normalmente usado para a síntese de SAU de. Estas condições de hidrólise não requerem a condição fortemente ácida típico para estas hidrólises, permitindo a retenção de grupos ácido-lábil de protecção da cadeia lateral. Experimentos futuros devem se concentrar em aplicar tsua estratégia geral para uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais. Trabalho nesse sentido está em curso.

Os aminoácidos não naturais cadeias laterais de rolamento (de UAA) que variam desde aqueles dos vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente encontrados na natureza têm encontrado utilidade numa vasta gama de aplicações. Síntese destes UAA de, no entanto, pode ser difícil, dependendo da estrutura das cadeias laterais e a estereoquímica do esqueleto de aminoácidos. CH activação ligação de glicina no contexto de um complexo de base de Schiff de níquel tem sido usada para produzir uma variedade de derivados de amino ácidos incluindo α, ácidos p-diamino 1 e rolamento da UAA fluorado 2 ou cadeias laterais heterocíclicas. 3 Após a adição de cadeias laterais não naturais, funcionalizado UAA de são tipicamente removidos a partir do complexo de base de Schiff por refluxo em ácido clorídrico 4 e são, subsequentemente, isolado usando cromatograf ia de permuta iónica. Embora geralmente eficiente, este gera um protocoloácidos mino que podem ser inadequados para utilização na sintese de péptidos em fase sólida (SPPS). A natureza da SPPS requer a presença de grupos ácido-lábil de protecção da cadeia lateral e a natureza fortemente ácida de condições típicas de decomposição de Ni-base de Schiff impede isolamento de SAU de com estes grupos protectores intactas. Para nosso conhecimento, apenas um método de decomposição alternativa tem sido relatada: utilização do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e de hidrazina a temperaturas elevadas, 5 condições que se não pode ser adequado para algumas das cadeias laterais grupos protectores tais como ftalimidas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig1.jpg" /> Figura 1: Síntese de Ni-PBP-Gly a partir de Ni 2+, PBP, e glicina (Gly). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55677/55677fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </a&gt; Relata-se um método para a hidrólise de um complexo de Ni-base de Schiff, Ni-PBP-Gly (Figura 1). Este complexo, derivado de Ni 2+, glicina, e piridina-2-carboxílico (2-benzoil-fenil) -amida do ido (PBP), 6, tem sido demonstrado ser uma plataforma útil para a síntese de uma variedade de SAU de e é facilmente acessíveis usando uma via de síntese em duas fases. 7 Síntese de este complexo é, com elevado rendimento precedentes-literatura. 6 Os resultados descritos a seguir demonstram a aplicabilidade de condições de hidrólise utilizando EDTA a levemente ácido a condições de pH neutros adequados para uso com cadeia lateral lábil-ácido rolamento de UAA grupos protectores. A seguir à hidrólise, a solução aquosa resultante pode ser isolado e submetido imediatamente a condições-padrão de protecção Fmoc, para se obter um aminoácido protegido com Fmoc (Figura 2). Figura 2: Hidrólise e Fmoc-protecção de um aminoácido isolada a partir de Ni-PBP-Gli. Condições de reação: i. EDTA (12 equiv), pH 4,5; ii. Acetato de etilo de lavagem e ajustamento do pH a 7; iii. Fmoc-OSu (1 equiv), NaHCO 3 (2 eq). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55677/55677fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-PBP-Gly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized from published protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D119-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC610050040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-OSu</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>&#34;00147&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dioxane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D111-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC610060040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEOPrep 60ECO Silica Gel</td>
			<td>ZEOChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3200250.650.443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Test Strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Separatory Funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Round Bottom Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrolysis of a ni-schiff-base complex using conditions suitable for retention of acid-labile protecting groups

Os aminoácidos não naturais, os aminoácidos contendo funcionalidades de cadeia lateral que não são normalmente vistos na natureza, são cada vez mais encontrada em sequências de péptidos sintéticos. Síntese de alguns aminoácidos não naturais muitas vezes inclui a utilização de um precursor constituído por uma base de Schiff estabilizada por um catião de níquel. Unnatural cadeias laterais pode ser instalado sobre um esqueleto de aminoácidos encontrados neste complexo de base de Schiff. O aminoácido não natural resultante pode então ser isolado a partir deste complexo usando hidrólise da base de Schiff, tipicamente pelo emprego de refluxo em solução fortemente ácida. Estas condições altamente ácidas podem remover-lábil ácido grupos de protecção necessária da cadeia lateral para os aminoácidos não naturais a serem utilizados na síntese de péptidos em fase sólida assistida por microondas. Neste trabalho, nós apresentamos uma hidrólise eficiente e subsequente protecção Fmoc de um aminoácido isolado a partir de uma base de complexo de Ni-Schiff. As condições de hidrólise apresentados neste trabalho são adequados para a retenção de s ácido-lábeis-Cadeia ide grupos de protecção e podem ser adaptável a uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais.

Colocámos a hipótese de que remoção do Ni2 + a partir do complexo de Ni-PBP-Gly pode permitir a uma hidrólise aquosa eficiente da base de Schiff, sem a necessidade de condições de pH duras. Como o EDTA é um agente quelante barato e bem estudada, 10 a hipótese de que a adição de EDTA a uma solução de Ni-PBP-Gly facilitaria a quelação de iões de Ni 2+, promovendo, assim, a hidrólise do complexo. Para testar a teoria de que o EDTA por si só poderia promover eficazmente a hidrólise do complexo, que submetido uma solução de Ni-PBP-Gly em DMF à temperatura ambiente para aumentar equivalentes de EDTA em pH da solução aquosa a 4,5, o pH não ajustado de solução de sal dissódico de EDTA aquoso . O progresso da reacção de hidrólise pode ser monitorizada pelo observando a cor da solução; que não reagiu Ni-PBP-Gli em solução exibe uma cor vermelho escuro, enquanto PBP isoladoa partir deste complexo é branco. Seguimos o progresso da reacção de hidrólise por monitorização da alteração de cor da solução de vermelho a branco (Tabela 1). As reacções que envolvem menos do que oito equivalentes mostrou alguma transição de coloração de vermelho para branco, mas a reacção estava incompleta, em cada caso. Sem mudança de cor foi evidente para condições sem EDTA. O efeito do pH na hidrólise foi avaliado da mesma forma. Sujeição do complexo de Ni-PBP-Gly a condições de hidrólise utilizando 12 equivalentes de EDTA durante a noite com diferentes pH, à temperatura ambiente mostrou hidrólise bem sucedida do complexo ocorre sob condições de pH que variam 4,5-7,5. Isto demonstra a flexibilidade da hidrólise de EDTA; O pH pode ser aumentado para ter em conta mais grupos protectores de cadeia lateral sensível a ácido. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Condição </td><td&gt; Equivalentes (EDTA: Ni-PBP-Gli) </td><td> pH da solução de EDTA </td><td> Conclusão overnight </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 4,5 </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 4,5 </td><td> Parcial </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 4,5 </td><td> Parcial </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 6 </td><td> 4,5 </td><td> Parcial </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 8 </td><td> 4,5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 4,5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 12 </td><td> 4,5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 12 </td><td> 5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 12 </td><td> 5.5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 6 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 12 </td><td> 6,5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 12 </td><td> 7 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 13 </td><td> 12 </td><td> 7,5 </td><td> Cheio </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 8 </td><td> Parcial </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Ni-PBP-Gly hidrólise Condições. Para verificar que a hidrólise estava completa utilizando a condição mais eficiente, 7, extraiu-se a mistura reaccional três vezes com diclorometano, combinadas e secas as camadas orgânicas e analisou-se o resíduo resultante utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). O espectro de RMN mostrou nenhuma evidência de Ni-PBP-Gli na amostra; as ressonâncias únicas encontradas no espectro correspondeu com relatos da literatura de PBP, sugerindo a hidrólise completa do complexo. Foi examinada a viabilidade das nossas condições de hidrólise óptimas com aminoácidos contêming uma variedade de grupos protectores de cadeia lateral. Amostras de Fmoc-L-glutâmico ácido 5- terc-butil éster (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc-O - terc-butil-L-treonina (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - terc-butil-L-tirosina (Fmoc-Tyr (tBu) -OH), e N (em) Boc- N α Fmoc-L-triptofano (Fmoc-Trp (Boc) -OH) foram dissolvidos em DMF e submetida a hidrólise à temperatura ambiente utilizando-se 12 equivalentes de EDTA a pH 4,5. Depois de ter sido deixada a agitar durante a noite, as soluções foram extraídas com diclorometano e analisado por RMN. Um RMN representativo é incluído por Fmoc-Glu-OH (tBu) (Figura 3). Em cada caso, os dados espectrais mostraram a retenção completa de grupos de protecção de cadeia lateral. 11, 12, 13 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig3.jpg" /> Figura 3: RMN representativas de um Fmoc-monómero de rolamento uma cadeia lateral de ácido-lábil Grupo de Protecção após sujeição a condições de hidrólise. O grupo protector da cadeia lateral instável em meio ácido é realçada com uma caixa azul. valores de integração arredondados para os sinais de prótons deste composto estão incluídos entre parênteses. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55677/55677fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Após hidrólise e extracção orgânica, a camada aquosa restante contém o amino ácido livre, juntamente com EDTA residual e iões de Ni 2+. Para assegurar que a presença dessas substâncias não iria interferir com a protecção Fmoc subsequente do amino ácido livre, foi realizada uma reacção de teste através da dissolução de glicina em uma solução aquosa contendo iões de EDTA e de Ni 2+ com concentrações semelhantes de entrada 7. hidrólise We, em seguida, submetidos a esta solução uma protecção aquosa padrão Fmoc. 8 Depois do final da reacção e processamento, determinou-se a reacção deu um rendimento de 25% de glicina protegido com Fmoc. Esta percentagem de rendimento não é surpreendente considerando a concentração diluída da reacção e sugere que a presença de iões de Ni2 + e EDTA não interferem com uma reacção de protecção Fmoc padrão. Com provas de que cada componente individual da nossa metodologia (hidrólise, o isolamento do aminoácido livre, e protecção com Fmoc) é viável, foi realizada uma experiência à prova de conceito utilizando Ni-PBP-Gli. Foi avaliada a viabilidade das condições de hidrólise descritas acima e subsequente protecção Fmoc utilizando um protocolo padrão de 8 para se obter um aminoácido protegido com Fmoc, com um rendimento razoável. A uma solução agitada de Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) em 40 mL de DMF à temperatura ambienteerature foi adicionada uma solução 0,2 M de EDTA a pH 4,5 (65 mL, 13 mmol, 13 equiv). A reacção foi deixada a agitar durante a noite e, em seguida, lavou-se quatro vezes com diclorometano. A camada aquosa foi em seguida ajustado para pH 7 utilizando bicarbonato de sódio sólido. Para bicarbonato a camada aquosa foi adicionado sódio (163 mg, 1,93 mmol, 2 equiv) e Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) dissolvido em uma quantidade mínima de dioxano. A reacção foi deixada a agitar durante a noite e, em seguida, acidificada com ácido clorídrico 1 M e extraiu-se três vezes com acetato de etilo. Os extractos orgânicos foram combinados, lavados seis vezes com salmoura, concentrou-se, secou-se com sulfato de magnésio, e secou-se sob vácuo para se obter uma mistura de n reagido Fmoc-OSu e Fmoc-Gli-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% de rendimento). dados espectrais coincidentes publicado anteriormente espectros por Fmoc-Gly-OH. 9 Esta experiência final indica que é possível isolar a partir de glicina livre o Ni-PBP-Gly complexo e transportá-lo para a frente para a sua Fmoc-protforma ected.

Watch this Scientific Journal Video about Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups at JoVE.com

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Aqui, nós apresentamos uma hidrólise eficiente e subsequente protecção Fmoc de um aminoácido isolado a partir de um complexo de Ni-base de Schiff. As condições de hidrólise aqui apresentados são adequados para utilização quando é necessária a retenção de grupos protectores de cadeia lateral lábil a ácidos. Esta técnica pode ser adaptável a uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais.

A hidrólise de um Ni-base de Schiff complexa usando condies adequadas para a retenção dos grupos protectores ácido-lábil

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

hydrolysis-ni-schiff-base-complex-using-conditions-suitable-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K visualizações.  Slippery Rock University.  Aqui, nós apresentamos uma hidrólise eficiente e subsequente protecção Fmoc de um aminoácido isolado a partir de um complexo de Ni-base de Schiff. As condições de hidrólise aqui apresentados são adequados para utilização quando é necessária a retenção de grupos protectores de cadeia lateral lábil a ácidos. Esta técnica pode ser adaptável a uma variedade de substratos de aminoácidos não naturais. 

Vídeo: Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As oxygen is ubiquitous in air, retaining O2-free conditions during all steps of cultivation is challenging but a prerequisite for anaerobic culturing. The protocol presented here demonstrates the successful cultivation of an anaerobic mixed culture derived from a biogas plant using a simple and inexpensive method. A precise description of the entire anoxic culturing process is given including media preparation, filling of cultivation flasks, supplementation with redox indicator and reducing agents to provide low redox potentials as well as exchanging the headspace to keep media free from oxygen. Furthermore, a detailed overview of aseptically inoculating gas tight serum flasks (by using sterile syringes and needles) and suitable incubation conditions is provided. The present protocol further deals with gas and liquid sampling for subsequent analyses regarding gas composition and volatile fatty acid concentrations using gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively, and the calculation of biogas and methane yield considering the ideal gas law.

As obligate anaerobic organisms are unable to grow upon oxygen exposure, the use of anaerobic culturing techniques is indispensable. Here, we demonstrate a simple and effective method to cultivate a mixed culture derived from a biogas plant from media preparation to gas and volatile fatty acid quantification.

Preparação média para o cultivo de microrganismos condições estritamente anaeróbicas/anóxicas

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of galectin-3 into the splicing pathway is addressed in this paper. Sedimentation of HeLa cell nuclear extracts on 12%-32% glycerol gradients yields fractions enriched in an endogenous ~10S particle that contains galectin-3 and U1 snRNP. We now describe a protocol to deplete nuclear extracts of U1 snRNP with concomitant loss of splicing activity. Splicing activity in the U1-depleted extract can be reconstituted by the galectin-3 - U1 snRNP particle trapped on agarose beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies. The results indicate that the galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary complex is a functional E complex leading to intermediates and products of the splicing reaction and that galectin-3 enters the splicing pathway through its association with U1 snRNP. The scheme of using complexes affinity- or immuno-selected on beads to reconstitute splicing activity in extracts depleted of a specific splicing factor may be generally applicable to other systems.

This article describes the experimental procedures for (a) depletion of U1 snRNP from nuclear extracts, with concomitant loss of splicing activity; and (b) reconstitution of splicing activity in the U1-depleted extract by galectin-3 - U1 snRNP particles bound to beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies.

Complementação da Atividade de Emenda por um Complexo Galectin-3 - U1 snRNP on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...