Agradecemos ao Dr. Guido Scarabelli e Hongyang Li por testes extensivos ao longo do desenvolvimento, bem como a comunidade de usuários Bio3D e os participantes da oficina de bioinformática estrutural da Universidade de Bergen para comentários e comentários que melhoraram esta aplicação.

NOTA: Uma sessão típica da Bio3D-web passa por cinco etapas consecutivas e dependentes (veja a Figura 1 para uma representação esquemática). Cada etapa é implementada como uma guia de navegação consecutiva do aplicativo da Web, a saber, SEARCH, ALIGN, FIT, PCA e eNMA. 1. Pesquisa e seleção de estrutura (PESQUISA) <ol><li> Estrutura de entrada <ol><li> Obtenha o PDB ID da adenilato quinase (Adk), por exemplo , pesquisando o PDB [http://www.rcsb.org/pdb]. Alternativamente, obtenha a sequência de aminoácidos da proteína de interesse, por exemplo , da UniProt [http://uniprot.org]. </li><li> Digite o ID do PDB de quatro caracteres longo para Adk ( por exemplo, 1AKE), ou cole uma seqüência de proteína, na caixa de texto no painel &quot;Entrada de estrutura ou seqüência&quot;. </li></ol></li><li> Hit selection <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Seleção de seleção) no primeiro painel ou simplesmente role para baixo para o painel B) &quot;Selecionar seleção&quot;Para uma análise mais aprofundada. </li><li> Certifique-se de que o controle deslizante &quot;Limite do número total de estruturas incluídas&quot; é definido como seu valor máximo para incluir todas as estruturas acima do ponto de corte. </li><li> Abaixe o &quot;Ajustar o limite de BitScore de inclusão&quot; para incluir sucessos mais distantes ou aumentá-lo para excluir. </li></ol></li><li> Filtragem de sucesso opcional <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (seleção de seleção) no primeiro painel ou simplesmente role para o painel C) &quot;Filtragem opcional de estruturas relacionadas para análise posterior&quot;. </li><li> Certifique-se de que os resultados selecionados representem estruturas relevantes, inspecionando detalhes da tabela, por exemplo , nome PDB, espécies e ligandos encadernados. </li><li> Refine manualmente o subconjunto selecionado de estruturas, se necessário clicando nas linhas da tabela. NOTA: As linhas destacadas com uma cor azul representam IDs do PDB selecionadas para análise posterior nas guias posteriores. </li></ol></li></ol> 2. Análise de Alinhamento de Sequências Múltiplas (ALIGN) <ol><li> Clique na guia ALIGN para executar o alinhamento de seqüência das estruturas selecionadas na guia SEARCH. </li><li> Resumo de alinhamento <ol><li> Revise o resumo do alinhamento no painel A) &quot;Resumo do alinhamento&quot;. Certifique-se de que as regiões de interesse estão alinhadas e não mascaradas por lacunas em uma ou mais estruturas. </li><li> Se necessário, alternar as &quot;Opções de edição do alinhamento da tela&quot; e remover indícios de PDB indesejados, por exemplo , PDBs com resíduos ausentes. </li></ol></li><li> Análise de alinhamento de seqüência <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Análise) para executar a análise de agrupamento baseada em seqüência das estruturas coletadas. </li><li> Selecione a opção de plotagem Dendrograma. Ajuste o Cluster no controle deslizante de grupos K para particionar as estruturas em grupos k. </li><li> Opcionalmente, altere o método de agrupamento, se desejado, ao alternar a caixa de seleção Mais opções de cluster e saída. </li></oL&gt; </li><li> Análise de conservação de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Conservação) para calcular a conservação de resíduos em coluna. </li><li> Selecione os conjuntos de estrutura Alinhados para gerar um gráfico da conservação de resíduos em cada posição de alinhamento. </li><li> Selecione Estruturas alinhadas com alinhamento de sementes de PFAM para mostrar a conservação calculada em relação ao alinhamento de sementes de PFAM associado contendo membros representativos da família. </li></ol></li><li> Exibição de alinhamento de seqüência <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Alinhamento) para mostrar o alinhamento da sequência completa com a ferramenta de visualização do alinhamento no navegador. </li></ol></li></ol> 3. Estrutura de montagem e análise (FIT) <ol><li> Execute a superposição da estrutura inserindo a guia FIT. </li><li> Estrutura de superposição <ol><li> Alternar a caixa de seleção &quot;Mostrar PDBs&quot; para visualizar o protegido alinhadoN estruturas no navegador. </li><li> Certifique-se de que as estruturas protéicas se sobrepõem a regiões correspondentes e relevantes por inspeções visuais. Clique e arraste o mouse sobre as estruturas para girar e role para ampliar. </li><li> Ajuste a coloração das estruturas clicando nas &quot;Opções de cor&quot;. As opções de coloração incluem a posição de alinhamento, variabilidade estrutural por posição, grupos de agrupamentos RMSD, grupos de sequências agrupadas, regiões alinhadas e estrutura secundária. </li><li> Faça o download das estruturas superpostas como arquivos PDB convencionais ou como um único arquivo de sessão PyMOL para visualização em um programa de visualizador molecular especializado. </li></ol></li><li> Análise da estrutura <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Análise) para executar o agrupamento baseado em estrutura das estruturas PDB coletadas. </li><li> Alternar o RMSD Heatmap no menu suspenso Opções de traçar. </li><li> Ajuste as opções de agrupamento, incluindo o próprio método de cluster, Ao trocar a caixa de seleção &quot;Mais clustering e opções de saída&quot;. NOTA: Os dados do RMSD em partes podem também ser visualizados como um dendrograma, um histograma ou um mapa de calor. </li></ol></li><li> Flutuações de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (RMSF) para ver a variabilidade estrutural de cada resíduo (mostrado como um gráfico RMSF) com elementos de estrutura secundária principais mostrados nas regiões marginais do eixo dos x. </li><li> Alternar a caixa de seleção Mostrar B-fatores para sobrepor os fatores B cristalográficos da estrutura de referência no gráfico RMSF. </li></ol></li></ol> 4. Análise de componentes principais (PCA) <ol><li> Execute a análise de componentes principais inserindo a aba &quot;PCA&quot;. </li><li> Visualização dos principais componentes <ol><li> Alternar a caixa de seleção &quot;Mostrar PC Trajetória&quot; para visualizar os movimentos descritos pelos PCs com a ferramenta de visualização no navegador. </li><li> Certifique-se de que &quot;PrinCipal Component 1 &quot;é escolhido no primeiro menu suspenso. </li><li> Para visualizar os movimentos descritos por outros PCs, escolha o PC desejado no menu suspenso &quot;Escolher componente principal&quot;. </li><li> Altere a coloração da trajetória no menu suspenso &quot;Opções de cor&quot;. </li><li> Escolha &quot;Variabilidade por posição&quot; das &quot;Opções de cor&quot; para colorir por magnitude de deslocamento. </li><li> Clique no botão &quot;Download PDB trajectory&quot; no painel &quot;Visualização de Componentes Principais&quot; para obter uma visão de trajetória do movimento descrito pelos PCs. </li><li> Clique no botão &quot;Baixar PyMOL&quot; arquivo de sessão para gerar um arquivo de sessão PyMOL dando os movimentos como um campo vetorial. </li></ol></li><li> Análise de conformidade <ol><li> Projectar as estruturas individuais em dois PCs selecionados, clicando no botão azul &quot;Próximo&quot; (Plot). </li><li> Certifique-se de que &quot;PC no eixo X&quot; esteja configurado para 1, e &quot;PC oN Y-axis &quot;para 2. Para projetar as estruturas em outros PCs, ajuste a numeração do PC de acordo. </li><li> Escolha &quot;Cluster by PC Subspace&quot; para colorir as estruturas no gráfico por cluster baseado em PC; &quot;RMSD&quot; para corar por agrupamento baseado em &quot;RMSD&quot;; E &quot;Sequência&quot; para colorir por agrupamento baseado em seqüência. </li><li> Clique em qualquer ponto individual no gráfico para rotular as estruturas. Alternativamente, destaque uma ou mais estruturas na tabela &quot;anotação PCA conformer plot&quot; abaixo do enredo. </li><li> Deslize os PCs no controle deslizante subespaço para incluir PCs mais / menos para o algoritmo de agrupamento. </li></ol></li><li> Contribuições de resíduos <ol><li> Calcule as contribuições de resíduos para os PC individuais, clicando no botão azul &quot;Próximo&quot; (Contribuições de resíduos). </li><li> Trace as contribuições para computadores adicionais, incluindo o número do PC na caixa de texto &quot;Escolher componente principal&quot;. </li><li> Alternar o &quot;Spread liNes &quot;caixa de seleção evitar traçar as contribuições de resíduos em cima uns dos outros. </li><li> Desligue a caixa de seleção &quot;Multiline plot&quot; para traçar as contribuições de resíduos em lotes separados. </li><li> Alternar o &quot;Mostrar RMSF&quot; para incluir os valores RMSF (da guia FIT). </li></ol></li></ol> 5. Ensemble Normal Mode Analysis (eNMA) <ol><li> Clique na guia eNMA para iniciar o cálculo dos modos normais (NMs). </li><li> Estrutura do filtro <ol><li> Ajuste o número de estruturas reduzindo ou aumentando o &quot;Limite&quot; para inclusão / exclusão de estrutura. </li><li> Clique no verde &quot;Run Ensemble NMA&quot; para iniciar o cálculo NMA. </li></ol></li><li> Visualização de modos normais <ol><li> Desça até o segundo painel da guia eNMA (visualização de modos normais) para visualização dos NMs. NOTA: Por padrão, o NM com a maior sobreposição (similaridade) ao PC-1 é exibido no visualJanela de ização. </li><li> Para visualizar os movimentos descritos por outros NMs ou outras estruturas PDB, escolha o NM e a estrutura desejada nos menus suspensos &quot;Escolha Modo&quot; e &quot;Mostrar NMs para estrutura&quot; , respectivamente. </li></ol></li><li> Flutuações de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Flutuações) para calcular as flutuações de estrutura residual selecionadas para eNMA. </li><li> Alternar o &quot;Cluster by RMSD&quot; para colorir os perfis de flutuação por agrupamento baseado em RMSD. </li><li> Alternar o &quot;Cluster by RMSIP&quot; para colorir os perfis de flutuação por agrupamento baseado em RMSIP. </li><li> Alterna a caixa de seleção &quot;Linhas de propagação&quot; para traçar os perfis de flutuação agrupados, um para o outro. </li></ol></li><li> Comparando NMA e PCA <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (PCA-vs-NMA) para calcular a semelhança entre os NMs individuais e PCs. </li><li> Selecione um PDB ID no menu suspenso &quot;Compare NMs of structure&quot; para calcular a semelhança entre os NMs desta estrutura para os PCs calculados na guia PCA. </li></ol></li><li> Análise de sobreposição <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (análise de sobreposição) para calcular a sobreposição entre os NMs calculados e o vetor de diferença de estrutura entre duas estruturas selecionadas. </li><li> Selecione uma identificação de PDB &quot;referência&quot; no menu suspenso &quot;Comparar NMs of structure&quot; e ou um ou mais IDs de PDB na tabela de estrutura para a comparação pairwise com o PDB de referência. </li></ol></li><li> Análise de agrupamento <ol><li> Clique no botão azul &quot; Próximo&quot; (Clustering) para executar o agrupamento de estrutura com base na semelhança de NM em pares (RMSIP). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kornev, A. P., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics-Driven+Allostery+in+Protein+Kinases.">Dynamics-Driven Allostery in Protein Kinases.</a> Trends Biochem. Sci. 40 (11), 628-647 (2015).</li><li>Yao, X. -. Q., Grant, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-opening+and+dynamic+coupling+in+the+&#945;-subunit+of+heterotrimeric+G+proteins.">Domain-opening and dynamic coupling in the &#945;-subunit of heterotrimeric G proteins.</a> Biophys. J. 105 (2), L08-L10 (2013).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+motions+along+an+enzymatic+reaction+trajectory.">Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory.</a> Nature. 450 (7171), 838-844 (2007).</li><li>Boehr, D., Nussinov, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+conformational+ensembles+in+biomolecular+recognition.">The role of dynamic conformational ensembles in biomolecular recognition.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 789-796 (2009).</li><li>Teilum, K., Olsen, J. G., Kragelund, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+protein+flexibility.">Functional aspects of protein flexibility.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (14), 2231-2247 (2009).</li><li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+personalities+of+proteins.">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li><li>Grant, B. J., Gorfe, A. A., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+proteins:+signaling+and+other+functions.">Large conformational changes in proteins: signaling and other functions.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20 (2), 142-147 (2010).</li><li>Grant, B. J., Rodrigues, A. P. C., ElSawy, K. M., McCammon, J. A., Caves, L. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio3d:+an+R+package+for+the+comparative+analysis+of+protein+structures.">Bio3d: an R package for the comparative analysis of protein structures.</a> Bioinformatics. 22 (21), 2695-2696 (2006).</li><li>Bakan, A., Meireles, L. M., Bahar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProDy:+protein+dynamics+inferred+from+theory+and+experiments.">ProDy: protein dynamics inferred from theory and experiments.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1575-1577 (2011).</li><li>Zimmermann, M. T., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVENs:+motion+analysis+and+visualization+of+elastic+networks+and+structural+ensembles.">MAVENs: motion analysis and visualization of elastic networks and structural ensembles.</a> BMC Bioinformatics. 12 (1), 264 (2011).</li><li>Yang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oGNM:+online+computation+of+structural+dynamics+using+the+Gaussian+Network+Model.">oGNM: online computation of structural dynamics using the Gaussian Network Model.</a> Nucleic Acids Res. 34, 24-31 (2006).</li><li>Suhre, K., Sanejouand, Y. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElNemo:+a+normal+mode+web+server+for+protein+movement+analysis+and+the+generation+of+templates+for+molecular+replacement.">ElNemo: a normal mode web server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement.</a> Nucleic Acids Res. 32, W610-W614 (2004).</li><li>Tiwari, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WEBnm@+v2.0:+Web+server+and+services+for+comparing+protein+flexibility.">WEBnm@ v2.0: Web server and services for comparing protein flexibility.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 427 (2014).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDBFlex:+exploring+flexibility+in+protein+structures.">PDBFlex: exploring flexibility in protein structures.</a> Nucleic Acids Res. 44, D423-D428 (2016).</li><li>Skj&#230;rven, L., Jariwala, S., Yao, X. -. Q., Grant, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+interactive+analysis+of+protein+structure+ensembles+with+Bio3D-web.">Online interactive analysis of protein structure ensembles with Bio3D-web.</a> Bioinformatics. , (2016).</li><li>Skj&#230;rven, L., Yao, X., Scarabelli, G., Grant, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+protein+structural+dynamics+and+evolutionary+analysis+with+Bio3D.">Integrating protein structural dynamics and evolutionary analysis with Bio3D.</a> BMC Bioinformatics. 15 (399), 1-11 (2014).</li><li>Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Profile+HMM+Searches.">Accelerated Profile HMM Searches.</a> PLoS Comput. Biol. 7 (10), (2011).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Berman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Finn, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pfam:+the+protein+families+database.">Pfam: the protein families database.</a> Nucleic Acids Res. 42, D222-D230 (2014).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energy+landscape+of+adenylate+kinase+during+catalysis.">The energy landscape of adenylate kinase during catalysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22 (2), 124-131 (2015).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Bio3D-web pode ser usado para explorar e mapear os estados estruturais, dinâmicos e funcionais das proteínas das estruturas cristalográficas disponíveis. Além disso, os resultados de agrupamento baseados em NMA e PCA, juntamente com as anotações e análises baseadas em seqüências, podem ser particularmente úteis para selecionar estruturas representativas para análises mais demoradas, como simulações de pequena molécula de acoplamento ou dinâmica molecular. A Bio3D-web facilita análises de bioinformática estrutural avançada para uma gama mais ampla de pesquisadores, reduzindo o nível de conhecimento técnico exigido. O design atual da Bio3D-web enfatiza a simplicidade sobre a inclusão exaustiva dos muitos métodos de análise disponíveis no pacote Bio3D autônomo completo. Em muitos casos, prevê-se que os pesquisadores usem o Bio3D-web para entender as tendências gerais em sua família de proteínas ou superfamília de interesse, o que pode então informar análises mais especializadas. Bio3D-web é oAntes projetado para explorar rapidamente os conjuntos de dados da estrutura biomolécula e atuar como uma ferramenta geradora de hipóteses. Incentivamos os usuários a explorar seus dados fornecendo o exemplo de código Bio3D no relatório reprodutível que também armazena todos os detalhes da consulta e os resultados da análise. No exemplo representativo do exemplo acima, mostramos a capacidade da Bio3D-web para revelar as características estruturais das transições conformacionais funcionais da Adk. Aplicações adicionais do Bio3D-web incluem análise estrutural e dinâmica de estruturas PDB carregadas pelo usuário. Por exemplo, o usuário pode enviar novas estruturas ou mesmo seqüências de proteínas para análise. As etapas de análise mencionadas anteriormente, especialmente o passo de eNMA, podem revelar tendências locais e globais em movimentos de proteínas, com movimentos coletivos de significância funcional. A comparação com estruturas de apo também pode revelar características de transições conformacionais não ligadas a encadernadas. Exemplos adicionais de aplicação paraUma variedade de diferentes famílias de proteínas são fornecidas online. Embora todas as proteínas sejam entidades flexíveis e dinâmicas, nem todas as proteínas possuem estruturas de resolução atômica disponíveis em uma variedade de estados diferentes ( por exemplo, estados ativos e inativos). Nossa visão do espaço da estrutura protéica é, portanto, limitada e, portanto, a visão obtida de ferramentas como a Bio3D-web também é necessariamente limitada para certas proteínas. No entanto, com os avanços tecnológicos atuais e as novas iniciativas para a genômica estrutural, o protocolo aqui apresentado se tornará cada vez mais um caminho importante para obter informações sobre relacionamentos estrutura-função importantes. Um passo crítico, que é particularmente importante ao analisar proteínas mais distantes, é o potencial surgimento de erros de alinhamento na guia ALIGN. Os erros de alinhamento inevitavelmente ocorrerão quando a semelhança da sequência cair abaixo de 30% e o usuário deve, nesses casos, verificar e corrigir o alinhamento da sequênciaNa guia ALIGN. Erros de alinhamento, possivelmente, resultarão em estruturas superpostas impostas na guia FIT e mascararão as variações conformacionais mais relevantes para o PCA subsequente. Além disso, o usuário deve estar ciente dos resíduos em falta nas estruturas de PDB selecionadas, como na implementação atual PCA só pode ser realizada em resíduos de proteína em que todas as estruturas têm o seu átomo de carbono alfa correspondente resolvido. Conseqüentemente, se um PDB selecionado tiver resíduos não resolvidos para uma região específica da proteína, esta região será omitida da PCA. O Bio3D-web atualmente está limitado à análise de estruturas de PDB de cadeia única. Consequentemente, os movimentos funcionais que ocorrem no nível quaternário não podem ser explorados usando o protocolo atual. Embora atualmente estejamos desenvolvendo novos algoritmos para incluir essa análise no Bio3D-web, a única opção atual é através do uso convencional de Bio3D. Bio3D-web é o único aplicativo onlineQue permite pesquisar e identificar conjuntos de estruturas, interpretar seus padrões de seqüência e variabilidade estrutural e extrair informações mecanicistas tanto da análise quanto da predição de sua plasticidade estrutural. Uma ampla gama de ferramentas de visualização molecular e servidores on-line permitem aos pesquisadores explorar e analisar estruturas biomoleculares individuais. No entanto, as ferramentas existentes para análise da seqüência, estrutura e dinâmica de grandes famílias de proteínas heterogêneas muitas vezes requerem conhecimentos computacionais significativos e, tipicamente, permanecem acessíveis apenas para usuários com habilidades de programação relevantes. Por exemplo, o pacote Bio3D requer R 8 , o ProDy requer python e Maven requer conhecimento 9 , 10 de Matlab. A Bio3D-web, em contraste, não requer conhecimento de programação e, assim, aumenta a acessibilidade e diminui a barreira de entrada para realizar uma seqüência comparativa avançada, estrutura e dyAnálise de namics. Além disso, a preparação, a cura, a anotação e a limpeza das estruturas moleculares que são freqüentemente necessárias para análises eficientes estão incluídas no serviço web Bio3D. Além disso, a restrição para realizar essa análise em recursos computacionais capazes é aliviada por nossa instância de servidor que permite a análise em grande escala de muitas estruturas que podem ser iniciadas e controladas a partir de qualquer navegador web moderno. O desenvolvimento aberto do Bio3D-web está em andamento (consulte https://bitbucket.org/Grantlab/bio3d). Continuamos a adicionar novas funcionalidades de análise e a melhorar os métodos existentes. O desenvolvimento futuro incidirá na adição de PCA baseado em matriz de distância e PCA torsional, abordagens de conservação de seqüência mais extensas que incluam um componente filogenético, identificação de local de ligação de conjunto e novas abordagens para análise de rede dinâmica em famílias de proteínas. A este respeito, a aplicação web atual representa o ponto inicialT para muitos outros fluxos de trabalho de análise de bioinformática estrutural colaborativa, permitindo etapas reproduzíveis e compartilháveis ​​em conjuntos de estrutura experimental definidos pelo usuário. Também planejamos o suporte futuro de conjuntos de coordenadas de unidades biológicas reconstruídas, além de cadeias individuais e múltiplas da unidade assimétrica de estruturas PDB. Recursos adicionais incluirão poupança e carregamento aprimorados de espaços de trabalho colaborativos, juntamente com uma possibilidade de desfazer. Bio3D-web é um aplicativo on-line para análise interativa de dados de estrutura biomolecular. O Bio3D-web é executado em qualquer navegador da Web moderno e fornece funcionalidade para: (1) A identificação de conjuntos de estrutura de proteína relacionados aos limites específicos de similaridade do usuário; (2) Seu alinhamento múltiplo e estrutura superposição; (3) Análise de conservação de seqüência e estrutura; (4) Mapeamento de relacionamento entre confórmeros com análise de componente principal, e (5) comparação de dinâmicas internas previstas por conjunto nemAnálise de modo mal. Esta funcionalidade integrada fornece um fluxo de trabalho completo para a investigação de relacionamentos estrutura-estrutura-sequência dentro de famílias de proteínas e superfamílias. Além de uma interface dinâmica fácil de usar para explorar os efeitos das opções de parâmetros e métodos, o Bio3D-web também grava a entrada completa do usuário e os resultados gráficos subsequentes da sessão de um usuário. Isso permite aos usuários compartilhar e reproduzir facilmente a seqüência de etapas de análise que criaram seus resultados. O Bio3D-web é implementado inteiramente no idioma R e é baseado nos pacotes Bio3D e Shiny R. Pode ser executado a partir do nosso servidor on-line ou instalado localmente em qualquer computador rodando R. Isso inclui a instalação do servidor local para fornecer uma instância multiusuficiente personalizada com acesso a conjuntos de dados estruturais prioritários, como os comuns na indústria farmacêutica. O código fonte completo ea extensa documentação são fornecidos sob uma licença de código aberto GPL-3 de: http://thegrantlab.org/ Bio3d / webapps

O banco de dados de proteína (PDB) agora contém mais de 120.000 estruturas de proteína - muitas das quais são da mesma família de proteínas, mas resolvidas em diferentes condições experimentais. Essas múltiplas estruturas representam um recurso inestimável para entender as complexidades da forma e função da proteína. Por exemplo, a comparação rigorosa desses conjuntos estruturais pode revelar importantes mecanismos moleculares 1 , 2 , 3 e informar sobre dinâmicas conformacionais envolvidas em processos, incluindo ligação de ligando, catálise enzimática e reconhecimento bi-molecular 4 , 5 , 6 , 7 . Novos insights podem ser obtidos com a análise detalhada em larga escala da sequência, estrutura e dinâmica das famílias de proteínas. No entanto, isso normalmente requer bioinfia considerávelConhecimentos de programação ormática e informática, juntamente com a familiaridade com os sistemas de proteínas em estudo. Por exemplo, pacotes de software como Bio3D, ProDy e Maven requerem programação em R, Python e Matlab, respectivamente 8 , 9 , 10 . Por outro lado, as ferramentas on-line para análise de flexibilidade estrutural são geralmente limitadas à investigação de estruturas individuais 11 , 12 . Uma excepção a este respeito é o servidor WebNM @ recentemente desenvolvido, que permite a comparação de padrões de flexibilidade obtidos da análise de modo normal (NMA) de várias estruturas pré-alinhadas especificadas pelo usuário 13 . No entanto, este servidor não possui um procedimento automatizado para a identificação de estruturas para comparação, seu alinhamento ou análise posterior além da NMA. Outra contribuição recente é o banco de dados PDBFlex on-line, que apresenta pré-cAnálise computorizada de estruturas PDB compartilhando identidade de sequência de 95% ou superior 14 . No entanto, a análise de conjuntos de estruturas mais diversas não está disponível no momento. Nós já apresentamos o Bio3D-web - um aplicativo web fácil de usar para a análise das relações de estrutura-estrutura-estrutura-dinâmica 15 . O Bio3D-web é único no fornecimento de funcionalidade integrada fácil de usar para a identificação, comparação e análise detalhada de grandes conjuntos de estruturas homólogas online. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a investigação on-line da relação proteína-sequência-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web. O Bio3D-web fornece uma variedade de funções para suportar os cinco principais passos da análise de dados mostrados na Figura 1 e discutidos em detalhes abaixo. Essas etapas constituem um fluxo de trabalho que abrange a seqüência de consulta ou a entrada da estrutura, através de vários níveis de análise de seqüência-estrutura-dinâmica, para resumirE geração de relatórios. Os resultados estão disponíveis imediatamente através de extensas aplicações de visualização e planejamento no navegador, bem como através do download de arquivos de resultados em formatos comumente usados. Além de uma interface dinâmica fácil de usar para explorar os efeitos das opções de parâmetros e métodos, a Bio3D-web também registra a entrada completa do usuário e os resultados gráficos subseqüentes da sessão de um usuário como um relatório reproduzível compartilhável em formatos PDF, DOC e HTML. As sessões do usuário podem ser salvas e recarregadas em tempos futuros e resultados completos baixados e interpretados pelo pacote Bio3D R na máquina local de um usuário. A Bio3D-web é alimentada pelo pacote Bio3D R para análise de dados de simulação biológica, sequência e simulação biomolecular 8 , 16 . Em particular, algoritmos Bio3D para identificação de núcleo rígido 8 , superposição, análise de componentes principais(PCA) 8 e a análise de modo normal de conjunto (eNMA) 16 formam a base da aplicação. Também utilizamos protocolos Bio3D que dependem do pHMMER 17 para identificação de estruturas protéicas relacionadas e MUSCLE 18 para alinhamento de sequências múltiplas. As anotações de estrutura e sequência são derivadas através de utilitários Bio3D a partir dos bancos de dados RCSB PDB 19 e PFAM 20 . O Bio3D-web pode ser executado a partir de nosso servidor on-line ou instalado localmente em qualquer computador que esteja executando o R. Bio3D-web está aberto a todos os usuários e é fornecido gratuitamente sob uma licença de código aberto GPL-3 de: http: // thegrantlab. Org / bio3d / webapps

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio3D-web</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-site</td>
			<td>http://thegrantlab.org/bio3d-web/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Requirements</td>
			<td>Web browser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein sequence-structure-dynamics relationships with bio3d-web

Demonstamos o uso da Bio3D-web para análise interativa de dados de estrutura biomolecular. O aplicativo Bio3D-web oferece funcionalidade on-line para: (1) A identificação de conjuntos de estruturas protéicas relacionadas aos limites de similaridade especificados pelo usuário; (2) Seu alinhamento múltiplo e estrutura superposição; (3) Análise de conservação de seqüência e estrutura; (4) Mapeamento de relacionamento entre confórmeros com análise de componentes principais e (5) comparação de dinâmicas internas previstas através de análise de modo normal de conjunto. Essa funcionalidade integrada fornece um fluxo de trabalho completo em linha para investigar relacionamentos estrutura-estrutura-estrutura dentro de famílias de proteínas e superfamílias.

Adenylate kinase (Adk) é uma enzima ubíqua que funciona para manter o equilíbrio entre nucleotídeos citoplasmáticos essenciais para muitos processos celulares. O Adk opera catalisando a transferência reversível de um grupo fosforil de ATP para AMP. Essa reação é acompanhada por transições conformacionais limitantes de taxa bem estudadas 3 , 21 . Aqui, analisamos todas as estruturas Adk atualmente disponíveis com Bio3D-web para revelar características detalhadas e princípios mecanicistas dessas transições essenciais. Podemos começar a análise Bio3D-web da Adk digitando o código RCSB PDB de qualquer estrutura Adk conhecida. Por exemplo, inserir o PDB ID 1AKE no painel A da guia SEARCH retorna 167 estruturas semelhantes a seqüências das quais os top 26 são selecionados automaticamente para análise posterior (veja o painel B). A anotação presenteEd no painel C indica que essas estruturas selecionadas são todas de E. coli, foram resolvidas por difração de raios X em uma gama de grupos espaciais; Têm uma gama de resolução de 1,63 a 2,8 Â e foram co-cristalizados com uma gama de diferentes ligandos (incluindo não ligandos, AMP, ADP, MG e o inibidor AP5). Observe que os detalhes de anotação adicionais podem ser exibidos clicando na opção &quot;Mostrar / Ocultar Colunas&quot; no painel C. O alinhamento de seqüência múltipla é realizado ao entrar na guia ALIGN. O primeiro painel da guia ALIGN exibe um resumo do alinhamento que fornece detalhes sobre o número de linhas de seqüência (equivalente ao número de estruturas PDB), bem como o número de posições ( ou seja , colunas de alinhamento). Isso inclui uma especificação do número de colunas que não possuem espaços e lacunas. A figura no lado direito da primeira linha fornece uma representação esquemática do alinhamento da seqüência. Aqui thAs áreas cinzentas representam posições não gap, enquanto as áreas brancas no alinhamento correspondem a lacunas. Uma representação da conservação da sequência é mostrada acima do alinhamento com áreas vermelhas indicando posições bem conservadas e branco indicando menos conservado. Observe que as seqüências nesta figura são ordenadas com base em sua similaridade fornecida pelo dendrograma de agrupamento no lado esquerdo. O segundo painel desta guia facilita ainda o agrupamento dos PDBs selecionados com base em sua similaridade de seqüência em pares, que pode ser visualizado como um dendrograma ou um mapa de calor. Por padrão, é mostrado um dendrograma (ou diagrama de árvore) que representa a disposição dos clusters. O eixo y do dendrograma representa a distância (em termos de identidade de sequência) entre os clusters. A superposição da estrutura é realizada automaticamente ao entrar na guia FIT. As estruturas sobrepostas, exibidas de forma interativa no painel A, indicaNa presença de uma região do núcleo relativamente rígida (abrangendo os resíduos 1-29, 68-117 e 161-214, veja o painel &quot;detalhes do núcleo opcional e detalhes do RMSD&quot; na parte inferior da guia FIT para obter detalhes). Duas outras regiões variáveis ​​de ligação a nucleótidos (resíduos 30-67 e 118-167) também são claramente visíveis ( Figura 2 ). O agrupamento baseado em RMSD agrupa essas estruturas em duas conformações distintas. Clicar na guia PCA mostra mais claramente a relação entre as estruturas em termos de deslocamentos dessas regiões que efetivamente se fecham sobre as espécies nucleotídicas ligadas em estruturas relacionadas ( Figura 2B e 2C ). A maioria das estruturas está na forma &quot;fechada&quot; (azul na Figura 2C ) e está associada a um ligando ou inibidor ligado. Em contraste, as conformações mais abertas são livres de inibidores de nucleótidos e inibidores. Isso é consistente comO vasto conjunto de pesquisas sobre a estrutura e a dinâmica de Adk, indicando que uma configuração aberta dessas regiões é necessária para a ligação de nucleotídeos e uma conformação fechada para transferência eficiente de fosforil e supressão de eventos de hidrólise prejudicial. É notável que um único PC capture 97% do deslocamento quadrático médio total neste conjunto de estruturas Adk e fornece uma descrição clara e convincente da transição aberta para fechada junto com as contribuições de resíduos individuais para esse deslocamento funcional (painel C do aplicativo E Figura 2 ). A visita da guia NMA e o aumento do número de estruturas consideradas para o cálculo (através da redução do ponto de corte para filtragem de estruturas semelhantes) indicam que as estruturas de estado aberto exibem dinâmicas locais e globais aprimoradas em comparação com as estruturas de formas fechadas ( Figura 2D e painel C do aplicativo) . Comparando PCA e NMA resultados paraEstruturas individuais (painel D) indicam que o primeiro modo de todas as estruturas abertas exibe uma sobreposição relativamente alta para o PC1 (com um valor médio de 0,37 ± 0,04). Em contraste, as estruturas de formas fechadas apresentam valores mais baixos (com uma média de 0,30 ± 0,01). Os valores de RMSIP para estruturas abertas (0,62 ± 0,003) também são superiores aos de estruturas fechadas (0,56 ± 0,008). Além disso, a análise de sobreposição mostra que os primeiros modos do estado aberto estão de acordo com a mudança conformacional que descreve a diferença dos estados aberto e fechado (painel E). O agrupamento baseado em valores do RMSIP novamente exibe uma partição consistente de estruturas de estado aberto e fechado (painel F). Coletivamente, esses resultados indicam a existência de dois estados conformacionais distintos para Adk. Estes diferem por um deslocamento coletivo de baixa freqüência de duas regiões do site de ligação a nucleótidos que exibem flexibi distintoLidades após a ligação de nucleótidos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral da Bio3D-web com capturas de tela das guias PCA e NMA. A Bio3D-web possui uma estrutura ou seqüência de proteína fornecida pelo usuário como entrada na guia SEARCH ( 1 ). O servidor fornece uma lista de estruturas relacionadas, que podem ser selecionadas para análise posterior. ( 2 ) A guia ALIGN fornece alinhamento de seqüência e análise das estruturas selecionadas na guia SEARCH. ( 3 ) Na guia FIT, todas as estruturas são sobrepostas e visualizadas em 3D, juntamente com os resultados da análise convencional da estrutura par-wise. ( 4 ) A análise do componente principal do conjunto de estrutura é realizada na aba PCA para caracterizar as relações entre confeitárias. ( 5 ) A análise do modo normal em cada estrutura pode ser realizada na guia eNMAPara explorar tendências dinâmicas para os estados estruturais disponíveis. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55640/55640fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig2.jpg" /> Figura 2: Resultados da análise Bio3D-web da adenilato quinase. ( A ) Estruturas PDB disponíveis de adenilato cinase sobrepostas no núcleo invariante identificado. As estruturas são coloridas de acordo com o agrupamento baseado em RMSD fornecido na guia FIT. ( B ) A visualização dos principais componentes está disponível na guia PCA para caracterizar as principais variações conformacionais no conjunto de dados. Aqui, a trajetória correspondente ao primeiro componente principal é mostrada na representação do tubo mostrando o movimento de fechamento em larga escala da proteína. ( C ) Estruturas são prOjected em seus dois primeiros componentes principais em um gráfico de conformer mostrando uma representação de baixa dimensão da variabilidade conformacional. Cada ponto (ou estrutura) é colorido de acordo com critérios especificados pelo usuário, neste caso, resultados de agrupamento baseados em PCA. ( D ) A análise de modo normal na guia eNMA sugere dinâmicas locais e globais aprimoradas para estruturas em aberto (vermelho) em comparação com as estruturas de forma fechada (azul). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55640/55640fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web at JoVE.com

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

É apresentado um protocolo para a investigação on-line sobre a relação proteína-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web.

Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

investigating-protein-sequence-structure-dynamics-relationships-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.3K visualizações.  University of Michigan Medical School.  É apresentado um protocolo para a investigação on-line sobre a relação proteína-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web. 

Vídeo: Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction phase problem. Novel structures that lack a suitable homology model are often derivatized with heavy atoms to provide experimental phase information. The presented protocol efficiently generates derivatized protein crystals by combining random microseeding matrix screening with derivatization with a heavy atom molecule I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). By incorporating I3C into the crystal lattice, the diffraction phase problem can be efficiently solved using single wavelength anomalous dispersion (SAD) phasing. The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows for rapid validation of a correct anomalous substructure. This protocol will be useful to structural biologists who solve macromolecular structures using crystallography-based techniques with interest in experimental phasing.

This article presents a method to generate protein crystals derivatized with I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) using microseeding to generate new crystallization conditions in sparse matrix screens. The trays can be set up using liquid dispensing robots or by hand.

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein aggregation. The accumulation of protein aggregates in bacterial cells can lead to significant alterations in the cellular phenotypic behavior, including a reduction in growth rates, stress resistance, and virulence. Several experimental procedures exist for the examination of these stressor-mediated phenotypes. This paper describes an optimized assay for the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from different Escherichia coli strains after treatment with a silver-ruthenium-containing antimicrobial. This compound is known to generate reactive oxygen species and causes widespread protein aggregation. 
The method combines a centrifugation-based separation of protein aggregates and soluble proteins from treated and untreated cells with subsequent separation and visualization by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining. This approach is simple, fast, and allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in different E. coli strains. The methodology has a wide range of applications, including the possibility to investigate the impact of other proteotoxic antimicrobials on in vivo protein aggregation in a wide range of bacteria. Moreover, the protocol can be used to identify genes that contribute to increased resistance to proteotoxic substances. Gel bands can be used for the subsequent identification of proteins that are particularly prone to aggregation.

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

This protocol describes the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from Escherichia coli after treatment with a proteotoxic antimicrobial. Following this procedure allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in vivo in different bacterial strains and/or between treatments.

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an enormous amount of spectra, setting challenges for quality control of the mass spectrometry spectra. To reduce the false positives, false discovery rate (FDR) quality control is necessary. Recently, we developed a software for FDR control of untargeted metabolome identification that is based on a Target-Decoy strategy named XY-Meta. Here, we demonstrated a complete analysis pipeline that integrates XY-Meta and metaX together. This protocol shows how to use XY-meta to generate a decoy database from an existing reference database and perform FDR control using the Target-Decoy strategy for large-scale metabolome identification on an open-access dataset. The differential analysis and metabolites annotation were performed after running metaX for metabolites peaks detection and quantitation. In order to help more researchers, we also developed a user-friendly cloud-based analysis platform for these analyses, without the need for bioinformatics skills or any computer languages.

We constructed an untargeted metabolomic workflow that integrated XY-Meta and metaX together. In this protocol, we displayed how to use XY-Meta to generate a decoy spectral library from open access spectra reference, and then performed FDR control and used the metaX to quantitate the metabolites after identifying the metabolomics spectra.

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...