Ringraziamo il dottor Guido Scarabelli e Hongyang Li per un ampio test durante lo sviluppo così come la comunità di utenti Bio3D e gli operatori della bioinformatica strutturale dell&#39;Università di Bergen per commenti e commenti che hanno migliorato questa applicazione.

NOTA: Una sessione tipica di Bio3D procede attraverso cinque passaggi consecutivi e dipendenti (vedere la figura 1 per una rappresentazione schematica). Ogni passaggio viene implementato come una scheda di navigazione consecutiva dell&#39;applicazione web, ad esempio SEARCH, ALIGN, FIT, PCA e eNMA. 1. Ricerca e selezione strutture (SEARCH) <ol><li> Struttura di ingresso <ol><li> Ottieni l&#39;ID PDB dell&#39;adenilato-chinasi (Adk), ad esempio ricercando il PDB [http://www.rcsb.org/pdb]. In alternativa, ottenere la sequenza di aminoacidi proteica di interesse, ad esempio da UniProt [http://uniprot.org]. </li><li> Inserisci l&#39;ID PDB lungo quattro caratteri per Adk ( ad esempio 1AKE) o incolla una sequenza di protezioni nella casella di testo nella sezione &quot;Struttura o sequenza di input&quot;. </li></ol></li><li> Seleziona la selezione <ol><li> Fai clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (Selezione hit) nel primo pannello o semplicemente scorri verso il basso per il pannello B) &quot;Selezione hit&quot;Per ulteriori analisi. </li><li> Assicurarsi che il cursore &quot;Limita il numero totale di strutture incluse&quot; sia impostato sul suo valore massimo per includere tutte le strutture al di sopra della cutoff. </li><li> Abbassa la &quot;Regola l&#39;intervallo di inclusione di BitScore&quot; per includere i successi più distanti, o aumentarla per escludere. </li></ol></li><li> Filtraggio facciale facoltativo <ol><li> Fai clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (selezione del colpo) nel primo pannello o semplicemente scorri verso il basso sul pannello C) &quot;Filtrazione facoltativa di strutture correlate per ulteriori analisi&quot;. </li><li> Assicurati che i colpi selezionati rappresentino strutture rilevanti controllando i dettagli della tabella, ad esempio il nome PDB, le specie ei leganti legati. </li><li> Se necessario, perfezionare manualmente il sottoinsieme selezionato delle strutture facendo clic sulle righe della tabella. NOTA: le righe evidenziate con un colore blu descrivono gli ID PDB selezionati per ulteriori analisi nelle schede successive. </li></ol></li></ol> 2. Analisi di allineamento della sequenza multipla (ALIGN) <ol><li> Fare clic sulla scheda ALIGN per eseguire l&#39;allineamento delle sequenze delle strutture selezionate dalla scheda RICERCA. </li><li> Riepilogo di allineamento <ol><li> Esaminare il riepilogo di allineamento nel pannello A) &quot;Riepilogo di allineamento&quot;. Assicurarsi che le regioni d&#39;interesse siano allineate e non mascherate da spazi di una o più strutture. </li><li> Se necessario, spostare le opzioni &quot;Visualizza le opzioni di modifica dell&#39;allineamento&quot; e rimuovere gli ID PDB indesiderati, ad esempio PDB con residui mancanti. </li></ol></li><li> Analisi di allineamento delle sequenze <ol><li> Fai clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (analisi) per eseguire analisi cluster di sequenze sulle strutture raccolte. </li><li> Selezionare l&#39;opzione di trama Dendrogram. Regolare il cluster in slider di gruppi K per partizionare le strutture in gruppi k. </li><li> Facoltativamente modificare il metodo di clustering se desiderato selezionando la casella di controllo Più opzioni di clustering e output. </li></ol&gt; </li><li> Analisi di conservazione residua <ol><li> Fai clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (Conservazione) per calcolare la conservazione del residuo in colonna. </li><li> Selezionare i set di strutture allineati per generare una traccia della conservazione del residuo in ogni posizione di allineamento. </li><li> Selezionare Strutture allineate con l&#39;allineamento dei semi PFAM per mostrare la conservazione calcolata rispetto all&#39;allineamento dei semi associato PFAM contenente membri rappresentativi della famiglia. </li></ol></li><li> Visualizzazione dell&#39;allineamento delle sequenze <ol><li> Fare clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (Allineamento) per visualizzare l&#39;allineamento della sequenza completa con lo strumento di visualizzazione dell&#39;allineamento del browser. </li></ol></li></ol> 3. Struttura e analisi (FIT) <ol><li> Eseguire la sovrapposizione della struttura immettendo la scheda FIT. </li><li> Sovrapposizione della struttura <ol><li> Seleziona la casella di controllo &quot;Mostra PDBs&quot; per visualizzare le proteine ​​allineateN strutture in-browser. </li><li> Assicurarsi che le strutture proteiche siano sovrapposte a regioni corrispondenti e pertinenti da ispezioni visive. Fare clic e trascinare il mouse sulle strutture per ruotare e scorrere fino allo zoom. </li><li> Regolare la colorazione delle strutture cliccando su &quot;Opzioni colore&quot;. Le opzioni di colorazione includono la posizione di allineamento, la variabilità strutturale per posizione, i gruppi di cluster RMSD, i gruppi di cluster di sequenze, le regioni allineate e la struttura secondaria. </li><li> Scaricare le strutture sovrapposte come file PDB convenzionali o come singolo file di sessione PyMOL per la visualizzazione in un programma di visualizzazione molecolare specializzata. </li></ol></li><li> Analisi della struttura <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avanti&quot; (Analisi) blu per eseguire il clustering basato sulle strutture delle strutture PDB raccolte. </li><li> Consente di attivare la finestra Heatmap RMSD nel menu a discesa opzioni Plot. </li><li> Regolare le opzioni di clustering, incluso il metodo di clustering stesso, Selezionando la casella di controllo &quot;Altre opzioni di clustering e output&quot;. NOTA: I dati RMSD in parallelo possono essere visualizzati anche come un dendrogramma, un istogramma o una mappa di calore. </li></ol></li><li> Fluttuazioni residue <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avanti&quot; (RMSF) blu per visualizzare la variabilità strutturale di ciascun residuo (mostrato come una trama RMSF) con i principali elementi della struttura secondaria mostrati nelle regioni marginali dell&#39;asse x. </li><li> Selezionare la casella di controllo Mostra fattori B per sovrapporre i fattori B cristallografici della struttura di riferimento sulla trama RMSF. </li></ol></li></ol> 4. Principal Component Analysis (PCA) <ol><li> Eseguire l&#39;analisi dei componenti principali inserendo la scheda &quot;PCA&quot;. </li><li> Visualizzazione dei componenti principali <ol><li> Seleziona la casella di controllo &quot;Mostra traiettoria PC&quot; per visualizzare i movimenti descritti dai PC con lo strumento di visualizzazione in-browser. </li><li> Assicurarsi che &quot;PrinComponente 1 &quot;viene scelto dal primo menu a discesa. </li><li> Per visualizzare i moti descritti da altri PC, scegliere il PC desiderato dal menu a discesa &quot;Scegli il componente principale&quot;. </li><li> Modificare la colorazione della traiettoria dal menu a discesa &quot;Opzioni colore&quot;. </li><li> Scegliere &quot;Variabilità per posizione&quot; dalle &quot;Opzioni di colore&quot; per colore a magnitudo di spostamento. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Scarica la traiettoria PDB&quot; nel pannello &quot;Principal Component Visualization&quot; per ottenere una vista traiettoria del movimento descritto dai PC. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Scarica PyMOL&quot; per generare un file di sessione PyMOL che fornisce i moti come campo vettoriale. </li></ol></li><li> Analisi del costruttore <ol><li> Proietta le singole strutture su due PC selezionati facendo clic sul pulsante blu &quot;Next&quot; (Plot). </li><li> Assicurarsi che &quot;PC sull&#39;asse X&quot; sia impostato su 1 e &quot;PC oN asse Y &quot;a 2. Per proiettare le strutture su altri PC, regolare adeguatamente la numerazione del PC. </li><li> Scegliere &quot;Cluster by Subspace PC&quot; per colorare le strutture nella trama mediante clustering su PC; &quot;RMSD&quot; da colorare mediante clustering basato su &quot;RMSD&quot;; E &quot;Sequenza&quot; per colorare mediante clustering a sequenza. </li><li> Clicca su qualsiasi punto individuale nella trama per etichettare le strutture. In alternativa, evidenziare una o più strutture nella tabella &quot;annotazione di progettazione conforme PCA&quot; sotto la trama. </li><li> Far scorrere i PC nel cursore dello spazio secondario per includere più o meno PC per l&#39;algoritmo di clustering. </li></ol></li><li> Contributi residui <ol><li> Calcola i contributi residui nei singoli PC facendo clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (contributi residui). </li><li> Inserisci i contributi per i PC aggiuntivi includendo il numero di PC nella casella di testo &quot;Scegli componente principale&quot;. </li><li> Attiva la voce &quot;Spread liNomi &quot;evitano di plottare i contributi dei residui sopra l&#39;altro. </li><li> Disattiva la casella di controllo &quot;Multiline plot&quot; per tracciare i contributi residui in appositi diagrammi. </li><li> Attiva la voce &quot;Mostra RMSF&quot; per includere i valori RMSF (dalla scheda FIT). </li></ol></li></ol> 5. Analisi dell&#39;analisi di modalità normale (eNMA) <ol><li> Fare clic sulla scheda eNMA per avviare il calcolo dei normali modi (NMs). </li><li> Struttura del filtro <ol><li> Regolare il numero di strutture abbassando o aumentando il &quot;Cutoff&quot; per l&#39;inclusione / esclusione della struttura. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Run Ensemble NMA&quot; verde per avviare il calcolo NMA. </li></ol></li><li> Visualizzazione dei modi normali <ol><li> Scorri verso il basso fino al secondo pannello della scheda eNMA (Visualizzazione modi normali) per la visualizzazione delle NM. NOTA: per impostazione predefinita, l&#39;NM con la sovrapposizione più alta (somiglianza) con PC-1 viene visualizzata nella visualizzazioneFinestre. </li><li> Per visualizzare i moti descritti da altri NMs o altre strutture PDB, scegliere la struttura NM e struttura desiderata rispettivamente dai menu a discesa &quot;Scegli la modalità&quot; e &quot;Mostra NM per struttura&quot; . </li></ol></li><li> Fluttuazioni residue <ol><li> Fare clic sul pulsante blu &quot;Next&quot; (fluttuazioni) per calcolare le fluttuazioni residue delle strutture selezionate per eNMA. </li><li> Attiva il &quot;Cluster by RMSD&quot; per colorare i profili di fluttuazione tramite clustering basati su RMSD. </li><li> Attivare il &quot;Cluster by RMSIP&quot; per colorare i profili di fluttuazione tramite clustering basato su RMSIP. </li><li> Consente di attivare la casella di controllo &quot;Linee di diffusione&quot; per tracciare i profili di fluttuazione raggruppati separati l&#39;uno dall&#39;altro. </li></ol></li><li> Confronto tra NMA e PCA <ol><li> Fai clic sul pulsante blu &quot;Avanti&quot; (PCA-vs-NMA) per calcolare la somiglianza tra i singoli NM ei PC. </li><li> Selezionare un PDB ID dal menu a discesa &quot;Confronta NMs of structure&quot; per calcolare la somiglianza tra i NM di questa struttura ai PC calcolati nella scheda PCA. </li></ol></li><li> Analisi sovrapposte <ol><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Next&quot; (Overlap analysis) blu per calcolare la sovrapposizione tra NMs calcolati e il vettore di differenza di struttura tra due strutture selezionate. </li><li> Selezionare un ID PDB di riferimento dal menu a discesa &quot;Confronta NMs di struttura&quot; e uno o più ID PDB nella tabella struttura per il confronto paritario con il PDB di riferimento. </li></ol></li><li> Analisi clustering <ol><li> Fare clic sul pulsante blu &quot; Avanti&quot; (Clustering) per eseguire il clustering delle strutture basato sulla similitudine di coppia NM (RMSIP). </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Bio3D-web può essere utilizzato per esplorare e mappare interamente gli stati strutturali, dinamici e funzionali delle proteine ​​dalle strutture cristallografiche disponibili. Inoltre, i risultati di clustering basati su NMA e PCA, insieme alle annotazioni e all&#39;analisi a sequenza, possono essere particolarmente utili per la selezione di strutture rappresentative per un&#39;analisi più lunga del tempo, come la simulazione di docking a piccole molecole o simulazioni di dinamica molecolare. Bio3D-web consente quindi un&#39;analisi avanzata di bioinformatica strutturale per una vasta gamma di ricercatori riducendo il livello richiesto di competenze tecniche. Il progetto attuale di Bio3D-web sottolinea la semplicità per l&#39;inclusione esaustiva dei numerosi metodi di analisi disponibili nel pieno pacchetto Bio3D autonomo. In molti casi si prevede che i ricercatori utilizzeranno Bio3D-web per comprendere le tendenze generali nella loro famiglia di proteine ​​o superfamilie di interesse, che possono quindi informare analisi più specializzate. Bio3D-web è ilProgettato per esplorare rapidamente i set di dati della struttura biomolecolare e per agire come strumento per generare ipotesi. Incoraggiamo gli utenti ad esplorare ulteriormente i loro dati fornendo codice Bio3D di esempio nel rapporto riproducibile che memorizza anche tutti i dettagli della query e i risultati dell&#39;analisi. Nel protocollo esemplificativo illustrato sopra, mostriamo la capacità di Bio3D-web di rivelare le caratteristiche strutturali delle transizioni funzionale conformazionali di Adk. Ulteriori applicazioni di Bio3D-web includono l&#39;analisi strutturale e dinamica delle strutture PDB caricate dall&#39;utente. Ad esempio, l&#39;utente può caricare nuove strutture o addirittura sequenze di proteine ​​per l&#39;analisi. Le fasi di analisi citate in precedenza, in particolare la fase eNMA, possono rivelare le tendenze locali e globali nei moti proteici, con motivi collettivi di significato funzionale. Il confronto con strukture apo può anche rivelare caratteristiche di non legate a transizioni conformazionali legate. Ulteriori esempi di applicazione aUna gamma di famiglie proteiche diverse vengono fornite online. Anche se tutte le proteine ​​sono entità flessibili e dinamiche, non tutte le proteine ​​hanno strutture di risoluzione atomica disponibili in una gamma di stati diversi ( ad esempio stati attivi e inattivi). La nostra visione dello spazio della struttura proteica è quindi limitata e quindi la comprensione ottenuta da strumenti quali Bio3D-web è necessariamente limitata anche per alcune proteine. Tuttavia, con i progressi tecnologici attuali e le nuove iniziative per la genomica strutturale, il protocollo qui presentato diventerà sempre più un percorso importante per acquisire un&#39;idea di importanti relazioni tra strutture e funzioni. Un passo critico, particolarmente importante quando si analizza le proteine ​​più distanti, è la nascita potenziale di errori di allineamento nella scheda ALIGN. Gli errori di allineamento avverranno inevitabilmente quando la somiglianza della sequenza scende al di sotto del 30% e in tal caso l&#39;utente deve verificare e correggere l&#39;allineamento delle sequenzeNella scheda ALIGN. Gli errori di allineamento potrebbero eventualmente provocare strutture non sovrapposte nella scheda FIT e mascherare le variazioni conformazionali più rilevanti per il PCA successivo. Inoltre, l&#39;utente dovrebbe essere consapevole dei residui mancanti nelle strutture PDB selezionate, come nella presente attuazione PCA può essere eseguita solo sui residui proteici in cui tutte le strutture hanno il loro corrispondente atomo alfa di carbonio risolto. Di conseguenza, se un PDB selezionato ha residui irrisolti per una determinata regione della proteina questa regione verrà omessa da PCA. Il Bio3D-web è attualmente limitato all&#39;analisi delle strutture PDB a catena singola. Di conseguenza, i movimenti funzionali a livello quaternario non possono essere esplorati utilizzando il protocollo attuale. Anche se stiamo sviluppando nuovi algoritmi per includere tali analisi in Bio3D-web, l&#39;unica opzione attuale è quella di utilizzare convenzionali Bio3D. Bio3D-web è l&#39;unico applicativo onlineIone che consente di interrogare e identificare set di strutture, interpretare i loro modelli di sequenza e variabilità strutturale e estrarre informazioni meccaniche sia dall&#39;analisi che dalla predizione della loro plasticità strutturale. Una vasta gamma di strumenti di visualizzazione molecolare e server online consentono ai ricercatori di esplorare e analizzare le singole strutture biomolecolari. Tuttavia, gli strumenti esistenti per analizzare la sequenza, la struttura e le dinamiche delle famiglie di proteine ​​eterogenee di grandi dimensioni richiedono una significativa competenza computazionale e in genere rimangono accessibili solo agli utenti con competenze di programmazione pertinenti. Ad esempio, il pacchetto Bio3D richiede R 8 , ProDy richiede pitone e Maven richiede la conoscenza di Matlab 9 , 10 . Bio3D-web in contrasto non richiede conoscenze di programmazione e quindi aumenta l&#39;accessibilità e diminuisce la barriera all&#39;ingresso per eseguire avanzate sequenze comparative, struttura e dyAnalisi dei nomi. Inoltre, è incluso il servizio Bio3D-web per la preparazione, la cura, l&#39;annotazione e la pulizia delle strutture molecolari spesso necessarie per un&#39;analisi efficiente. Inoltre, la restrizione all&#39;esecuzione di tali analisi sulle risorse computazionali possibili è attenuata dalla nostra istanza server che consente un&#39;analisi su vasta scala di molte strutture che possono essere avviate e controllate da qualsiasi browser web moderno. Lo sviluppo aperto di Bio3D-web è in corso (vedi https://bitbucket.org/Grantlab/bio3d). Continuiamo ad aggiungere nuove funzionalità di analisi e migliorare i metodi esistenti. Lo sviluppo futuro si concentrerà sull&#39;aggiunta di PCA a base di matrici a distanza e PCA torsionale, più approfonditi approcci di conservazione della sequenza che includono una componente filogenetica, l&#39;identificazione del sito di rilegatura dell&#39;assemble, e nuovi approcci per l&#39;analisi dinamica della rete in tutte le famiglie di proteine. A questo proposito l&#39;attuale applicazione web rappresenta la punta di partenzaT per molti altri flussi di lavoro strutturali di analisi strutturale bioinformatica consentendo passi riproducibili e condivisi su set di strutture sperimentali definite dall&#39;utente. Pianziamo anche il supporto futuro di gruppi di coordinate biologiche ricostruite in aggiunta alle catene individuali e molteplici dell&#39;unità asimmetrica delle strutture PDB. Ulteriori funzioni includono il miglioramento del risparmio e il caricamento di spazi di lavoro collaborativi insieme ad una possibilità di annullamento. Bio3D-web è un&#39;applicazione online per l&#39;analisi interattiva dei dati della struttura biomolecolare. Bio3D-web funziona su qualsiasi browser web moderno e fornisce funzionalità per: (1) l&#39;identificazione della struttura proteica correlata imposta a soglie specificate dall&#39;utente di somiglianza; (2) la loro sovrapposizione multipla e la struttura della sovrapposizione; (3) Analisi di conservazione delle sequenze e delle strutture; (4) mappatura delle relazioni interconforme con l&#39;analisi di componenti principali e (5) confronto delle dinamiche interne previste tramite l&#39;insieme eMal analisi di modalità. Questa funzionalità integrata fornisce un flusso di lavoro completo per l&#39;analisi delle relazioni tra strutture e dinamiche sequenziali all&#39;interno delle famiglie di proteine ​​e delle superfamiglie. Oltre ad una comoda interfaccia dinamica facile da usare per esplorare gli effetti delle scelte di parametri e metodi, Bio3D-web registra anche l&#39;input completo dell&#39;utente e i risultati grafici successivi della sessione di un utente. Questo consente agli utenti di condividere e riprodurre facilmente la sequenza di fasi di analisi che hanno creato i loro risultati. BIO3D-web è interamente attuato nel linguaggio R e si basa sui pacchetti Bio3D e Shiny R. Può essere eseguito dal nostro server online o installato localmente su qualsiasi computer che esegue R. Questo include l&#39;installazione del server locale per fornire un&#39;istanza multiutente personalizzata con accesso a set di dati strutturali prioritari come quelli comuni nell&#39;industria farmaceutica. Il codice sorgente completo e un&#39;ampia documentazione sono forniti con una licenza open source GPL-3 da: http://thegrantlab.org/ Bio3d / webapps

La banca dati proteica (PDB) contiene ora più di 120.000 strutture proteiche - molte delle quali sono della stessa famiglia proteica ma risolte in condizioni sperimentali differenti. Queste strutture multiple rappresentano una risorsa inestimabile per comprendere le complessità della forma e della funzione proteica. Ad esempio, il confronto rigoroso di questi gruppi strutturali può rivelare meccanismi molecolari importanti 1 , 2 , 3 e informare sulle dinamiche conformazionali coinvolte nei processi, tra cui legame legame, catalisi enzimatica e riconoscimento bi-molecolare 4 , 5 , 6 , 7 . Nuove acquisizioni possono essere spesso ottenute dalla dettagliata analisi su larga scala della sequenza, struttura e dinamica delle famiglie proteiche. Tuttavia, ciò richiede in genere una notevole bioinfL&#39;ormatica e la competenza di programmazione informatica insieme alla familiarità con i sistemi proteici in studio. Ad esempio, i pacchetti software come Bio3D, ProDy e Maven richiedono la programmazione in R, Python e Matlab rispettivamente 8 , 9 , 10 . Al contrario, gli strumenti online per l&#39;analisi della flessibilità strutturale sono generalmente limitati all&#39;indagine delle singole strutture 11 , 12 . Un&#39;eccezione a questo proposito è il WebNM @ server di recente sviluppo, che consente il confronto tra modelli di flessibilità ottenuti dall&#39;analisi di modalità normale (NMA) di diverse strutture specificate dall&#39;utente precedentemente allineate 13 . Tuttavia, questo server non dispone di una procedura automatizzata per l&#39;identificazione di strutture per il confronto, il loro allineamento o ulteriori analisi oltre la NMA. Un altro contributo recente è il database online PDBFlex, che presenta pre-cAnalisi ompleta delle strutture PDB che condividono l&#39;identità di sequenza del 95% o superiore 14 . Tuttavia, l&#39;analisi di set di strutture più diverse non è attualmente disponibile. Abbiamo precedentemente presentato Bio3D-web - un&#39;applicazione web facile da usare per l&#39;analisi delle relazioni strutturali-sequenza-struttura-proteina 15 . Bio3D-web è unico nel fornire funzionalità integrate di facile utilizzo per l&#39;identificazione, il confronto e l&#39;analisi dettagliata dei grandi set di strutture omologhe on-line. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l&#39;analisi in linea della relazione di struttura-dinamiche delle proteine ​​con Bio3D-web. Bio3D-web fornisce una varietà di funzioni per supportare i cinque principali passaggi di analisi dei dati mostrati in Figura 1 e discussi in dettaglio nel seguito. Queste fasi costituiscono un flusso di lavoro che si estende dalla sequenza di query o da input di struttura, attraverso diversi livelli di analisi di sequenza-struttura-dinamica, per riepilogareY generazione di report. I risultati sono disponibili immediatamente attraverso estese funzionalità di visualizzazione e tracciatura dei browser, nonché scaricando i file di risultati in formati comunemente utilizzati. Oltre ad una comoda interfaccia dinamica facile da usare per esplorare gli effetti delle scelte di parametri e metodologie, Bio3D-web registra anche l&#39;intero input utente e i successivi risultati grafici della sessione dell&#39;utente come rapporto riproducibile in formato PDF, DOC e HTML. Le sessioni utente possono essere salvate e ricaricate in tempi futuri e completare i risultati scaricati e ulteriormente interpretati dal pacchetto Bio3D R sulla macchina locale di un utente. Bio3D-web è alimentato dal pacchetto Bio3D R per l&#39;analisi della struttura biomolecolare, sequenza e dati di simulazione molecolare 8 , 16 . In particolare, gli algoritmi Bio3D per l&#39;identificazione rigido-nucleo 8 , sovrapposizione, analisi dei componenti principali(PCA) 8 , e l&#39;analisi di modalità normale (eNMA) 16 costituiscono la base dell&#39;applicazione. Utilizziamo anche protocolli Bio3D che dipendono da pHMMER 17 per l&#39;identificazione di strutture proteiche correlate e MUSCLE 18 per allineamento sequenziale multiplo. Le annotazioni della struttura e della sequenza vengono ricavate da utilità Bio3D dai database RCSB PDB 19 e PFAM 20 . Bio3D-web può essere eseguito dal nostro server online o installato localmente su qualsiasi computer che esegue R. Bio3D-web è aperto a tutti gli utenti e viene fornito gratuitamente sotto una licenza open-source GPL-3 da: http: // thegrantlab. org / bio3d / webapps

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio3D-web</td>
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			<td></td>
			<td></td>
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			<td>Web-site</td>
			<td>http://thegrantlab.org/bio3d-web/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Requirements</td>
			<td>Web browser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein sequence-structure-dynamics relationships with bio3d-web

Abbiamo dimostrato l&#39;utilizzo di Bio3D-web per l&#39;analisi interattiva dei dati della struttura biomolecolare. L&#39;applicazione Bio3D-web offre funzionalità online per: (1) l&#39;identificazione della struttura proteica correlata si imposta in soglie specificate dall&#39;utente di somiglianza; (2) la loro sovrapposizione multipla e la struttura della sovrapposizione; (3) Analisi di conservazione delle sequenze e delle strutture; (4) mappatura delle relazioni interconforme con l&#39;analisi di componenti principali e (5) confronto delle dinamiche interne previste tramite analisi di modalità normale di ensemble. Questa funzionalità integrata fornisce un flusso di lavoro in linea completo per indagare le relazioni tra strutture e dinamiche sequenziali all&#39;interno delle famiglie di proteine ​​e delle superfamiglie.

L&#39;adenilato-chinasi (Adk) è un enzima onnipresente che funge da mantenimento dell&#39;equilibrio tra nucleotidi citoplasmatici essenziali per molti processi cellulari. Adk opera catalizzando il trasferimento reversibile di un gruppo fosforile da ATP a AMP. Questa reazione è accompagnata da transizioni conformazionali limitative di velocità ben studiate 3 , 21 . Qui analizziamo tutte le strutture attualmente disponibili di Adk con Bio3D-web per rivelare le caratteristiche dettagliate ei principi meccanici di queste transizioni essenziali. Possiamo iniziare la nostra analisi Bio3D-web di Adk inserendo il codice PDB RCSB di qualsiasi struttura Adk conosciuta. Ad esempio, immettere il PDB ID 1AKE nel pannello A della scheda RICERCA restituisce le sequenze 167 di strutture analoghe da cui i primi 26 vengono automaticamente selezionati per ulteriori analisi (vedere il pannello B). L&#39;annotazione presenteNel pannello C indica che queste strutture selezionate sono tutte di E. coli, sono state risolte per diffrazione in raggi X in una gamma di gruppi spaziali; Hanno una gamma di risoluzione da 1,63 a 2,8 Å e sono stati co-cristallizzati con una gamma di diversi ligandi (compresi non ligandi, AMP, ADP, MG e l&#39;inibitore AP5). Si noti che ulteriori dettagli di annotazione possono essere visualizzati facendo clic sull&#39;opzione &quot;Mostra / Nascondi colonne&quot; nel pannello C. All&#39;allineamento della sequenza multipla viene eseguita dopo aver inserito la scheda ALIGN. Il primo pannello della scheda ALIGN visualizza un riepilogo dell&#39;allineamento fornendo dettagli sul numero di righe di sequenza (equivalenti al numero di strutture PDB), nonché il numero di posizioni (ad es. Le colonne di allineamento). Ciò include una specifica del numero di colonne contenenti gap e non gap. La figura sul lato destro della prima riga fornisce una rappresentazione schematica dell&#39;allineamento delle sequenze. Qui thLe aree grigie rappresentano posizioni non gap, mentre le aree bianche nell&#39;allineamento corrispondono a vuoti. Una rappresentazione della sequenza di conservazione è mostrata sopra l&#39;allineamento con aree rosse che indicano posizioni ben conservate e bianco che indica meno conservato. Si noti che le sequenze in questa figura sono ordinate in base alla loro somiglianza fornita dal dendrogram di clustering sul lato sinistro. Il secondo pannello di questa scheda agevola ulteriormente il raggruppamento dei PDB selezionati in base alla loro somiglianza di sequenza di coppia, che può essere visualizzata sia come un dendrogramma che una mappa di calore. Per impostazione predefinita, viene mostrato un dendrogramma (o un diagramma a albero) che rappresenta la disposizione dei cluster. L&#39;asse y del dendrogram rappresenta la distanza (in termini di identità di sequenza) tra i cluster. La sovrapposizione della struttura viene eseguita automaticamente entrando nella scheda FIT. Le strutture sovrapposte, visualizzate interattivamente nel pannello A, indicanoLa presenza di una regione nucleare relativamente rigida (che comprende i residui 1-29, 68-117 e 161-214; vedere il pannello &quot;dettagli opzionali e RMSD&quot; nella parte inferiore della scheda FIT per dettagli). Sono anche chiaramente visibili altre due regioni di legame nucleotidico variabili (residui 30-67 e 118-167) ( Figura 2 ). I gruppi di clustering basati su RMSD creano queste strutture in due configurazioni distinte. Facendo clic sulla scheda PCA è più chiara la relazione tra le strutture in termini di spostamenti di queste regioni che si chiudono in modo efficace sulle specie nucleotide legate in strutture correlate ( Figura 2B e 2C ). La maggior parte delle strutture sono in forma &quot;chiusa&quot; (azzurro nella figura 2C ) e sono associate ad un legante legato o inibitore. In contrasto le più &quot;aperte&quot; conformazioni sono nucleotidi e inibitori liberi. Questo è coerente conIl vasto ricercatore sulla struttura e la dinamica di Adk che indica che è necessaria una configurazione aperta di queste regioni per il legame nucleotidico e una conformazione chiusa per un efficiente trasferimento di fosforilato e la soppressione di eventi idrolisi dannosi. È notevole che un singolo PC blocca il 97% dello spostamento quadrato medio totale in questo set di struttura Adk e fornisce una descrizione chiara e impellente della transizione aperta a chiusa insieme ai singoli contributi di residui a questo spostamento funzionale (pannello C dell&#39;applicazione E la figura 2 ). Visitare la scheda NMA e aumentare il numero di strutture considerate per il calcolo (riducendo il taglio per il filtraggio di strutture simili) indica che le strutture di stato aperto mostrano dinamica locale e globale più avanzata rispetto alle strutture a forma di chiusura ( Figura 2D e pannello C dell&#39;app) . Confronto tra PCA e NMA perLe singole strutture (pannello D) indica che il primo modo di tutte le strutture a forma aperta mostra un sovrapposizione relativamente elevata a PC1 (con un valore medio di 0,37 ± 0,04). Al contrario, le strutture a forma di chiusura mostrano valori inferiori (con una media di 0.30 ± 0.01). I valori RMSIP per strutture a forma aperta (0,62 ± 0,003) sono anche superiori a quelle delle strutture chiuse (0,56 ± 0,008). Inoltre, l&#39;analisi di sovrapposizione mostra che i primi modi dello stato aperto sono in ottimo accordo con la modifica conformazionale che descrive la differenza degli stati aperti e chiusi (pannello E). Il clustering basato sui valori RMSIP visualizza ancora una partizione coerente delle strutture di stato aperto e chiuso (pannello F). Complessivamente questi risultati indicano l&#39;esistenza di due principali stati conformazionali distinti per Adk. Questi differiscono da uno spostamento collettivo a bassa frequenza di due regioni del sito che legano nucleotidi che mostrano flessibili distintiLità sul legame nucleotidico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica web Bio3D con schermate delle schede PCA e NMA. Bio3D-web richiede una struttura o una sequenza di proteine ​​forniti dall&#39;utente come input nella scheda RICERCA ( 1 ). Il server fornisce un elenco di strutture correlate, che possono essere selezionate per ulteriori analisi. ( 2 ) La scheda ALIGN fornisce l&#39;allineamento delle sequenze e l&#39;analisi delle strutture selezionate nella scheda RICERCA. ( 3 ) Nella scheda FIT tutte le strutture vengono sovrapposte e visualizzate in 3D insieme ai risultati dell&#39;analisi tradizionale delle strutture a coppia. ( 4 ) L&#39;analisi del componente principale del set di struttura viene eseguita nella scheda PCA per caratterizzare le relazioni interconforme. ( 5 ) L&#39;analisi del modo normale su ogni struttura può essere eseguita nella scheda eNMAPer esplorare le tendenze dinamiche per gli stati strutturali disponibili. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55640/55640fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig2.jpg" /> Figura 2: Risultati della analisi Bio3D-web di adenilato-chinasi. ( A ) Strutture PDB disponibili di adenilato-chinasi sovrapposte sul nucleo invariante identificato. Le strutture sono colorate in base al clustering basato su RMSD fornite nella scheda FIT. ( B ) La visualizzazione dei componenti principali è disponibile dalla scheda PCA per caratterizzare le principali variazioni conformazionali del set di dati. Qui la traiettoria corrispondente alla prima componente principale è mostrata nella rappresentazione del tubo che mostra il movimento di chiusura su larga scala della proteina. ( C ) Le strutture sono prOjected sulle loro due prime componenti principali in un diagramma conformer che mostra una rappresentazione a bassa dimensione della variabilità conformazionale. Ogni punto (o struttura) viene colorato in base ai criteri specificati dall&#39;utente, in questo caso i risultati di clustering basati su PCA. ( D ) L&#39;analisi di modalità normale nella scheda eNMA suggerisce una dinamica locale e globale avanzata per le strutture in stato aperto (rosso) rispetto alle strutture a forma di chiusura (blu). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55640/55640fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Viene presentato un protocollo per l&#39;analisi in linea delle relazioni tra proteine ​​sequenza-struttura-dinamiche utilizzando Bio3D-web.

Indagine sulla proteina Sequenza-struttura-dinamica Relazioni con Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

investigating-protein-sequence-structure-dynamics-relationships-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.3K Views.  University of Michigan Medical School.  Viene presentato un protocollo per l'analisi in linea delle relazioni tra proteine ​​sequenza-struttura-dinamiche utilizzando Bio3D-web. 

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Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Ricerca

Biochimica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction phase problem. Novel structures that lack a suitable homology model are often derivatized with heavy atoms to provide experimental phase information. The presented protocol efficiently generates derivatized protein crystals by combining random microseeding matrix screening with derivatization with a heavy atom molecule I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). By incorporating I3C into the crystal lattice, the diffraction phase problem can be efficiently solved using single wavelength anomalous dispersion (SAD) phasing. The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows for rapid validation of a correct anomalous substructure. This protocol will be useful to structural biologists who solve macromolecular structures using crystallography-based techniques with interest in experimental phasing.

This article presents a method to generate protein crystals derivatized with I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) using microseeding to generate new crystallization conditions in sparse matrix screens. The trays can be set up using liquid dispensing robots or by hand.

Derivazione di cristalli proteici con I3C utilizzando lo screening casuale della matrice microseed

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein aggregation. The accumulation of protein aggregates in bacterial cells can lead to significant alterations in the cellular phenotypic behavior, including a reduction in growth rates, stress resistance, and virulence. Several experimental procedures exist for the examination of these stressor-mediated phenotypes. This paper describes an optimized assay for the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from different Escherichia coli strains after treatment with a silver-ruthenium-containing antimicrobial. This compound is known to generate reactive oxygen species and causes widespread protein aggregation. 
The method combines a centrifugation-based separation of protein aggregates and soluble proteins from treated and untreated cells with subsequent separation and visualization by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining. This approach is simple, fast, and allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in different E. coli strains. The methodology has a wide range of applications, including the possibility to investigate the impact of other proteotoxic antimicrobials on in vivo protein aggregation in a wide range of bacteria. Moreover, the protocol can be used to identify genes that contribute to increased resistance to proteotoxic substances. Gel bands can be used for the subsequent identification of proteins that are particularly prone to aggregation.

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

This protocol describes the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from Escherichia coli after treatment with a proteotoxic antimicrobial. Following this procedure allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in vivo in different bacterial strains and/or between treatments.

Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an enormous amount of spectra, setting challenges for quality control of the mass spectrometry spectra. To reduce the false positives, false discovery rate (FDR) quality control is necessary. Recently, we developed a software for FDR control of untargeted metabolome identification that is based on a Target-Decoy strategy named XY-Meta. Here, we demonstrated a complete analysis pipeline that integrates XY-Meta and metaX together. This protocol shows how to use XY-meta to generate a decoy database from an existing reference database and perform FDR control using the Target-Decoy strategy for large-scale metabolome identification on an open-access dataset. The differential analysis and metabolites annotation were performed after running metaX for metabolites peaks detection and quantitation. In order to help more researchers, we also developed a user-friendly cloud-based analysis platform for these analyses, without the need for bioinformatics skills or any computer languages.

We constructed an untargeted metabolomic workflow that integrated XY-Meta and metaX together. In this protocol, we displayed how to use XY-Meta to generate a decoy spectral library from open access spectra reference, and then performed FDR control and used the metaX to quantitate the metabolites after identifying the metabolomics spectra.

Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione sul metaboloma non mirato basato sul controllo FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...