Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
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Gli autori ringraziano tutti gli attuali e ex membri del laboratorio di Cobb per lavori e discussioni preziose e Dionne Ware per l&#39;assistenza amministrativa. Questi studi sono stati sostenuti dal National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e dalla Fondazione Welch Grant I1243 a MHC

1. Risorse di depurazione delle chinasi e pipeline di immunoprecipitazione generale NOTA: Le cinasi usate con questo dosaggio possono essere provenienti da immunoprecipitati di cellule colte o mediante mezzi ricombinanti come la purificazione affinità 6 . Di seguito è riportato un protocollo generale per l&#39;immunoprecipitazione contrassegnata dalla bandiera che può essere necessario modificare a seconda della chinasi di interesse. Tutto dovrebbe essere mantenuto sul ghiaccio quando possibile. <ol><li> Aggiungere 2 μL di 1 mg / mL di anticorpi a 200 μL di lisati cellulari (di solito ~ 1 mg / ml di concentrazione totale di proteine) e incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo. </li><li> La proteina di lavaggio Una seperarosa si perda 2-3 volte con il tampone di lisi (vedi sotto) brevettando brevemente a 4 ° C per 30 s a 1 min a 5.000 xg (&quot;spin di tocco&quot;), rimuovendo il surnatante con una pipetta e riutilizzando le perle in tampone . <ol><li> Preparare il tampone di lisi: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerolo, 0,2 mM orthovanadato di sodio, 100 mM fluoruro di sodio, 50 mM β-glicerofosfato, 0,1% Triton X 100 o 0,1% NP-40. </li></ol></li><li> Aggiungere 30 μL di sospensione del 50% di branoli di seperarina di proteina A nel lysis buffer a lisati; Incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo. </li><li> Toccare lo spin a 4 ° C per far pelliccare le perle e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio a goccia (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4). </li><li> Lavare una volta con tampone di reazione di chinasi 1x (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Rimuove il maggior numero di tamponi possibile senza rimuovere le perle. </li></ol> 2. Inizializzare le reazioni della chinasi NOTA: Per i dosaggi di IP chinasi, ~ 15 μL di branelli non sospesi è un tipico campione di partenza. Per i dosaggi ricombinanti della proteina chinasi, gli importi tipici di partenza sono compresi tra 0,1 e 1,0 μg in 1-10 per 25-50 μL di volumi di reazione finale. Regolare i volumi del campione proteico ricombinanteS per essere uguale al buffer che sono memorizzati prima di inizializzare il saggio. Quando si utilizzano alte quantità di chinasi, includere una proteina portante come BSA per aiutare a mantenere la stabilità proteica per la durata del saggio. <ol><li> Preparare il 5x reazione di reazione di chinasi sotto riportato: 50 mM HEPES pH 8,0 50 mM di MgCl2 50 mM Benzamidina (inibitore della proteasi) 50 mM DTT (agente di riduzione) 250 μM ATP (non etichettati o &quot;freddi&quot;) </li><li> Tenere i campioni di chinasi su ghiaccio in tubi da 1,5 ml. Preparare la seguente miscela di reazione in tubi separati, refrigerati di 1,5 mL: 21 μl H 2 O 6 μL di tampone di reazione di chinasi 5x 1 μl ATP radiomarcato (&quot;caldo&quot;) 2 μL di substrato (~ 5 mg / ml) NOTA: per i dosaggi ricombinanti di chinasi, il volume può essere regolato per contenere proteine ​​purificate. Calcolare tale che il volume di reazione finale è di 30 μL. Utilizza questa ricetta per preparare un maestromescolare. Al ricevimento di ATP etichettato, diluire la riserva in H 2 O ad un&#39;attività specifica di 0,01 mCi / μl prima di aggiungere alla miscela di reazione. </li><li> Per inizializzare il saggio, aggiungere tutta la miscela di reazione al campione di chinasi e incubare la reazione a 30 ° C per 5 minuti a 1 h a seconda dell&#39;attività di chinasi in fase di analisi. NOTA: quando si lavora con una chinasi la cui attività non è stata precedentemente misurata, eseguire un tempo di attività di chinasi con intervalli di 5 minuti tra i punti di tempo. </li></ol> 3. Terminazione di reazione e SDS-PAGE <ol><li> Arrestare la reazione mettendo in ghiaccio e aggiungendo 7,5 μL di tampone di campione 5x Laemmli 6 . </li><li> Scaldare a 100 ° C per 30 secondi fino a 2 minuti nel blocco termico. </li><li> Toccare lo spin e caricare 20 μL per pozzetto sul 10-15% SDS-PAGE gel. Far eseguire gel sufficientemente a lungo per separare la chinasi e il substrato (tipicamente 1 h a potenza costante di 5 W). Assicurarsi di mantenere schermato l&#39;apparecchiatura gel per limitare l&#39;esposizione a 32 </sup&gt; P. <ol><li> Qui usi gli apparecchi di gelatina fatti in casa, ma i minigelchi standard commercialmente disponibili sono perfettamente adatti. Utilizzare le dimensioni come segue: Gel: 8 cm di larghezza, 5,5 cm di lunghezza (risolvendo), spessore 1,5 mm. Pettini: 15 pozzetti, spessore 1,5 mm, larghezza 2,9 mm, profondità 16 mm </li></ol></li></ol> 4. Colorazione e asciugatura del gel Attenzione: Per tutti i passaggi, assicurarsi di ridurre l&#39;esposizione personale a 32 P utilizzando schermatura radioattiva e indossare dispositivi di protezione individuale. Per ulteriori informazioni su passaggi specifici sono inclusi alcuni riferimenti utili. <ol><li> Togliere il gel da lastre di vetro / allumina e mettere in 50 ml di colorante Coomassie (10% acido acetico glaciale, 50% metanolo, 0,25% R-250) per 1 ora su un agitatore orbitale impostato a 50 giri / min. Per questo passo utilizzare un contenitore leggermente più grande del gel stesso. 8 </li><li> Spostare il gel dalla macchia alla soluzione di fissaggio (10% acetato glaciale acciD, 20% metanolo) al fine di de-macchia. Far scivolare il gel in 600-700 ml di soluzione di fissaggio durante la notte su agitatore orbitale a 50 giri / min. Posizionare pezzi di spugna o salviette di laboratorio annodate nel contenitore con il gel per assorbire il colorante Coomassie 8 , 9 . </li><li> Togliere il gel dalla soluzione di fissaggio e immergere in 200 mL di metanolo per 1-2 minuti con agitazione gentile fino a quando il gel si trasforma in bianco latteo. Ciò contribuirà a prevenire fessurazioni durante la fase di asciugatura. </li><li> Bagnare un pezzo di carta filtrante qualitativa da 14 cm x 14 cm con metanolo e mettere su asciugatrice a vuoto a gel di lastre. Posare il gel sul lato frontale della carta filtrante rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Coprire con cura il gel con un involucro di plastica per evitare le rughe e le bolle d&#39;aria. Azionare l&#39;asciugatrice per 1,5 ore a 80 ° C. Dopo aver raggiunto il vuoto, aprire il coperchio ed estrarre eventuali bolle d&#39;aria, se necessario, con un soffietto in gomma morbida. </li></ol> 5. Autoradiogrammi e contatti di scintillazione <ol><li> Rimuovi driEd attaccare un indicatore di autoradio, righello fosforescente o punti sulla carta filtrante sul lato del gel. Se si usano i puntini verificare che siano in un modello asimmetrico. Questo allineerà il gel con il film dopo l&#39;esposizione e lo sviluppo. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per controllare l&#39;intensità del segnale. Per un segnale più debole di esposizione a -70 ° C a -80 ° C con uno schermo di intensificazione aumenterà la densità della banda del film. </li><li> In una stanza buia mettere il gel asciugato in una cassetta con film e uno schermo intensificante nel seguente ordine dall&#39;alto verso il basso: gel, film, schermo intensificante. </li><li> Fissare lo schermo di intensificazione al coperchio della cassetta e applicare il gel sul posto per facilitare questo passaggio. Lo schermo intensificante emette luce quando irradiato dalle particelle beta dal 32 P. Le emissioni di luce penetrano in modo più efficace del film rispetto alle particelle beta. <ol><li> Assicurarsi che la lunghezza d&#39;onda emessa dallo schermo di intensificazione correscaStagni ad una lunghezza d&#39;onda il film è più sensibile a. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per determinare quanto tempo lasciare l&#39;esposizione per: se il numero di cpm è di ~ 100 o inferiore, prova a notte a -70 ° C. Se il conteggio è di ~ 10.000, iniziare con un&#39;esposizione di 1h e ottimizzare da lì. </li></ol></li><li> Alla conclusione dell&#39;esposizione rimuovere il film e svilupparsi in un processore medico / a raggi X. Se l&#39;esposizione è stata eseguita a -70 - -80 ° C, lasciare che la cassetta si riscaldi a temperatura ambiente per minimizzare la condensa sulla pellicola o rimuovere la pellicola immediatamente prima delle forme di condensazione 10 . </li><li> Posare la pellicola sopra il gel essiccato / carta filtrante e allineare l&#39;immagine del marker / punti con i marcatori / punti sul gel essiccato. Segna sul film le bande corrispondenti agli standard proteici. Etichettare le norme proteiche e quali corsie le reazioni sono per riferimento futuro. </li><li> Incise le bande del gel che corrispondono a bande di interesse sul film e li piazzanoIn fiale di scintillazione da 7 ml. Aggiungere 4 ml di liquido di scintillazione e contare con contatore di scintillazione liquida. Confermare che il contatore sia impostato per monitorare la corretta finestra dello spettro di energia per 32 P. NOTA: Assicurarsi inoltre di accisciare la banda corrispondente al substrato dalla corsia di controllo non-chinasi. Questo verrà utilizzato per calcolare la radiazione di sfondo che verrà sottratta da tutti i conteggi di scintillazione del campione. </li></ol> 6. Analisi dei risultati NOTA: L&#39;autoradiogramma fornisce una visualizzazione qualitativa dei risultati. Per una quantificazione accurata, l&#39;incorporazione di 32 P può essere misurata con un contatore di scintillazione. I dati sono di solito espressi in termini di attività relativa, come mostrato nella Figura 1B . Fintanto che vengono mantenute condizioni uniformi per tutti i campioni, le misure relative di attività specifiche sono sufficienti per confrontare i trattamenti. <ol><li> Nel calcolo di valori assoluti specifici di attività, eseguire un rigoreOttimizzazione di tutte le condizioni di reazione, inclusa la chinasi, il substrato e le concentrazioni di ATP fredde, al fine di garantire una gamma lineare di attività in un corso temporale ( es. 2 x [chinasi] = 2 x attività specifica). Per le chinasi con elevata attività specifica, eseguire test con concentrazione di substrato aumentato in caso di attività cinasi china è limitata dalla quantità di substrato. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica della chinasi di interesse in unità di nanomoli fosfato trasferito per min per mg chinasi. <ol><li> Sottrarre gli spazi dal cpm nelle bande contate. </li><li> Calcola il decadimento di ATP caldo: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 dove t è il numero di giorni dalla data di riferimento (dovrebbe essere fornito dal venditore), t 1/2 L&#39;emivita di 32 P, che è di 14,3 giorni e 0,95 riflette l&#39;efficienza del contatore di scintillazione. Esempio: se si utilizza ATP caldo che è di 28 giorni, il valore di decadimento dovrebbe essere 0.245. </li><li> CalcInserire il pikomole (pmol) del totale ATP nel saggio (di solito è uguale alla quantità di ATP freddo nella reazione): volume di analisi (μL) x [ATP freddo] (μM) = totale ATP (pmols). Esempio: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> Calcolare cpm / pmol ATP: [μL di caldo ATP x (2,2 x 10 7 ) x fattore di decadimento] / pmol di ATP freddo. NOTA: Il valore di 2,2 x 10 7 converte 0,01 mCi / μL di ATP a cpm. </li><li> Calcola la quantità di chinasi nel dosaggio in mg. Per entrambe le chinasi ricombinanti e le chinasi immunoprecipitate, metodi standard come i test BCA sono idonei a determinare le concentrazioni di partenza. Esempio: wtERK2 0,0002 μg / μL in una reazione di chinasi di 50 μL è 0,01 μg, o 1 x 10 -5 mg. </li><li> Calcolare il cpm totale nel saggio. Assemblare 30 μL di reazioni e eseguire 20 μL da ogni reazione su un gel. Moltiplicare il cpm contato (dopo la sottrazione di vuoto) per un fattore di volume / volume di dosaggio totale caricato. Proseguendo quanto sopraEsempio, moltiplicare tutti i conteggi di 1,5 o 30/20. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica della chinasi assayed: Totale cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo di analisi in minuti) / (quantità di chinasi in mg) NOTA: La suddivisione del valore sopra riportato per 1.000 rende l&#39;attività specifica in nanomoli / minuto / mg </li></ol></li><li> Calcolare quanti moli di fosfato sono incorporati in un substrato (fino a quando il suo peso molecolare è noto). Questo viene utilizzato per determinare il numero di fosfosi su una particolare proteina una volta che la reazione è stata completata. Total cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantità di substrato in pmols) </li></ol>

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	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Le cinasi sono una famiglia diversificata di proteine ​​che hanno evoluto un&#39;ampia funzionalità in numerosi contesti e i dosaggi di chinasi sono stati incredibilmente utili nello studio di diverse proteine ​​di segnalazione e hanno contribuito notevolmente alla nostra attuale comprensione della comunicazione cellulare. In particolare, lo stesso test di base è stato utilizzato per caratterizzare due chinasi disparati nonostante le principali differenze nella struttura e nell&#39;attività. La chinasi WNK1 contiene una tasca catalitica atipica in cui la lisin critica si è spostata in una posizione unica ed è nota per svolgere ruoli nella regolazione dei cotransportatori di cloruro di cationi attraverso le funzioni di chinasi e di ponteggio. L&#39;attività di chinasi di WNK1 è nota per avere un basso numero di fatturato, anche sui suoi substrati meglio caratterizzati, le proteine ​​ricinusse ossigenine proteiche della chinasi delle proteine ​​(OSR1) e SPAS / STE20 correlate a proline alanina ricca di chinasi (SPAK). Al contrario, ERK2, insieme alla chinasi ERK1 strettamente correlata, mostra attivita robusta di chinasi quando viene attivata <eM&gt; in vitro ed è noto per fosforilare oltre un centinaio di substrati nelle cellule 13 , 14 . L&#39;aspetto più critico del dosaggio è l&#39;assemblaggio della reazione. Per effettuare accurate misurazioni del tempo, è necessario prestare particolare attenzione all&#39;inizializzazione delle reazioni di chinasi. Esistono quattro requisiti fondamentali per un procedimento di chinasi: chinasi, substrato, ATP e uno ione metallico. Per questo protocollo, che viene utilizzato principalmente per le chinasi eucariotiche, MgCl2 viene utilizzato come fonte di magnesio. Entrambe le proteine ​​chinasi ricombinanti e le preparazioni di chinasi di IP contengono tipicamente il magnesio, rendendo MgCl2 insufficiente come avviatore di reazione. Allo stesso modo, l&#39;aggiunta di ATP non nominato (&quot;freddo&quot;) prima dell&#39;aggiunta di ATP etichettato (&quot;caldo&quot;) può innescare una reazione inadeguata all&#39;inizio. Si raccomanda di preparare reazioni utilizzando un tampone di reazione di chinasi concentrata che facilita l&#39;aggiunta contemporanea di MgCl <suB&gt; 2, ATP caldo e freddo e substrato. Nel caso di misurazione dell&#39;attività di autofosforilazione, l&#39;aggiunta di magnesio e ATP può essere utilizzata per avviare reazioni. In tutti i casi, i campioni devono essere preparati sul ghiaccio e immediatamente trasferiti ad un bagno d&#39;acqua di 30 ° C una volta che le reazioni vengono assemblate. È inoltre importante includere una reazione di controllo di tipo no-chinasi per accertare se il segnale di sfondo interferisca con i risultati. Potrebbe essere necessario risolvere i vari parametri del test, inclusi il tempo, la temperatura e il contenuto di buffer. Il numero di campioni che possono essere trattati in una sola volta è limitato al numero di pozzetti di gel SDS-PAGE, che è abbastanza elevato per efficace screening delle diverse condizioni. Come indicato in precedenza nel protocollo, si consiglia di iniziare esperimenti pilota con un corso di tempo prima di passare alla prova di altre condizioni di reazione. Anche se esiste una certa distinzione tra i dosaggi di IP chinasi e i ricomponenti di proteina chinasi, tIl paradigma sperimentale comune a entrambi dimostra quanto sia versatile questo saggio. In effetti, esistono casi in cui le caratteristiche di entrambi i tipi di dosaggio di chinasi possono essere miscelati, come con gli studi sulla percorso di segnalazione della chinasi della proteina attivata mitogen-attivata / extracellulare (MAPK / ERK). In questo percorso ERK1 / 2 viene attivato dalla doppia fosforilazione da parte del fattore a monte MAPK / ERK chinasi 1 (MEK1). Precedenti studi hanno dimostrato che mentre MEK1, così come un mutante costitutivamente attivo denominato MEK1R4F, è in grado di attivare ERK1 / 2, porto attività molto bassa verso MBP. Di conseguenza, ERK1 / 2 purificato dalle cellule batteriche mostra l&#39;attività limitata di chinasi verso MBP a meno che non venga trattata con MEK1R4F, creando una piattaforma robusta per confrontare l&#39;attività di chinasi del tipo selvatico ERK1 / 2 con i costrutti mutanti, come mostrato in Figura 2 . L&#39;inclusione di componenti immunoprecipitati può aggiungere ancora più sfumature, evidenziando il saggio di chinasi come metodo altamente adattabile per sondare il n multifacetedAtto di queste importanti molecole di segnalazione. Mentre alcuni potrebbero trovare difficoltà a lavorare con materiali radioattivi, la tracabilità quantitativa del saggio di chinasi radiotelefile è uno dei suoi principali vantaggi. Tuttavia, i recenti progressi nei campi della chimica dei prodotti naturali, della genomica e della spettrometria di massa hanno creato una domanda di test di chinasi modificati Con letture più adattabili alle applicazioni ad alta velocità 15 . Poiché questi saggi usufruiscono di diversi materiali di etichettatura, i compromessi sono fatti in termini di precisione, ma questi possono essere superati utilizzando un saggio radiomarcato per convalidare i risultati dello schermo. Dato che la nostra comprensione della segnalazione di proteine ​​chinasi aumenta, rimane chiaro che le tecniche in grado di eliminare le particolarità delle funzioni di regolazione delle chinasi continueranno ad aiutare nello sviluppo di strumenti e terapie.

Le proteine ​​chinasi sono enzimi sofisticati critici per la trasmissione di segnali cellulari in risposte appropriate 1 . Considerati i loro ruoli nel mantenimento dell&#39;omeostasi e nella prevenzione o promozione degli stati di malattia 2 , i metodi biochimici per la valutazione dell&#39;attività di chinasi continuano ad essere strumenti potenti per delineare i particolari della segnalazione eucariotica 3 . Sebbene le strategie che utilizzino anticorpi specifici fosfo-specifici siano stati altamente informativi in ​​termini di misura degli effetti delle diverse condizioni di trattamento sullo stato di segnalazione cellulare 4 , un test di chinasi consente di misurare gli effetti di diverse condizioni di trattamento direttamente in termini di attività enzimatica di una chinasi di interesse. Mentre ci sono diverse opzioni per analisi simili che non utilizzano materiali radioattivi 5 , continuiamo a contare su questo metodo per una robusta quantità di risultati. LàSono due applicazioni tipiche di questo saggio, sia preziose per ragioni diverse: il dosaggio immunoprecipitato (IP) di chinasi ( Figura 1 ) e il test della chinasi della proteina ricombinante ( Figura 2 ). Il dosaggio di IP chinasi è estremamente utile per identificare fattori capaci di attivare specifiche chinasi proteiche, nonché condizioni di trattamento inibitorie di misura. In breve, una chinasi di interesse etichettata con epitopo viene trasfettata in cellule eucariotiche colte, sottoposte a una varietà di trattamenti, immunoprecipitati e analizzati per la capacità di incorporare fosfato radiomarcato in un substrato di modello ( ad es. Proteina di base di mielina (MBP)). Il test di kinasi IP può anche essere eseguito senza ricorrere all&#39;eccessiva espressione, sia mediante immunoprecipitazione della proteina endogena, o qualsiasi altro numero di tecniche di editing genomico. Poiché i trattamenti vengono somministrati in coltura, questo metodo può rilevare stimoli trasmessi attraverso più fattori a monteO percorsi paralleli mediante lettura in vitro . Un importante vantaggio di questo metodo è che non richiede una conoscenza preliminare di fattori diretti a monte oa valle o siti di fosforilazione in esso. Inoltre, una volta individuati substrati specifici per una chinasi di interesse, è possibile utilizzare lo stesso protocollo di analisi chinasi con componenti ricombinanti per misurare l&#39;attività specifica nei confronti dei substrati naturali e identificare siti specifici di fosforilazione in combinazione con l&#39;analisi di spettrometria di massa. I siti identificati in questo modo possono essere ulteriormente convalidati con i test di chinasi utilizzando mutanti del substrato. Infine, questo metodo può essere usato anche per rilevare e misurare l&#39;autofosforilazione. Il protocollo fornito qui presuppone uno schema di purificazione della proteina ottimizzata o metodo di trasfezione per esprimere una chinasi di affinità interessata nelle cellule colte. Per esposizioni più dettagliate di trasfezione, lisi, immunoprecipitazione e proteina purificazione protOcols, suggeriamo di riferirsi ai protocolli Cold Spring Harbour 6 . Per ulteriori informazioni riguardanti lo sviluppo e la modifica del test, consultare Proteine ​​Phosphorylation: Metodi selezionati in Enzimologia 7 .

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Le proteine ​​chinasi sono in grado di governare cambiamenti cellulari su vasta scala in risposta a complessi array di stimoli, e molto sforzo è stato indirizzato a scoprire dettagli allosterici della loro regolazione. Le cinasi comprendono reti di segnalazione i cui difetti sono spesso segni distintivi di molteplici forme di cancro e malattie correlate, rendendo una piattaforma di analisi suscettibile di manipolare i fattori regolatori a monte e di convalida dei requisiti di reazione critici nella ricerca di terapie migliorate. Qui descriviamo un esame di base di chinasi che può essere facilmente adattato a specifiche questioni sperimentali, tra cui ma non limitandosi a verificare gli effetti degli agenti biochimici e farmacologici, manipolazioni genetiche come la mutazione e la delezione, nonché le condizioni di coltura cellulare e trattamenti a sonda Meccanismi di segnalazione cellulare. Questo saggio utilizza l&#39;ATP [γ- 32 P] radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati e può essere modSe utilizzati con chinasi immunoprecipitati o ricombinanti, substrati specifici o tipizzati, in una vasta gamma di condizioni di reazione.

WNK1 IP kinasi Myc-tagged WNK1 è stato trasfettato in cellule HEK293 e immunoprecipitato con un anticorpo anti-Myc 11 . L&#39;immunoprecipitato ha mostrato l&#39;attività di chinasi verso il substrato del modello MBP e verso di sé ( Figura 1A ). I mutanti WNK1 sono stati quindi testati per l&#39;attività di chinasi verso MBP con lo stesso metodo, questa volta impiegando costrutti con GST-tagged ( Figura 1B ). L&#39;analisi del comportamento di mutanti chinasi rispetto a wildtype ha rivelato residui critici per l&#39;attività ottimale WNK1. Le cellule HEK293 sono state esposte a un gruppo di trattamenti farmacologici e biochimici. Utilizzando un anticorpo sollevato contro un peptide N-terminale WNK1, l&#39;attività endogena WNK1 chinasi immunoprecipitata è stata analizzata usando MBP come substrato. Fattore di crescita epidermico (EGF), un attivo notoO di segnalazione ERK1 / 2, il nocodazolo, un farmaco che mira alla dinamica del microtubulo, l&#39;anisomicina, un inibitore della traduzione eucariotica e l&#39;acido lizofosfatidico (LPA), un potente mitogeno, non sono stati in grado di provocare un forte aumento del MBP fosforilato. Al contrario, NaCl è stato dimostrato di essere un regolatore dell&#39;attività di WNK1 chinasi. Esami ERK2 della proteina chinasi ricombinante Il ratto ERK2 portante un tag N-terminale 6His è stato espresso in cellule batteriche e l&#39;affinità è purificata con resina nichel 12 . La proteina è stata ulteriormente purificata mediante cromatografia a scambio ionico su una colonna MonoQ, in cui sono state testate diverse frazioni di eluizione per l&#39;attività di chinasi ( Figura 2A ). Poiché ERK2 richiede la doppia fosforilazione da MEK per raggiungere l&#39;attività chinasi massima, ERK2 purificata dai batteri in assenza di MEK è in gran parte inattiva. Pertanto, per testare le frazioni di recomBinant ERK2 per l&#39;attività verso MBP, una forma costitutivamente attiva di MEK1 chiamata MEK1R4F è stata inclusa nelle reazioni di chinasi. In particolare, MEKR4F non ha un&#39;elevata attività di chinasi su MBP ( Figura 2 ). Utilizzando un dosaggio simile a quello mostrato nella figura 2A , un&#39;attività di chinasi MBP è stata usata per misurare l&#39;attività di mutanti ERK2 ricombinanti purificati da colture batteriche relative a proteine ​​di tipo selvatico ( Figura 2B ). Anche se ERK2 è in grado di fosforilizzare MBP quando stimolato da MEKR4F, la mutazione della lisi catalitica (K52R) o di una treonina prossimale ai siti canonici della doppia fosforilazione (T188D e T188E) drammaticamente abroga l&#39;attività di ERK2 chinasi. ERK2-T188D e ERK2-T188E esprimono l&#39;attività marginale di chinasi verso un piccolo peptide flessibile ( Figura 2C ), tuttavia, non sono in grado di fosforilazione robusta dei substrati noti di ERK2 Nup153 e PDX1 ( Figura 2<html> D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55504/55504fig1.jpg" /> Figura 1: Analisi di chinasi di immunoprecipitazione di WNK1. ( A ) Le cellule HEK293 sono state trasfettate con pCMV5-Myc senza un inserto o pCMV5-Myc-WNK1, le proteine ​​contrassegnate sono state immunoprecipitate con l&#39;anticorpo anti-Myc seguito da saggi di chinasi utilizzando MBP come substrato. A sinistra è mostrata la autoradiografia e un immunoblot degli immunoprecipitati sulla destra. ( B ) Varie proteine ​​mutanti GST-WNK1 sono state usate nei dosaggi di chinasi con MBP come substrato; La fosforilazione di MBP viene espressa come attività relativa alla specie selvatica WNK1. ( C ) L&#39;endogeno WNK1 è stato immunoprecipitato da cellule HEK293 trattate con vari stimoli e testati per autofosforilazione. Questa figura è stata modificata da Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55504/55504fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi della chinasi proteinica ricombinante di ERK2. ( A ) Le frazioni purificate ERK2 da una colonna di scambio di anioni MonoQ sono state usate in un esame di chinasi con MBP in presenza o in assenza di MEK1R4F, uno stimolatore costitutivamente attivo dell&#39;attività ERK2-chinasi. ( B ) I mutanti ERK2 sono stati testati per l&#39;attività di chinasi su MBP. ( C ) Le mutanti del loop di attivazione ERK2-T188D e ERK2-T188E esercitano l&#39;attività marginale di chinasi verso un piccolo substrato peptidico tipizzato. ( D ) Confronto delle attività di chinasi ERK2 o T188D dopo l&#39;attivazione da MEK1R4F con substrati ERK2 conosciuti nucleoporina 153 (Nup153) e homeobox 1 pancreatico e duodenale (PDX1). I substrati fosforilati sono indicati da cunei e fosforileERT2 e T188 con gli asterischi. Ristampato (e modificato) con autorizzazione di McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55504/55504fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell&#39;attività di chinasi mediante l&#39;uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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Nanyang Technological University

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18.3K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione. 

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Ricerca

Biochimica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

<meta charset="utf8"></head><body>Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biologia

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Saggiare l'attività chinasi di LRRK2 In vitro

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi