Os autores gostariam de expressar a sua gratidão aos laboratórios, grupos e indivíduos que desenvolveram Galaxy e David, e, portanto, feitas NGS amplamente acessível para a comunidade científica. A ajuda e conselhos fornecidos por colegas da Universidade de Pittsburgh durante a nossa formação bioinformática é reconhecido. Este trabalho foi apoiado por uma Ellison Medical Foundation New Acadêmico em Aging prêmio (AG-NS-0879-12) e uma concessão do National Institutes of Health (R01AG051659) para AG.

<ol>
	<li>Venter, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+of+the+human+genome.">The sequence of the human genome.</a> Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).</li><li>Lander, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+regulation+of+SKN-1/Nrf+in+response+to+germ+cell+absence.">Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Lapierre, L. R., Gelino, S., Melendez, A., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+lipid+metabolism+coordinately+modulate+life+span+in+germline-less.">Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less.</a> C. elegans. Curr Biol. 21 (18), 1507-1514 (2011).</li><li>Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. 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J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans.">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li><li>McCormick, M., Chen, K., Ramaswamy, P., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+genes+that+extend+Caenorhabditis+elegans'+lifespan+in+response+to+reproductive+signals.">New genes that extend Caenorhabditis elegans' lifespan in response to reproductive signals.</a> Aging Cell. 11 (2), 192-202 (2012).</li><li>Kartashov, A. V., Barski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioWardrobe:+an+integrated+platform+for+analysis+of+epigenomics+and+transcriptomics+data.">BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data.</a> Genome Biol. 16, 158 (2015).</li><li>Goncalves, A., Tikhonov, A., Brazma, A., Kapushesky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+RNA-seq+data+processing+and+quality+assessment.">A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment.</a> Bioinformatics. 27 (6), 867-869 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Importância do sequenciamento Platform Galaxy em Biologia Moderna O Projeto Galaxy tornou-se fundamental para ajudar os biólogos sem formação bioinformática para processar e analisar dados de sequenciamento de alto rendimento de uma forma rápida e eficiente. Uma vez considerado uma tarefa hercúlea, esta plataforma disponível publicamente fez correr algoritmos de bioinformática complexos para analisar os dados NGS um processo simples, confiável e fácil. Além de hospedar uma ampla gam...

A primeira sequenciação do genoma humano, realizada usando o método didesoxinucleï¿½ido-seqüenciamento de Fred Sanger, levou 10 anos e um custo estimado de US $ 3 bilhões 1, 2. No entanto, em pouco mais de uma década desde a sua criação, Next-Generation Sequencing tecnologia (NGS) tornou possível sequenciar todo o genoma humano dentro de duas semanas e para US $ 1.000. Novos instrumentos NGS que permitem velocidades de recolha de sequenciamento de dados cada vez maiores com incrível eficiência, juntamente com reduções acentuadas nos custos, estão revolucionando a biologia moderna de maneiras inimagináveis ​​como projetos de sequenciação do genoma estão rapidamente se tornando comuns. Além disso, estes desenvolvimentos tenham galvanizado progresso em muitas outras áreas, tais como a análise de expressão genética através de RNA-Sequencing (ARN-SEQ), estudo de modificações epigenética do genoma, as interacções ADN-proteína, e rastreio para a diversidade microbiana em hospedeiros humanos. NGS à base de ARN-Seq, em particular, tornou possível identificar e transcriptomes mapa abrangente com precisão e sensibilidade, e substituiu tecnologia de microarrays como o método de escolha para a criação de perfis de expressão. Embora a tecnologia de microarray tem sido amplamente utilizado, que é limitada pela sua dependência em matrizes pré-existentes com informação genómica conhecida, e outros inconvenientes, tais como hibridação cruzada e gama restrita de mudanças de expressão que pode ser medida com fiabilidade. RNA-seq, por outro lado, podem ser utilizados para detectar transcritos conhecidos e desconhecidos, enquanto a produção de baixo nível de ruído de fundo devido à sua natureza não ambígua de mapeamento de ADN. RNA-Seq, em conjunto com as várias ferramentas genéticas oferecidos por organismos modelo tais como leveduras, moscas, vermes, peixes e ratos, tem servido como base para muitas recentes descobertas importantes biomédicas. No entanto, subsistem desafios significativos que fazem NGS inacessíveis à comunidade científica em geral, incluindo as limitações de armazenamento, processamento e acima de tudo, m<html> análise bioinformática eaningful de grandes volumes de dados de sequenciação. Os rápidos avanços em tecnologias de sequenciamento e acumulação exponencial de dados criaram uma grande necessidade de plataformas computacionais que permitirão que os pesquisadores para acessar, analisar e compreender esta informação. Os primeiros sistemas foram fortemente dependente do conhecimento de programação de computadores, enquanto que, os navegadores do genoma como NCBI que permitiram não-programadores para acessar e visualizar dados não permitiu análises sofisticadas. A plataforma, a abertura de acesso baseado na web, Galaxy ( <a href="https://galaxyproject.org/" target="_blank">https://galaxyproject.org/</a> ), preencheu este vazio e provou ser um oleoduto valioso que permite aos pesquisadores para processar dados NGS e realizar um espectro de simples de complexo análises de bioinformática. Galaxy foi inicialmente estabelecida, e é mantido, pelos laboratórios de Anton Nekrutenko (Penn State University) e James Taylor (Johns Hopkins University)f &quot;&gt; 3. Galaxy oferece uma ampla gama de tarefas computacionais tornando-se um &#39;balcão único&#39; para as necessidades de bioinformática inúmeras, incluindo todas as etapas envolvidas em um estudo RNA-Seq. Itallows usuários para executar o processamento de dados, quer em seus servidores ou localmente em suas próprias máquinas. os dados e fluxos de trabalho pode ser reproduzido e compartilhado. os tutoriais online, seção de ajuda, e um wiki-página ( <a href="https://wiki.galaxyproject.org/Support" target="_blank">https://wiki.galaxyproject.org/Support</a> ) dedicada ao Projeto Galaxy fornecer apoio consistente. no entanto, para usuários de primeira viagem, especialmente aqueles com nenhum treinamento bioinformática, o gasoduto pode parecer intimidante e do processo de auto-aprendizagem e familiarização pode ser demorado. Além disso, o sistema biológico estudado, e especificidades da experiência e métodos utilizados, o impacto as decisões de análise em vários passos, e estes podem ser difícil de navegar sem instrução. O RN geral<html> A-Seq Galaxy fluxo de trabalho consiste de carregamento de dados e de verificação de qualidade, seguido por análise usando o smoking Suite 4, 5, 6, 7, 8, 9, que é um colectivo de várias ferramentas necessárias para diferentes fases de análise de dados de RNA-Seq 10, 11, 12, 13, 14. Uma experiência típica de ARN-Seq consiste na parte experimental (preparação da amostra, de isolamento de ARNm e ADNc preparação biblioteca), o NGS e a análise de dados bioinformática. Uma visão geral destas secções, e os passos envolvidos na calha Galaxy, são mostrados na Figura 1. 3fig1.jpg&quot;/&gt; Figura 1: Vista geral de uma ARN-Seq fluxo de trabalho. Ilustração dos passos experimentais e computacionais envolvidos numa experiência de RNA-Seq para comparar os perfis de duas estirpes de vermes (A e B, as linhas de laranja e verdes e setas, respectivamente) de expressão genética. Os diferentes módulos de Galaxy utilizados são apresentadas em caixas com o passo correspondente no nosso protocolo indicado no vermelho. As saídas de várias operações são escritos em cinza com os formatos de arquivo mostrados em azul. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55473/55473fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A primeira ferramenta no Tuxedo Suite é um programa de alinhamento chamado &#39;Tophat&#39;. Ele quebra a entrada NGS lê em fragmentos menores e, em seguida, mapeia-los para um genoma de referência. Este processo de dois passos garante que lê abrangendo regiões intrónicas cujo alinhamento pode ser de outra forma disrupted ou não atendidas são contabilizados e mapeada. Isto aumenta a cobertura e facilita a identificação de novas junções de processamento alternativo. Saída Tophat é relatado como dois arquivos, um arquivo de BED (com informações sobre junções de emenda que incluem localização genômica) e um arquivo BAM (com detalhes de mapeamento de cada leitura). Em seguida, o arquivo BAM está alinhada contra um genoma de referência para estimar a abundância de transcritos individuais dentro de cada amostra, utilizando a ferramenta posterior na Suite Tuxedo chamado &#39;Abotoaduras&#39;. Botão de punho funções por digitalizar o alinhamento para relatar fragmentos transcrito de comprimento completo ou &#39;transfrags&#39; que abrangem todas as possíveis variantes de processamento nos dados de entrada para cada gene. Com base nisso, que gera um &#39;transcriptoma&#39; (montagem de todos os transcritos gerados por cada gene para gene) para cada amostra a ser sequenciada. Estes conjuntos Abotoaduras são então recolhido ou fundidos em conjunto, juntamente com a reference genoma para produzir um arquivo de anotação única para análise diferencial a jusante usando a ferramenta seguinte, &#39;Cuffmerge&#39;. Finalmente, a expressão do gene ferramenta medidas diferencial da &#39;Cuffdiff&#39; entre amostras por comparação das saídas TOPHAT de cada uma das amostras para o ficheiro de saída Cuffmerge final (Figura 1). Abotoaduras usa FPKM / RPKM (Fragmentos / leituras por kilobase de transcrição por milhão mapeados lê) valores para relatar abundâncias transcrição. Estes valores reflectem a normalização dos dados NGS matérias para a profundidade (número médio de leituras a partir de uma amostra que se alinham para o genoma de referência) e o comprimento do gene (genes têm diferentes comprimentos, de modo a contagem tem de ser normalizado para o comprimento de um gene para comparar os níveis entre os genes). FPKM e RPKM são essencialmente o mesmo com RPKM a ser utilizado para um único final de ARN-Seq onde cada leitura corresponde a um único fragmento, enquanto que, é utilizada para FPKM-Fim emparelhado ARN-Seq, uma vez que representa o facto de que duas leituras pode corresponder ao mesmo fragmento. Em última análise, o resultado destas análises é uma lista de genes diferencialmente expressos entre as condições e / ou estirpes testadas. Uma vez uma temporada de sucesso Galaxy está concluído e uma &#39;lista gene&#39; é gerado, o próximo passo lógico requer mais bioinformática analisa deduzir conhecimento significativo dos conjuntos de dados. Muitos pacotes de software surgiram para atender a essa necessidade, incluindo pacotes computacionais baseados na web publicamente disponíveis, como David (o banco de dados para anotação, visualização e descoberta Integrado) 15. DAVID facilita a atribuição de significado biológico para listas de genes grandes a partir de estudos de alta produtividade através da comparação da lista de genes carregado para a sua base de conhecimento biológico integrado e revelando as anotações biológicos associados com a lista de genes. Isto é seguido por Análise de Enriquecimento, ou seja, testes para identify se qualquer processo ou classe de genes biológica é sobre-representados na lista (s) de genes de uma forma estatisticamente significativa. Tornou-se uma escolha popular por causa de uma combinação de uma ampla, base de conhecimento integrada e algoritmos de análise poderosas que permitem aos pesquisadores detectar temas biológicos enriquecido dentro genômica derivado &#39;listas de genes&#39; 10, 16. Outras vantagens incluem sua capacidade de processar listas de genes criadas em qualquer plataforma sequenciamento e uma interface altamente user-friendly. O nemátodo Caenorhabditis elegans é um sistema modelo genético, bem conhecidos pelas suas muitas vantagens, tais como tamanho pequeno, o corpo transparente, o plano de corpo simples, facilidade de cultura e excelente receptividade ao dissecção genética e molecular. Vermes têm uma pequena, simples e bem-anotada genoma que inclui até 40% de genes conservados com homólogos humanos conhecidos 17. De fato, C. elegansfoi o primeiro metazoários cujo genoma foi completamente sequenciado 18, e uma das primeiras espécies onde ARN-Seq foi usada para mapear transcriptoma de um organismo 19, 20. Estudos de vermes cedo envolvido experimentação com diferentes métodos de captura-ARN de alto rendimento, a preparação da biblioteca e a sequenciação assim como condutas de bioinformática que contribuíram para o avanço da tecnologia de 21, 22. Nos últimos anos, a experimentação baseada em RNA-Seq em vermes tem se tornado comum. Mas, para os biólogos vermes tradicionais os desafios colocados pela análise computacional de dados de RNA-Seq continuam a ser um grande obstáculo para uma maior e melhor utilização da técnica. Neste artigo, descreve-se um protocolo para a utilização da plataforma Galaxy para analisar os dados de RNA-Seq high-throughput gerados a partir de C. elegans. Para muitos pela primeira vez e pequeno-scale utilizadores, a forma mais eficaz e económica e simples de realizar uma experiência de RNA-Seq é isolar RNA no laboratório e utilizar uma (ou em casa) facilidade NGS comercial para a preparação de bibliotecas de cDNA e sequenciação do próprio NGS. Assim, temos primeiro detalhada das etapas envolvidas no isolamento, quantificação e qualidade de avaliação de C. elegans amostras de ARN por ARN-Seq. Em seguida, nós fornecemos passo-a-passo para o uso da interface Galaxy para análises dos dados NGS, começando com testes de pós-sequenciação de verificações de controlo de qualidade, seguido por alinhamento, montagem, e a quantificação diferencial da expressão do gene. Além disso, nós incluímos as direções para controlar a lista de genes resultantes da Galaxy para estudos de enriquecimento biológicos utilizando DAVID. Como etapa final no fluxo de trabalho, nós fornecemos instruções para fazer upload de dados de RNA-Seq para servidores públicos, como a Sequência Leia Archive (SRA) no NCBI ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra" target="_blank">http: // w</a>ww.ncbi.nlm.nih.gov/sra) para torná-lo livremente acessível à comunidade científica. No geral, prevemos que este artigo irá fornecer informações completas e suficientes para biólogos vermes que realizam experimentos de RNA-Seq, pela primeira vez, bem como usuários freqüentes executando um pequeno número de amostras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase spray&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-402-178</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics Vibra Cell&#160;</td>
			<td>VCX130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP561-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac/PC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptomic analysis of c. elegans rna sequencing data through the tuxedo suite on the galaxy project

Próxima geração seqüenciamento (NGS) tecnologias têm revolucionado a natureza da investigação biológica. Destes, Sequenciação de ARN (ARN-SEQ) emergiu como uma ferramenta poderosa para a análise de expressão genética e mapeamento transcriptoma. No entanto, a manipulação de dados de RNA-Seq requer experiência computacional sofisticada e coloca desafios inerentes para pesquisadores de biologia. Este gargalo tem sido mitigada pelo projeto acesso aberto Galaxy que permite que usuários sem habilidades de bioinformática para analisar os dados de RNA-Seq, eo banco de dados para anotação, visualização e Integrated Discovery (David), um Gene Ontology (GO) Suíte análise termo que ajuda derivar significado biológico a partir de grandes conjuntos de dados. No entanto, para usuários iniciantes e amadores bioinformática, auto-aprendizagem e familiarização com essas plataformas podem ser demorado e difícil. Nós descrevemos um fluxo de trabalho simples que irá ajudá C. elegans pesquisadores para isolar RNA verme, realizar um experimento RNA-Seqe analisar os dados usando plataformas Galaxy e David. Este protocolo fornece instruções passo a passo para a utilização dos vários módulos Galaxy para aceder aos dados em bruto NGS, verificações de controlo de qualidade, o alinhamento, e análise de expressão diferencial de genes, orientando o utilizador com os parâmetros em cada passo para gerar uma lista de genes que podem ser rastreados para o enriquecimento de as classes de genes ou processos biológicos utilizando Davi. No geral, prevemos que este artigo irá fornecer informações para C. elegans pesquisadores realizam experimentos de RNA-Seq, pela primeira vez, bem como usuários freqüentes executando um pequeno número de amostras.

Em C. elegans, a eliminação das células estaminais da linha germinal (GSCS) prolonga a vida, aumenta a capacidade de resistência de stress, e eleva a gordura corporal 24, 28. Perda de GSCS, quer provocada por laser de ablação ou por mutações, tais como GLP-1, faz com que a vida útil de extensão através da activação de uma rede de 29 factores de transcrição. Um destes factor...

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Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy e David surgiram como ferramentas populares que permitem que os investigadores sem formação bioinformática para analisar e interpretar dados de RNA-Seq. Descreve-se um protocolo para C. elegans investigadores para executar ARN-Seq experiências, o acesso e processar o conjunto de dados usando Galaxy e obter informação biológica significativa a partir das listas de genes utilizando DAVID.

Análise transcriptomic de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenciação de dados através da Suíte Tuxedo no Projeto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

transcriptomic-analysis-c-elegans-rna-sequencing-data-through-tuxedo

Research

JoVE Journal

Genetics

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

17.2K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine, Children's Hospital of Pittsburgh.  Galaxy e David surgiram como ferramentas populares que permitem que os investigadores sem formação bioinformática para analisar e interpretar dados de RNA-Seq. Descreve-se um protocolo para C. elegans investigadores para executar ARN-Seq experiências, o acesso e processar o conjunto de dados usando Galaxy e obter informação biológica significativa a partir das listas de genes utilizando DAVID. 

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulação de ploidia em Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...