This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.

Os estudos em animais foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster, em conformidade com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) orientações. 1. A radiomarcação de ligandos TZ-tridentados com 99m Tc CUIDADO: Os seguintes procedimentos requerem o uso de compostos radioactivos. O trabalho só deve ser feito em um laboratório licenciado com a adesão a normas de segurança e eliminação. reacções de micro-ondas deve ser realizada num forno de microondas especificamente concebido para a síntese química. <ol><li> Síntese de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> Em um frasco de microondas, combinar 8 mg de K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg de Na 2 CO 3, 20 mg de Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge o frasco durante 10 min com gás argônio. </li><li> Adicionar 4 ml de 99m TcO ~ 4 - (1.100 MBq, ~ 30 mCi) em 0,9% de solução salina para o frasco. </li><li> Aquece-se a reacção num micro-ondas durante 3,5 minutos a 110 ° C, após 10 s de agitação para garantir uma mistura completa dos reagentes. </li><li> Ajuste o pH da solução para 3,5-4 com ~ 400 mL de HCl 1M. Verifique utilizando papel de pH. </li></ol></li><li> Radiomarcação de tetrazina ligantes 1-5 <ol><li> Dissolve-se 2 mg de cada ligando (compostos 1-5) em 250 mL de MeOH 21. </li><li> Adicionar 250 uL de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solução. </li><li> Aquece-se a mistura de reacção utilizando um forno de microondas durante 20 min a 60 ° C. NOTA: Este passo foi idêntico para todos os 5 tetrazinas. </li><li> Para os compostos 2 a 5, evapora-se o solvente e re-dissolve os produtos resultantes em 1 mL de 1: v / v 1 DCM: TFA. </li><li> Aquecer os produtos de reacção dissolvidos (2-5) a 60 ° C em um micro-ondas durante 6 min (2-4) ou 10 min (5). </li><li> Após arrefecimento até à temperatura ambiente, evapora-se o solvente usando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) e dissolve-se o composto seco em 1: 1 de ACN: H 2 O ou 1: 1 de MeOH: H2O, antes da purificação por HPLC. </li><li> Purifica-se os compostos marcado com 99m Tc (1-5), incluindo a separação do produto marcado do ligando não marcado tetrazina, utilizando HPLC (C 18 de fase inversa). Tipicamente, usar um gradiente de eluição de 30:70 ACN: H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H2O ao longo de 20 min (18 min) e uma coluna analítica C 18 4,6 x 100 mm. Use tanto UV (254 nm) e detecção gama. <ol><li> Aqui uma pequena amostra de cada produto marcado e comparar o seu tempo de retenção HPLC para o de um co-injected, não radioactiva, marcada com Re padrão (0,125 mg em 20% de metanol-H2O). O padrão marcado com Re é identificada no rastreio de UV HPLC, e eluir, ao mesmo tempo que o composto 99m Tc-rotulada no rastreio γ-HPLC. Esta co-injecção mostra picos em tempos de retenção semelhantes, o que confirma a identidade do composto de 99m Tc-rotulados. </li></ol></li><li> Evapora-se o solvente a partir das fracções de HPLC utilizando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm). </li><li> Formular o composto purificado, a uma concentração de 7,4 kBq / mL em PBS, contendo BSA a 0,5% e 0,01% de Tween-80. </li><li> Para garantir os compostos marcados são estáveis, realizar um estudo de estabilidade in vitro. Incubar o composto formulado a 37 ° C durante 1, 4 e 6 h, injectando uma pequena quantidade (3,7 MBq) da mistura em HPLC em cada ponto de tempo para avaliar a estabilidade. </li></ol></li></ol> 2. Estudos Bio-distribuição Pré-alvo <ol><li&gt; Preparação de animais <ol><li> Utilizando ratos fêmeas de 7-9 semanas de idade, ratinhos Balb / c (n = 3), administrar TCO-BP formulado em solução salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), por via de injecção na veia da cauda-. </li><li> Coloque o mouse no dispositivo de contenção física, e identificar as veias localizadas nas superfícies laterais da cauda e limpe com um algodão embebido em álcool. Em cerca de 2 cm da extremidade da cauda, ​​inserir uma agulha de calibre 30 a um ângulo raso, paralelo à veia. Lentamente pressionar o êmbolo para injetar, remova a agulha e aplicar gaze limpa no local da injecção com uma ligeira pressão até o sangramento parar. </li><li> A 1 h após a injecção de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 uCi) de 99m Tc-tetrazina formulados em 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 em PBS, através de injecção na veia da cauda. </li></ol></li><li> Estudos biológicos e de distribuição <ol><li> No ponto de tempo desejado (t = 6 H), anestesiar os ratos utilizando 3% de isoflurano e mistura gasosa de oxigénio de 2%. Demonstrar uma parae pitada retirada no rato anestesiado para garantir que eles estão em plano cirúrgico de anestesia. </li><li> Recolha de sangue (1 mL) através de punção cardíaca utilizando uma seringa pré-tratada com heparina. Colocar o mouse sobre as suas costas com o nariz no cone do nariz para anestesia continuou e localizar o apêndice xifóide no animal. <ol><li> Inserir uma agulha G 25, ligeiramente à esquerda da linha média do animal no âmbito do processo xifóide, em um ângulo de 20 °. Totalmente inserir a agulha, e, lentamente, puxar o êmbolo para ver sangue no centro da agulha se o coração foi perfurado. Ligeiramente reajustar a agulha, mantendo o êmbolo, se necessário, para perfurar o coração. Lentamente extrair o sangue para dentro da seringa. </li></ol></li><li> Eutanásia do animal por deslocamento cervical, sob anestesia. </li><li> Coloque cada animal em um saco plástico e usar um calibrador de dose (configuração Tc 99m) para medir todo o nível de atividade do corpo. </li><li> Coletar os seguintes tecidos e fluidos em pré-pesamed contando tubos: sangue, osso (joelho e ombro), vesícula biliar, rins, fígado, estômago (com conteúdo), intestino delgado (com conteúdo), intestino grosso e ceco (com conteúdo), tireóide e traqueia, bexiga com urina , e cauda. </li><li> Lavar tecidos apropriados (excluindo sangue, vesícula biliar e bexiga urinária) em PBS para remover o sangue e secar antes de colocar os tecidos em tubos de contagem adequadas. </li><li> Coloque carcaça de animal em um saco plástico e medir a atividade do corpo inteiro residual usando um calibrador de dose. </li><li> Pesar cada tubo que contém uma amostra de tecido. Subtrair o peso inicial do tubo para obter uma massa de tecido. </li><li> Usar um calibrador de dose (99m Tc definição) para medir a quantidade de actividade de uma amostra de teste (100 uL) no momento da injecção para cada rato. NOTA: Esta amostra teste é igual ao volume de injecção, dando, assim, a contagem de actividade no momento da injecção. </li><li> Na altura da medição do tecido, umaliquot 5 uL da amostra de teste utilizado anteriormente. Utilizar um contador de raios gama múltiplos detectores (configuração Tc 99m) e contam para obter a contagem por minuto (CPM) para a amostra de teste de 5 mL. </li><li> Use os dois valores obtidos em 2.2.9 e 2.2.10 para calcular a atividade e relacionamento CPM usando a equação 1 para obter um factor de conversão (CPM uCi -1). (1) <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utilizar o contador gama para medir a quantidade de radioactividade em cada tecido ou amostra de fluido. </li><li> Use equação 1 para calcular a quantidade de actividade em cada tecido ou fluido no momento da medição em relação à dose total injectada. Este valor é em seguida normalizado pelo peso do órgão e relatados como percentagem da dose injectada por grama (ou seja,% ID / g) de tecido. </li><li> Siga os passos 2.1.2 a 2.2.13 para conduzir um experimento de controle negativo usando os marcado com 99m Tc ligantes tetrazina na Absence de TCO-BP. Sacrifício ratinhos (n = 3) em 0,5, 1, 4 e 6 h pós-injecção e obter o tecido ou fluido, tal como descrito acima. </li></ol></li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Uma colecção de quelatos tridentados ligada-tetrazina de polaridades diferentes foi preparado, e a utilidade dos seus complexos 99mTc na reacção com um derivado IEDDA TCO in vivo foi avaliada. Um método eficaz e reprodutível rotulagem 99m Tc foi desenvolvido para cinco tetrazina-quelatos, onde a concentração de ligando foi 10 -3 M. A etapa de marcação foi seguida por desprotecção de t- butilo (para os compostos 2-5). A elevada concentração de ligando foi usada para melhorar o rendimento radioquímico e reduzir os tempos de reacção que minimizou a degradação da tetrazina 21. O produto foi isolado e separado do ligando não marcado e quaisquer impurezas radioquímica por HPLC, o que resulta em rendimentos variando radioquímica 31-83%, com todos tendo pureza radioquímica&gt; 99% e uma actividade específica elevada de ~ 1,48 MBq / ug. Todos os compostos mostraram-se estáveis ​​em PBS contendo 0.5% de BSA e 0,01% de Tween80 durante até 6 h (figura 3). compostos bisfosfonatos, como TCO-BP, se localizam nas regiões do metabolismo ósseo ativo ou lesão, que incluem articulações do joelho e ombro em camundongos. Portanto TCO-BP fornece um meio simples de avaliar a eficácia de novas tetrazinas radiomarcados para entregar isótopos in vivo. Avaliação da bio-distribuição de todos os cinco 99mTc- tetrazinas mostrou absorção em articulações do joelho e ombro 6 h pós-injecção, o que demonstra bem sucedida de pré-direccionamento para o osso in vivo (Figura 4). Estudos anteriores confirmou que radiomarcado TCO-BP acumula no osso 18, enquanto que a construção de 99m Tc-tetrazina (2) dada por si só não o faz (Figura 5). Isto permite concluir que a absorção óssea era devido à reacção IEDDA. As construções mais lipofílicos 1 e 2 </forte&gt; tiveram dados de distribuição semelhante, incluindo alta absorção no joelho (9,1 ± 1,9 (1); 7,6 ± 2,7 (2)) e o ombro (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Concentrações elevadas de radioactividade foram também observados na vesícula biliar, do fígado e dos intestinos, o que é consistente com a distribuição de 99m Tc-tetrazina lipofílico composto 2 na ausência de TCO-PA (Figura 5). Outros tecidos não-alvo e órgãos, tais como o músculo esquelético e o baço não mostraram qualquer absorção significativa (&lt;1%) quando os estudos de biodistribuição foram realizados sobre os 99mTc- tetrazinas na ausência do TCO-PA (Figura 5) , assim que estes órgãos não foram levados para os experimentos de pré-segmentação. Além disso, experimentos bio-distribuição com os 99mTc- tetrazinas sozinho revelou boa folga a partir de tecidos não-alvo às 6 h após a injeção. Consequentemente, this ponto de tempo, o que está dentro de uma meia-vida do isótopo, foi seleccionado como o ponto no tempo para comparar os diferentes ligandos radiomarcados tetrazina. A 99m polar composto mais Tc-tetrazina 3 tendo um ligante PEG 5 mostrou muito alto joelho e captação de ombro (16,2 ± 4,8 e 20,7 ± 4,9, respectivamente). Houve também menor actividade observada no fígado e intestinos. O correspondente derivado de PEG 10 também mostrou ligação ao osso e absorção reduzida no fígado em comparação com os compostos 1 e 2. O derivado mais polar 5, mostraram uma redução da ligação de todos os outros constructos que é susceptível de osso, devido à sua rápida eliminação. A absorção óssea e osso alta: proporções de sangue (Tabela 1), em especial para os compostos 3 e 4 demonstram que o pré-direccionamento e a reacção IEDDA pode ser usado para loccompostos Alize marcado com 99m Tc in vivo. Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para avaliar qualquer tetrazina radiomarcado incluindo próxima geração de Tc (I) -tetrazine ligandos. Deve notar-se que, para a classe de ligandos, que foram utilizados neste estudo, as estruturas podem ser facilmente variada mudando a natureza dos grupos dadores e linkers entre o complexo de metal e o tetrazina, sem alterar significativamente o método de síntese do ligando 21. Uma vez que uma molécula de ligação é identificada, um método kit de imediato, o que provavelmente irá incluir métodos de purificação de fase sólida, pode ser desenvolvida para suportar a tradução clínica. (I) o complexos Tc aqui relatados criar a oportunidade de preparar novos radiofármacos 99m Tc usando uma grande variedade de diferentes moléculas alvo derivado do TCO incluindo anticorpos. Anticorpos, apesar de suas excelentes propriedades de segmentação anteriores à criação de tecnécio marcado tetrazinas, não seria typicaliado ser usado com 99m Tc por causa da sua depuração lenta (dias), o que é muito mais longo do que a meia-vida do isótopo (~ 6 h). Uma aplicação adicional da química aqui relatado é que a mesma classe de ligandos podem ser preparadas com o beta radionuclídeos emissores 186 Re e 188 Re. Os análogos de iso-estruturais Re (I) dos agentes de Tc (I), quando combinados com o tumor em busca de propriedades TCO-BP pode ser utilizado para tratar metástases ósseas.

99m Tc continua a ser o radioisótopo dominante usada na medicina nuclear de diagnóstico, com mais de 50 milhões de procedimentos de imagem realizados por ano em todo o mundo 1, 2, 3. A maioria dos 99m agentes Tc utilizadas clinicamente são do tipo de perfusão radiofármacos. Há um número limitado de compostos-alvo de forma activa em que o 99mTc é dirigido para se ligar a um biomarcador específico através da ligação a uma construção de direccionamento. A criação de 99m alvo radiofármacos Tc é frequentemente prejudicado pela influência de 99m de complexos de Tc-ligando sobre a capacidade da molécula de direccionamento para ligar o biomarcador de interesse, ou os isótopos de meia-vida não é suficiente para utilização com biomoléculas peso molecular mais elevado tais como anticorpos. O último requer tipicamente vários dias antes de as imagens são adquiridas para que a biomolécula para limpar a partir de não-alvo tiss<html> ues. Pré-segmentação oferece uma abordagem alternativa para superar esses desafios. Pré-segmentação combinada com a química bioorthogonal tem demonstrado ser uma forma eficaz de desenvolver novas sondas imagem molecular para ambos fluorescência e radio-imagiologia 4, 5, 6, 7, 8. A reacção inversa de electrões demanda de Diels-Alder (IEDDA) entre derivados -cicloocteno trans (TCO) 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e, como se mostra na Figura 1, tem sido demonstrado ser particularmente eficaz 6. A reação IEDDA com estes componentes podem apresentar cinética rápida na PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta seletividade, sendo ideal para aplicações in vivo pré-segmentação 9, 10. e_content &quot;&gt; A abordagem mais comum utilizado envolve a administração de um vector de TCO-derivado de segmentação e depois de um período de atraso suficiente, uma tetrazina radiomarcado é administrado. tetrazinas marcados radioactivamente com base em 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 no foram relataram 11, 12, 13, 14, 15. em contraste, há apenas um relatório de um marcado com 99m Tc Tz, o qual foi preparado usando um tipo de ligando HYNIC requerendo o uso de co-ligandos para prevenir a ligação e degradação de proteínas in vivo 16. Como alternativa, relatamos aqui a síntese de 99m Tc (I) marcado tetrazinas usando uma família de ligandos que formam complexos estáveis com um tridentados [99mTc (CO) 3] + núcleo. Figura 1: A reacção IEDDA bioorthogonal entre tetrazina e -cicloocteno trans. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A família de ligandos preparados contêm quelatos tridentados que variam em polaridade e da natureza do grupo de ligação entre a região de ligação do metal e a Tz (Figura 2). O objetivo foi identificar a 99m Tc-tetrazina construir que poderiam efetivamente localizar e reagir com os locais TCO marcados in vivo e rapidamente claro, não ligadas, a fim de produzir alta meta-se não-alvo rácios. Para testar os ligandos, um TCO-derivado de um bisfosfonato (TCO-PA) foi utilizado 17. Nós mostramos anteriormente que TCO-BP localiza a áreas do metabolismo ósseo activo e pode reagir comtetrazinas radiomarcados in vivo 18. É um reagente conveniente para testar novas tetrazinas, porque ele pode ser preparado num único passo e experiências podem ser realizadas em ratinhos normais onde a localização ocorre principalmente nas articulações (joelhos e ombros).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Argon gas&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Alphagaz</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2CO3</td>
			<td style="width:255px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:199px;">106395</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2B4O7.10H2O</td>
			<td style="width:255px;">Anachemia</td>
			<td style="width:199px;">S9640</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KNaC4H4O6.4H2O</td>
			<td style="width:255px;">Anachemia</td>
			<td style="width:199px;">217255</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Technelite 99mTc generator</td>
			<td style="width:255px;">Lantheus medical imaging</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>Source of 99mTcO4-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">0.9% Saline</td>
			<td style="width:255px;">Lantheus medical imaging</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>To elute generator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M HCl</td>
			<td style="width:255px;">Lab Chem</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MeOH</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACN</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Millipore H2O</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Barnstead Nanopure</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DCM</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TFA</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:199px;">10010023</td>
			<td>pH 7.4 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">BSA</td>
			<td style="width:255px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">A7906</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tween80</td>
			<td style="width:255px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">P8047</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:255px;">CDMV</td>
			<td style="width:199px;">108737</td>
			<td>Supplier: Fresenius Kabi Animal Health&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:367px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4</td>
			<td style="width:255px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:199px;">00G-4435-E0</td>
			<td>Gemini&#174; 5 &#181;m C18 110 &#197;, LC Column 250 x 4.6 mm,</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5</td>
			<td style="width:255px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:199px;">186003115</td>
			<td>XBridge BEH C18 Column, 130 &#197;, 5 &#181;m, 4.6 mm X 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microwave Reactor&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Initiator 8</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Biotage V10 Evaporator</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Serial # V1041</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dose calibrator</td>
			<td style="width:255px;">Capintec, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:199px;">CRC-25R</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">Gamma counter</td>
			<td style="width:255px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:199px;">Wizard 1470 Automatic Gamma Counter</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Animal room scale&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:199px;">XP105 Delta Range</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microwave vials&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">355629</td>
			<td>0.5-2 mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and evaluation of 99mtc-labeled tridentate chelates for pre-targeting using bioorthogonal chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Os ligandos foram sintetizados utilizando diferentes ligantes e agentes quelantes através de um simples estratégia de aminação redutiva (Figura 2), seguido por acoplamento do produto a um tetrazina comercialmente disponíveis 22, 23. A marcação radioactiva foi realizada utilizando o mesmo método para todos os compostos e era altamente reprodutível. O processo foi optimizado variando o pH, a quantidade de ligando, tempo de reacção e temperatura depois do que o Tc-99m compostos radiomarcados 1-5 foram obtidos de moderado a alto rendimento radioquímico: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4), e 54% (5). Após purificação por HPLC de ligando que não reagiu e evaporação usando um evaporador, os compostos foram formulados em PBS contendo 0,5% de BSA e 0,01% de Tween 80 antes da injecção. A actividade específica do p<html> tetrazina urified 99m Tc-marcado foi de ~ 1,48 MBq / ug. Os estudos foram realizados para avaliar a estabilidade dos marcado com 99m Tc ligandos tetrazina antes dos estudos in vivo. A estabilidade foi monitorizada por HPLC a 1, 4 e 6 h, sem causar degradação visível ao longo de 6 h (Rt = 14 min), como pode ser visto na Figura 3 para o composto 4 como um exemplo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig2.jpg" /> Figura 2: Os compostos 1-5 foram produzidos utilizando ligantes diferentes (Y) e agentes quelantes (x), como mostrado (em baixo). Todos os compostos foram radiomarcados com [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + utilizando as mesmas condições de reacção (topo), com a excepção de uma, que não requerem o passo (ii). <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55188 / 55188fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3: Resultados do ensaio de estabilidade utilizando o Composto 4. vestígios γ-HPLC de 4 incubados em PBS a 37 ° C durante 1, 4 e 6 h. Para o teste in vivo, utilizaram-se ratinhos Balb / C saudáveis. Resumidamente, para cada composto, os grupos de ratinhos (n = 3) foram injectados com o TCO-BP (100 uL, 20 mg / kg), a que se seguiu a administração dos compostos Tc-99m marcados 1 h mais tarde. Às 6 h pós-injecção dos complexos 99mTc, os animais foram sacrificados e as concentrações de actividade em vários tecidos e fluidos determinada. Os dados resultantes são apresentados como percentagem de dose injectada por grama de tecido (% ID / g) e é mostrada na Figura 4. Índices representativos de osso (joelho ou ombro) ao sangue para cada um dos compostos Tz cinco 99m Tc-rotulados são apresentados na Tabela 1. Estes dados indicam CLmais cedo que o composto 3 fornecida segmentação óptima combinada com a depuração do sangue, e que havia uma variação substancial entre os compostos marcados Tc-99m em conta a localização fora do alvo de tecido. Um estudo de controlo negativo utilizando ratinhos CD1 (n = 3) foi realizada, em que os ratinhos foram injectados com ligandos de 99m Tc-tetrazina na ausência de TCO-BP. Os ratos foram sacrificados às 0,5, 1, 4 e 6 h e% ID / g foi determinada para todos os tecidos e fluidos. Para todos os compostos testados, em que os dados para o Composto 2 é apresentada na Figura 5, não absorção significativa foi observada no osso ou outros tecidos (coração, pulmões, baço, músculo esquelético) não mostrados na Figura 4. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig4.jpg" /> Figura 4. Resultados Bio-de distribuição de 99m Tc-rotulados derivados tetrazina 1-5 (barras indicated). Os dados apresentados foram obtidos a partir de tecidos seleccionados e fluidos feita 6 h pós-injecção dos derivados radiomarcados, e a actividade foi normalizada para o peso do tecido ou fluido, como média percentagem de dose injectada por grama de tecido ou de fluido (% ID / g) ± SEM. alvos osso são indicados por •. NOTA: Todos os restantes tecidos não mostrados tinha média de% ID / g, que era inferior a 1%. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig5.jpg" /> Figura 5. Os resultados de Bio-de distribuição para o estudo de controle usando tetrazina marcado com 99m Tc (2) sem injecção antes da TCO-BP. Os dados apresentados foram obtidos a partir de tecidos seleccionados e fluidos retirados de 3 murganhos às 0,5, 1, 4, e 6 horas após a injecção de 2. A actividade foi normalizada para o tecido oupeso do fluido, como dose média por cento injectada por grama de tecido ou fluido (% ID / g) ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> Composto </td></tr><tr><td> relação </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Ombro: Blood </td><td> 3,5: 1 </td><td> 3,5: 1 </td><td> 21: 1 </td><td> 7,8: 1 </td><td> 0,8: 1 </td></tr><tr><td> Joelho: Blood </td><td> 6,9: 1 </td><td> 5,6: 1 </td><td> 26: 1 </td><td> 12: 1 </td><td> 1,3: 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. tecido do osso: rácios de sangue determinados a partir de estudos de bio-distribuição.

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Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

8.1K visualizações.  McMaster University. Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry. 

Vídeo: Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Química

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation of Biopolymer Aerogels Using Green Solvents

Although the first reports on aerogels made by Kistler1 in the 1930s dealt with aerogels from both inorganic oxides (silica and others) and biopolymers (gelatin, agar, cellulose), only recently have biomasses been recognized as an abundant source of chemically diverse macromolecules for functional aerogel materials. Biopolymer aerogels (pectin, alginate, chitosan, cellulose, etc.) exhibit both specific inheritable functions of starting biopolymers and distinctive features of aerogels (80-99% porosity and specific surface up to 800 m2/g). This synergy of properties makes biopolymer aerogels promising candidates for a wide gamut of applications such as thermal insulation, tissue engineering and regenerative medicine, drug delivery systems, functional foods, catalysts, adsorbents and sensors. This work demonstrates the use of pressurized carbon dioxide (5 MPa) for the ionic cross linking of amidated pectin into hydrogels. Initially a biopolymer/salt dispersion is prepared in water. Under pressurized CO2 conditions, the pH of the biopolymer solution is lowered to 3 which releases the crosslinking cations from the salt to bind with the biopolymer yielding hydrogels. Solvent exchange to ethanol and further supercritical CO2 drying (10 - 12 MPa) yield aerogels. Obtained aerogels are ultra-porous with low density (as low as 0.02 g/cm3), high specific surface area (350 - 500 m2/g) and pore volume (3 - 7 cm3/g for pore sizes less than 150 nm).

A new way for the production of biopolymer-based aerogels by carbon dioxide (CO2) induced gelation is shown. The technique utilizes pressurized carbon dioxide (5 MPa) for the production of biopolymer hydrogels and supercritical CO2 (12 MPa) to convert gels into aerogels. The only solvents needed besides CO2 are water and ethanol.

Preparação de Biopolymer Aerogels utilizando solventes verdes

Although the first reports on aerogels made by Kistler1 in the 1930s dealt with aerogels from both inorganic oxides (silica and others) and biopolymers ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

A preparação e propriedades de termo-reversível reticulada Química Rubber Via Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Simple Methods for the Preparation of Non-noble Metal Bulk-electrodes for Electrocatalytic Applications

The rock material pentlandite with the composition Fe4.5Ni4.5S8 was synthesized via high temperature synthesis from the elements. The structure and composition of the material was characterized via powder X-ray diffraction (PXRD), M&#246;ssbauer spectroscopy (MB), scanning electron microscopy (SEM), differential scanning calorimetry (DSC) and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX). Two preparation methods of pentlandite bulk electrodes are presented. In the first approach a piece of synthetic pentlandite rock is directly contacted via a wire ferrule. The second approach utilizes pentlandite pellets, pressed from finely ground powder, which is immobilized in a Teflon casing. Both electrodes, whilst being prepared by an additive-free method, reveal high durability during electrocatalytic conversions in comparison to common drop-coating methods. We herein showcase the striking performance of such electrodes to accomplish the hydrogen evolution reaction (HER) and present a standardized method to evaluate the electrocatalytic performance by electrochemical and gas chromatographic methods. Furthermore, we report stability tests via potentiostatic methods at an overpotential of 0.6 V to explore the material limitations of the electrodes during electrolysis under industrial relevant conditions.

A facile preparation method of electrodes using the bulk material Fe4.5Ni4.5S8 is presented. This method provides an alternative technique to conventional electrode fabrication and describes prerequisites for unconventional electrode materials including a straightforward electrocatalytic testing method.

Métodos simples para a preparação de eletrodos a granel de metal não nobre para aplicações eletrocatalíticas

The rock material pentlandite with the composition Fe4.5Ni4.5S8 was synthesized via high temperature synthesis from the elements. The structure and ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We present methods for depositing and passively manipulating C60 molecules on rippled graphene that advance the pursuit of realizing applications involving 1D C60/graphene hybrid structures. The techniques applied in this exposition are geared towards high vacuum systems with preparation areas capable of supporting molecular deposition as well as thermal annealing of the samples. We focus on C60 deposition at low pressure using a homemade Knudsen cell connected to a scanning tunneling microscopy (STM) system. The number of molecules deposited is regulated by controlling the temperature of the Knudsen cell and the deposition time. One-dimensional (1D) C60 chain structures with widths of two to three molecules can be prepared via tuning of the experimental conditions. The surface mobility of the C60 molecules increases with annealing temperature allowing them to move within the periodic potential of the rippled graphene. Using this mechanism, it is possible to control the transition of 1D C60 chain structures to a hexagonal close packed quasi-1D stripe structure.

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Here we present a protocol for the fabrication of C60/graphene hybrid nanostructures by physical thermal evaporation. Particularly, the proper manipulation of deposition and annealing conditions allow the control over the creation of 1D and quasi 1D C60 structures on rippled graphene.

Preparação e caracterização de nanoestruturas de híbrido C60/Graphene

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparação de Íons Aziridínio Bicíclicos Estáveis e sua Abertura de Anel para a Síntese de Azaheterociclos

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally purify the same by acid elution. By combining sodium silicate with a polyfunctional bioinspired additive, silica is rapidly formed at ambient conditions upon neutralization. 
The effect of neutralization rate and biomolecule addition point on silica yield are investigated, and biomolecule immobilization efficiency is reported for varying addition point. In contrast to other porous silica synthesis methods, it is shown that the mild conditions required for bioinspired silica synthesis are fully compatible with the encapsulation of delicate biomolecules. Additionally, mild conditions are used across all synthesis and modification steps, making bioinspired silica a promising target for the scale-up and commercialization as both a bare material and active support medium.
The synthesis is shown to be highly sensitive to conditions, i.e., the neutralization rate and final synthesis pH, however tight control over these parameters is demonstrated through the use of auto titration methods, leading to high reproducibility in reaction progression pathway and yield. 
Therefore, bioinspired silica is an excellent active material support choice, showing versatility towards many current applications, not limited to those demonstrated here, and potency in future applications.

Here, we present a protocol to synthesize bioinspired silica materials and immobilize enzymes therein. Silica is synthesized by combining sodium silicate and an amine &#39;additive&#39;, which neutralize at a controlled rate. Material properties and function can be altered either by in situ enzyme immobilization or post-synthetic acid elution of encapsulated additives.

Preparação de sílica funcional usando um método Bioinspirada

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

Codificação genética de um aminoácido não-canônicos para a geração de anticorpos-droga conjuga através de uma reação rápida opaco

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...