We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

1. Rendimento Morpholino Estratégia de alto design <ol><li> Identificar um gene (s) de interesse (por exemplo, abordagem do gene candidato, análise de cis-regulatórias, RNA-Seq e ou telas diferenciais / proteômica). </li><li> Use genômica, transcriptomic, e dados de expressão de genes disponíveis em sites atualizados com freqüência (por exemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 e S. purpuratus Genome Pesquisa http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar se o perfil de expressão espaço-temporal sobrepõe-se com o mecanismo de desenvolvimento em questão. Se não houver dados disponíveis expressão é, em seguida, gerar iniciadores qPCR e / ou um anti-sentido na sonda in situ para avaliar o padrão de expressão do gene. </li><li> Depois de determinar o padrão de expressão espacial e temporal, obter a sequência de DNA a partir dos sites genômicos. <ol><li> Para a geração de oligonucleótidos morfolino-tradução de bloqueio, obter sequência óf a &quot;região não-traduzida (5 &#39;5 UTR) directamente a montante do codão de iniciação de expresso Sequence Tag (EST) bases de dados disponíveis no SpBase ou S. purpuratus Genoma sites de busca. Se esta informação não está disponível para o gene de interesse, em seguida, executar 5 &#39;RACE. </li><li> Para projetar um morfolino-blocking emenda, procure a seqüência genômica incluindo os exons e introns usando a ferramenta de andaime BLASTN em SpBase ou S. purpuratus Genome ferramenta de busca. </li></ol></li><li> Use o site oligonucleotídeo concepção http://oligodesign.gene-tools.com a fim de projetar a sequência par morfolino 25 base desejada. <ol><li> Para um bloqueio de morfolino-translacional, utilizar a sequência de ARNm a partir de 5 &#39;para 3&#39; como a fonte da sequência alvo de translação. Incluir sequência a 5 &#39;UTR (cerca de 70 nucleótidos a montante do sítio do início da transcrição), mais 25 bases da região de codificação (a jusante do local de início) com o codão de iniciação Wi acentuadath parênteses (ATG). </li><li> Para um bloqueio de morfolino-splicing, seleccionar intrão-exão ou uma sequência de fronteira exão-intrão e incluem 50 bases (25 bases da sequência de exão e 25 bases da sequência do intrão) em torno das regiões de fronteira. Digitalizar o genoma com a sequência morfolino para verificar que a sequência é única. </li></ol></li></ol> 2. A microinjecção de morfolino oligonucleótidos <ol><li> Prepare 3 soluções de mM dos oligonucleï¿½idos morfolino pela adição de 100 mL de água livre de nuclease para dentro do frasco morfolino 300 nmol. NOTA: Não use DEPC água tratada para a re-suspensão porque dietilpirocarbonato pode danificar o morfolino. </li><li> Para a primeira rotação reconstituição sobre o frasco contendo a solução de oligonucleótido durante 30 s à velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex brevemente, aquece-se a 65 ° C durante 5 a 10 min, vortex brevemente, e manter o estoque morfolino no quarto temperatura durante pelo menos 1 h. solução de morfolino<html> s são armazenados de -20 ° C a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução de injecção contendo oligonucleótidos morfolino na concentração desejada. Esta solução normalmente contém 20% de glicerol ou KCl 125 mM como um transportador e 15% de FITC-Dextrano (isotiocianato de f luoresceina de dextrano 10.000 MW de 2,5 mg Solução de estoque / mL). outros conjugados de dextrano fluorescente FITC-Dextrano e são rotineiramente usadas para identificar embriões injectados por microscopia de epifluorescência. soluções para injecção armazenar a -20 ° C. </li><li> Aquece-se a solução de morfolino a 65 ° C num bloco de aquecimento ou banho de água, durante pelo menos 2-5 minutos. </li><li> Resumidamente girar a solução de morfolino por 30 s em velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex durante 1 min e centrifuga-se a toda a velocidade (14.000 - 16.000 xg) durante pelo menos 10 min. </li><li> Coloque as agulhas de injecção com a solução morfolino. Para um protocolo de microinjeção detalhadas, por favor consulte Stepicheva e Song, 2014 21 e Felicidades e Ettensohn de 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. Fixação e in situ Protocolo às 24 horas pós-fertilização (hpf) em S. purpuratus Embriões NOTA: Este protocolo é modificado a partir Arenas-Mena et al. , 2000 23 e Sethi et ai. De 2014 24. <ol><li> Fixação <ol><li> Adicione algumas gotas de fixador (veja abaixo) para poços contendo embriões, misture delicadamente por pipetagem, e permitir-lhes para resolver. Remover a solução fixadora, e, em seguida, misturar embriões com duas lavagens de 180 ul adicionais de fixador. NOTA: É importante para misturar completamente os embriões durante as lavagens por pipetagem suave para cima e para baixo várias vezes. Não fazer isso pode reduzir a relação sinal-ruído. </li><li> Deixar os embriões para fixar na segunda lavagem fixador durante 50 min a 1 h à temperatura ambiente (TA) em paraformaldeído grau de microscopia electrónica de 4% que consiste em MOPS 10 mM, pH 7,0, 0,1% de Tween-20, e artificial seawateR (ASW). Faça esta solução fresca de cada vez para obter melhores resultados. Além disso, para facilidade e praticidade embriões foram fixados em placas de 96 poços. <ol><li> Para 20 mL de utilização fixador 5 mL de 16% de paraformaldeído, 15 mL ASW, 200 mL 1 M de MOPS pH 7,0, e 20 uL de Tween-20. </li></ol></li><li> Lavar 5 vezes à temperatura ambiente com 180 ul de MOPS tampão de lavagem consistindo em MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M e 0,1% de Tween-20 durante pelo menos 5 min ou até que os embriões cair para o fundo do poço. Mais uma vez, é importante para misturar bem os embriões para o tampão de lavagem cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes. MOPS tampão de lavagem pode ser utilizado para 2 dias se armazenado a 4 ° C. <ol><li> Para 40 mL de MOPS lavar utilização tampão 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de 5 M de NaCl, 32 mL de dH2O e 40 ul de Tween-20. </li><li> Embriões fixos pode ser armazenado a 4 ° C durante 2 dias. NOTA: Se o armazenamento de embriões fixos mais, em seguida, adicionar 0,2% de azida de sódio em MOPS tampão de lavagem para impedir o crescimento bacteriano.</li></ol></li></ol></li><li> Pré-hibridação <ol><li> Aspirar as MOPS tampão de lavagem e adicionar 180 uL de uma proporção de 2: 1 de tampão de lavagem para MOPS tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução por pipetagem suave várias vezes, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. tampão de hibridação constituída por formamida a 70%, MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M, 1 mg / mL de BSA e 0,1% de Tween-20. <ol><li> Para 40 mL de tampão de hibridação utilização 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de NaCl 5 M, 4 mL de dH 2 O, 0,04 g de BSA, e 40 uL de Tween-20. Misture bem num vórtice, e adicionar 28 ml de formamida, e novamente vórtice. </li></ol></li><li> Remover a relação de 2: 1 de MOPS lavar e tampões de hibridação e adicionar 180 uL de uma proporção de 1: 2 de MOPS tampão de lavagem de tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Antes de hibridação com sonda de misturar suavemente embriões em 100 - 150 ul de tampão de hibridação. Incubar os embriões a 50 ° C durante pelo menos 1h. NOTA: A incubação de embriões durante a noite é aceitável. Antes da incubação, os poços de selar com uma folha adesiva, a fim de evitar a evaporação. </li></ol></li><li> hibridização <ol><li> Num tubo separado adicionar 0,1-0,3 ng / mL de sonda e 500 ug / mL de ARNt de levedura em tampão de hibridação, seguida de vórtice suavemente para criar solução de sonda. ARNt de levedura é adicionada à solução de sonda para diminuir a ligação não específica da sonda anti-sentido. Pré-aqueça esta solução a 50 ° C e tampão de hibridação aspirado. </li><li> Misture embriões pré-hibridados em 100 mL da solução de sonda, selar com uma folha adesiva, e hibridar a 50 ° C durante 2 a 7 dias dependendo da sonda (sonda foxq2 podem ser incubadas durante 2 dias). NOTA: Os tempos de incubação varia com base fora da sonda. Alguns genes expressos em níveis baixos requerer até um período de incubação de 7 dias. placas de 96 poços pode ser colocado em uma caixa de umidade como um seguro contra a evaporação se os ADHESfolha ive não selar corretamente. </li><li> Lavagem de 5 vezes a 50 ° C com 180 ul de MOPS recém-preparadas tampão de lavagem para um total de 3 h. Em seguida, lavar 3 vezes (15 min) com 180 uL de tampão de MOPS lavar à TA. Lembre-se de misturar os embriões para o tampão de lavagem a cada vez com cuidado pipetando várias vezes. </li></ol></li><li> incubação de anticorpos <ol><li> Aspirar as MOPS tampão de lavagem e misturar embriões em 180 uL de tampão de bloqueio que consiste em 10% soro de ovelha normal e 5 mg / mL de BSA em MOPS tampão de lavagem e incubar durante pelo menos 45 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e, em seguida, misturar embriões em tampão contendo um bloqueio 1: 1500 de diluição de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina diluído em tampão de bloqueio. Incubar durante a noite à temperatura ambiente numa placa selada para evitar a evaporação. NOTA: Não deixe de anticorpos em mais do que durante a noite. </li><li> Lavar embriões 6 vezes (5 min ou até que os embriões gota) em MOPS tampão de lavagem à temperatura ambiente. embriões podemser armazenado durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> No desenvolvimento in situ <ol><li> Lavar os embriões 3 vezes (10 min) à temperatura ambiente com tampão acabado de fazer pH 9,5 constituído por Tris 0,1 M pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM, Levamisol 1 mM e 0,1% de Tween-20. <ol><li> Para 20 mL de tampão de pH 9,5 utilização 2 mL de 1 M de Tris pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 mL de 1 M de MgCl2, 20 uL de Tween-20, 16,6 ml de dH2O, e 0,0048 g Levamisol. </li></ol></li><li> Incubar os embriões a 37 ° C em tampão de coloração protegida da luz. Tampão de Coloração consiste de 10% de dimetil formamida, 4,5 mL / mL de 4-nitro cloreto de azul de tetrazólio (NBT) e 3,5 uL / ​​mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) em recém-feitos tampão de pH 9,5 . <ol><li> Para 1 mL de tampão de coloração utilizar 100 mL de dimetilformamida, 4,5 mL de NBT e BCIP 3,5 mL. </li></ol></li><li> Parar a reacção com fosfatase alcalina de lavagem de 3 a 5 vezes em tampão MOPS lavar. O wi reaçãoth da sonda foxq2 tipicamente leva cerca de 30 min a 1 h. Algumas sondas podem necessitar de incubação durante a noite a RT, quer ou 4 ° C. </li><li> Misture embriões em uma solução de lavagem de MOPS 70% e 30% de glicerol. O glicerol proporciona um índice de refracção necessárias para microscopia. Os embriões podem ser armazenados nesta solução por várias semanas. Selar as placas com parafina de plástico para evitar a evaporação. </li></ol></li><li> Preparação da lâmina e captura de imagem <ol><li> Prepare um slide, organizando três pequenas tiras de fita dupla face em um triângulo com pequenos intervalos entre as tiras numa lâmina. </li><li> Transferir os embriões na lavagem MOPS 70% e solução de glicerol a 30% para o centro do triângulo e cobrir com uma lamela. </li><li> Selar a lamela por aplicação de uma camada de unha polonês em torno das arestas da lamela. </li><li> Capturar imagens usando um microscópio composto luz com um objetivo 20X e uma câmera acoplada. </li></ol></li></ol>

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	<li>Erwin, D. H., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hierarchical+gene+regulatory+networks.">The evolution of hierarchical gene regulatory networks.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+body+plan+development.">Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development.</a> Cell. 144, 970-985 (2011).</li><li>Borggrefe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+intracellular+domain+integrates+signals+from+Wnt,+Hedgehog,+TGFbeta/BMP+and+hypoxia+pathways.">The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways.</a> Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).</li><li>Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+canonical+and+noncanonical+Wnt+signaling+pathways+patterns+the+neuroectoderm+along+the+anterior-posterior+axis+of+sea+urchin+embryos.">Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos.</a> PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).</li><li>Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF,+TGFbeta+and+Wnt+crosstalk:+embryonic+to+in+vitro+cartilage+development+from+mesenchymal+stem+cells.">FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).</li><li>Lapraz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK+and+TGF-beta+signaling+pathways+genes+in+the+sea+urchin+genome.">RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome.</a> Dev Biol. 300, 132-152 (2006).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+signalling+pathways+in+animal+development.">The evolution of signalling pathways in animal development.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).</li><li>Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+signaling+crosstalk+regulates+endomesoderm+segregation+in+sea+urchin+embryos.">Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos.</a> Science. 335, 590-593 (2012).</li><li>Range, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+positioning+of+the+anterior+neuroectoderm+in+deuterostome+embryos.">Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos.</a> Genesis. 52, 222-234 (2014).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+the+polarity+of+the+primary+body+axis.">Wnt signaling and the polarity of the primary body axis.</a> Cell. 139, 1056-1068 (2009).</li><li>Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deuterostome+origin+of+the+Spemann+organiser+suggested+by+Nodal+and+ADMPs+functions+in+Echinoderms.">A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms.</a> Nature communications. 6, 8434 (2015).</li><li>Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+mechanisms+of+Wnt+signaling+pathways.">Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways.</a> Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).</li><li>Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).</li><li>Houart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+telencephalon+during+gastrulation+by+local+antagonism+of+Wnt+signaling.">Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling.</a> Neuron. 35, 255-265 (2002).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Rottinger, E., Lowe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+hemichordates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates.</a> Development. 139, 2463-2475 (2012).</li><li>Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+control+in+the+sea+urchin+aboral+ectoderm:+spatial+initiation,+signaling+inputs,+and+cell+fate+lockdown.">Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown.</a> Dev Biol. 374, 245-254 (2013).</li><li>Saudemont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancestral+regulatory+circuits+governing+ectoderm+patterning+downstream+of+Nodal+and+BMP2/4+revealed+by+gene+regulatory+network+analysis+in+an+echinoderm.">Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm.</a> PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).</li><li>Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpBase:+the+sea+urchin+genome+database+and+web+site.">SpBase: the sea urchin genome database and web site.</a> Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).</li><li>Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+Hox+cluster+genes+in+the+ontogeny+of+a+sea+urchin.">Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin.</a> Development. , 4631-4643 (2000).</li><li>Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+labeling+in+developmental+gene+regulatory+network+analysis.">Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis.</a> Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).</li><li>Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+is+essential+for+patterning+the+maternally+specified+animal-vegetal+axis+in+the+sea+urchin+embryo.">beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).</li><li>Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wnt-FoxQ2-nodal+pathway+links+primary+and+secondary+axis+specification+in+sea+urchin+embryos.">A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos.</a> Dev Cell. 14, 97-107 (2008).</li><li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal:+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo.">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li><li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo.">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li><li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin,+a+TGF-beta+related+to+Vg1.">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li><li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin.">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li><li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells,+control+skeletal+morphogenesis+[corrected]+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development.">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li><li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin.">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology.">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li><li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm.">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).</li><li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li><li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos.">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li><li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos.">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li><li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR/Cas9+system.">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A metodologia aqui apresentada é um exemplo que ilustra o poder de usar embriões com menos complexidade genômica e morfológica de vertebrados para compreender as vias de transdução de sinalização e GRNs regem mecanismos de desenvolvimento fundamentais .. Muitos laboratórios estão usando ensaios semelhantes durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar cedo para dissecar o vias envolvidas em outros eventos de especificação destino de sinalização celular (por exemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, e FGF sinalização) 27, 28, 29, 30, 31. Estes estudos ouriço-do-mar têm revelado muitos mecanismos de sinalização nova e interessante, e muitos aspectos destes mecanismos de sinalização que regulam o desenvolvimento de ouriço do mar no início parecem ser conservados entre deuterostomes 9, 27, 30 &lt;sup&gt;, 31, 32. É importante ressaltar que a exploração da biologia do desenvolvimento de embriões de metazoários não tradicionais tem visto um aumento nos últimos anos, e muitas dessas características share com embriões de ouriço do mar durante o desenvolvimento precoce 9, 15, 16, 33. Assim, a metodologia aqui apresentada poderia ser amplamente aplicada ao estudo das vias de transdução de sinal em muitos desses organismos durante o desenvolvimento precoce. Todas as técnicas utilizadas para derrubar a expressão do gene pode potencialmente produzir fora do alvo derrubar efeitos. Morpholinos provaram ser um método de perturbação gene extraordinariamente eficaz em embriões de ouriço-do-mar, em grande parte porque a comunidade realiza controlos rigorosos para aliviar as preocupações de que o fenótipo knockdown não é específica. Estes ensaios básicos de controle pode ser modificado e aplicado a outras técnicas de knockdown (isto é, mais nítidas / Cas9). Os controlos são: 1) os ensaios de resposta à dose cuidadosa são realizadas com cada morfolino até ≥ 80% dos embriões injectados mostram fenótipo defeituoso e / ou a expressão do gene marcador; 2) Morpholinos são descartados se eles causam atrasos no desenvolvimento graves ou mesmo a morte em concentrações moderadas. Estes fenótipos são provavelmente devido efeitos tóxicos fora do alvo; 3) Pelo menos dois morpholinos que são projetados para atingir locais de ligação diferentes são usados ​​para confirmar fenótipos knockdown; 3) missense morpholinos são injectados; 4) fenótipos morfolino são resgatados através da introdução de mRNA para o gene alvo em morfolino knockdown embriões; 5) Quando, ensaios de coloração de anticorpos de montagem integrais disponíveis são usados ​​para mostrar que knockdowns morfolino evitar que a tradução do gene de interesse. É importante notar que a comunidade de ouriço-do-mar utiliza pelo menos quatro espécies para estudos funcionais, dependendo de onde os cientistas estão localizados. em mocasos do st, a nosso conhecimento, as várias morpholinos usado para derrubar as orthologs geraram fenótipos semelhantes em cada uma das espécies (por exemplo, ver esses estudos funcionais em Nodal sinalização 34, 35, 36, 37). Estes resultados argumentar de forma convincente que as nossas experiências de controlo rigorosos seleccionar fortemente para aqueles morpholinos que produzem efeitos no alvo knockdown. Outro aspecto importante desta metodologia é identificar cuidadosamente os alvos de transcrição que são mais provável diretamente ativados pela via de sinalização em consideração. O exemplo que nós fornecemos aqui é fortuita, pois a ativação espaço-temporal das vias de sinalização e regulação para baixo de um gene robustamente expressa, foxq2, ocorrem no início do desenvolvimento e os GRNs regem camada germinativa e especificação eixo no embrião ouriço do mar estão bem-established. Assim, obviamente uma limitação desta metodologia é que, em muitos casos, pode ser necessário para a actividade knockdown de uma via de sinalização particular durante as fases posteriores de desenvolvimento e nos territórios específicos. Existem várias tecnologias agora disponíveis que podem ser usados para ultrapassar estas limitações (por exemplo foto-morfolinos, Crisper / Cas9 38, FACseq) mesmo em embriões modelo não-tradicionais, que não são passíveis de manipulação genética. Em muitos casos, pode não ser possível identificar um gene candidato para baixo fluxo de uma via de sinalização de interesse, cuja expressão espaço-temporal é tão facilmente avaliada como foxq2, que tem uma proporção extremamente elevada de sinal-para-ruído. É comum para encontrar genes com rácios muito mais baixos de sinal-para-ruído. Se um outro gene não está disponível para um determinado ensaio, em seguida, in situ da sonda gerada para o gene de interesse deve ser tão longo quanto possível. Em geral, usar sondas com mais de 1.000 pares de basess aumenta significativamente o sinal e diminui o ruído colorimétrico e em ensaios in situ fluorescente. Uma vez que o ensaio de transcrição que indica onde e quando a via de transdução de sinal de interesse é a sinalização é estabelecida, o próximo passo é importante para determinar tanto a espacial e a expressão temporal dos factores reguladores putativos envolvidos no mecanismo de desenvolvimento em estudo. dados da tela e / ou QPCR diferencial são ferramentas importantes, mas elas podem ser enganadoras. Confirmando com toda montagem de hibridação in situ que o gene de interesse é expressa no território em que a via de sinalização está ativo impede um desperdício de tempo e recursos. Além disso, estes dados permitem previsões a serem feitas sobre a arquitetura reguladora do gene, que irá informar as análises mais detalhadas que se seguirão uma vez que os jogadores envolvidos são identificados com este ensaio inicial (Figura 2). Nós apresentamos uma simple ensaio colorimétrico neste protocolo; No entanto, hibridação in situ fluorescente (FISH) também pode ser usado para visualizar várias sondas fluorescentes ao mesmo tempo, permitindo a resolução espacial aumentada no território de interesse, bem como microscopia confocal 24. Além disso, o peixe pode ser emparelhado com coloração de anticorpos para identificar modificações pós-traducionais e / ou em que a via de sinalização de interesse é activa 24. Há duas etapas críticas do protocolo que são muitas vezes esquecidos. Um deles é a preparação da solução de oligonucleótido morfolino. É importante para aquecer a solução de morfolino a 65 ° C durante 2 minutos para 5 minutos e centrifugar-lo à velocidade máxima durante pelo menos 10 min antes de carregar as agulhas de injecção. Estes passos são essenciais quando a solução estoque é morfolino armazenado a -20 ° C, porque os oligonucleótidos de morfolino pode precipitar a partir da solução a partir têmperaAtures e a fiação da solução impede que as agulhas de injecção de ser obstruído por partículas. Outro aspecto crítico a considerar é que os embriões devem ser cuidadosamente misturados em várias soluções durante cada etapa do processo de fixação e em protocolos de hibridização in situ. Nas nossas mãos, o sinal é reduzido e / ou o fundo é aumentada se este passo simples não é efectuada. Talvez o aspecto mais importante da metodologia aqui apresentada é que ele permite a análise funcional eficiente de grandes conjuntos de potenciais moléculas de transdução de sinal gerado por transcriptómica de nova geração e proteoma. Uma vez que estas análises funcionais iniciais confirmam um grupo de fatores de regulação estão envolvidos em uma via de interesse, o próximo desafio é usar ensaios estabelecidas (por exemplo knockdowns funcionais; detalhada multi-colorido todo de montagem in situ; interações bioquímicas) para avaliar como eles se encaixam o extracelluLar, intracelular, e os níveis de transcrição das vias de transdução de sinais envolvidos num processo de desenvolvimento particular.

redes de genes reguladores (GRNs) e vias de transdução de sinal estabelecer a expressão espacial e temporal dos genes durante o desenvolvimento embrionário que são usados ​​para construir o plano de adulto corpo do animal. Célula-a-célula vias de transdução de sinal são componentes essenciais destas redes reguladoras, que proporciona os meios pelos quais as células comunicam. Estas interacções celulares estabelecer e aperfeiçoar a expressão de genes reguladores e diferenciação dentro e entre os vários territórios durante a embriogênese 1, 2. Interações entre os moduladores secretadas extracelulares (ligantes, antagonistas), receptores e co-receptores controlar as atividades de vias de transdução de sinal. Uma variedade de moléculas intracelulares transduz estas entradas resultando na expressão alterada do gene, divisão, e / ou a forma de uma célula. Enquanto muitas das moléculas-chave utilizadas nos níveis extracelulares e intracelulares nas vias principais sãoconhecido, é um conhecimento incompleto, devido em grande parte à complexidade das vias de sinalização individuais. Além disso, diferentes vias de sinalização, muitas vezes interagem uns com os outros, positivamente ou negativamente na extracelular, intracelular, e os níveis de transcrição de 3, 4, 5, 6. É importante ressaltar que os principais componentes de vias de transdução de sinal são altamente conservadas em todas as espécies de metazoários, e, curiosamente, a maioria das principais vias de sinalização, muitas vezes executar funções de desenvolvimento semelhantes em muitas espécies quando se comparam os organismos de filos intimamente relacionados, em especial, 7, 8, 9, 10, 11. O estudo da sinalização durante o desenvolvimento é uma tarefa difícil em qualquer organismo, e hávários desafios significativos para estudar vias de sinalização na maioria dos modelos deuterostomia (vertebrados, cordados invertebrados, hemichordates, e equinodermes): 1) Em vertebrados há um grande número de possíveis ligandos e as interacções receptor / co-moduladores, moléculas de transdução intracelular, bem como potenciais interacções entre diferentes vias de sinalização, devido à complexidade do genoma de 12, 13, 14; 2) A morfologia complexa e movimentos morfogenéticos em vertebrados muitas vezes tornam mais difíceis de interpretar as interações funcionais em e entre vias de transdução de sinal; 3) As análises na maioria dos não-equinodermos espécie modelo de invertebrados deuterostomia são limitados por janelas curtas de gravidity com exceção de algumas espécies de tunicados 15, 16. oouriço-do-mar embrião tem algumas das limitações acima mencionadas e oferece muitas qualidades únicas para a realização de uma análise detalhada das vias de transdução de sinal in vivo. Estes incluem o seguinte: 1) A relativa simplicidade do genoma do ouriço-do-mar reduz significativamente o número de possíveis do ligando, do receptor / co-receptor e molécula de transdução intracelular interacções 17; 2) Os GRNs que controlam a memória descritiva e modelação das camadas germinativas e grandes eixos embrionários são bem estabelecida em embriões de ouriço-do-mar, auxiliando na compreensão do contexto regulamentar da célula / território receber os sinais 18, 19; 3) Muitas vias de transdução de sinal podem ser estudadas entre as fases de clivagem e de gástrula inicial quando embriões consistem de um único epitélio em camadas cuja morfologia é mais fácil de analisar; 4) As moléculas envolvemd nas vias de sinalização nas ouriços do mar são facilmente manipulados; 5) Muitas ouriços do mar estão grávidas de 10 a 11 meses por ano (por exemplo, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus). Aqui, apresentamos um método para caracterizar de forma sistemática e eficiente componentes das vias de sinalização que especificam e territórios padrão em embriões de ouriço-do-mar para ilustrar as vantagens que vários sistemas modelo de invertebrados oferecem no estudo dos mecanismos moleculares complexas.

<table><tbody><tr><td>Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Customized</td><td>More information at www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Make 25 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole hydrochloride (levamisole)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

the power of simplicity: sea urchin embryos as in vivo developmental models for studying complex cell-to-cell signaling network interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

No embrião ouriço-do-mar temos demonstrado que 3 diferentes sinalização Wnt ramos (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) 4, 25 interagem de modo a formar uma rede de sinalização de Wnt que governa ântero-posterior padronização (AP). Uma das consequências mais importantes destes eventos de sinalização é que a GRN inicial amplamente expressa neuroectoderma anterior (ANE) torna-se restrita a um pequeno território ao redor do pólo anterior, no início de gastrulação (24 hpf em S. purpuratus). Estes resultados indicam que a sinalização de Wnt / β-catenina impede a activação do gene ANE na metade posterior do embrião por a fase de 32 células. Em seguida, esta via transmite um sinal para a via de sinalização Wnt / JNK não canónicas que progressivamente para baixo regula a ANE GRN na metade anterior do embrião entre a fase 60-célula e a gastrulação precoce. Finalmente, uma terceira pathwa Wnt não-canônicay, Wnt / PKC, antagoniza o Wnt / JNK via de sinalização e impede-o de eliminar especificação ANE em torno do pólo anterior (Figura 1A) 4. Utilizamos a expressão espaço-temporal de foxq2 de ensaio para a actividade de cada um dos ramos de sinalização Wnt durante AP padronização porque é um dos dois primeiros genes activados no GRN ANE e é facilmente avaliadas por hibridização in situ por causa da sua expressão robusta 26. Se qualquer ramo de sinalização Wnt indivíduo é perturbado, então existem fenótipos expressão clara que indicam que via está envolvida: 1) Na ausência de Wnt / β-catenina sinalizando uma ampla mecanismo regulador materna (Figura 1A) activa a expressão foxq2 ao longo de todo o embrião (Figura 1BB); 2) Na ausência de Wnt / JNK foxq2 sinalização é expressa em todaa metade anterior do embrião (figura 1BC), mas ainda é regulada negativamente na metade posterior devido à actividade de sinalização de Wnt / β-catenina (Figura 1A); Na ausência de Wnt / PKC expressão foxq2 sinalização é completamente regulada para baixo ao longo do embrião (figura 1BD), porque o / β-catenina Wnt e Wnt / JNK vias de sinalização são regulados para cima 4, 25. Assim, temos desenvolvido um ensaio que temos chamado o sistema de leitura transcricional foxq2 que, quando combinado com o nosso trabalho sistemático (Figura 2), permite-nos identificar eficiente e testar se um gene de interesse está envolvida em um ou mais dos Wnt sinalização ramos. Usando o sistema de metodologia e de leitura foxq2 aqui apresentada, foram identificados vários Molec extracelular ou intracelular putativaULES provavelmente envolvidos na rede de Wnt que rege especificação eixo AP, quatro dos quais são apresentados na Figura 3. Os embriões injectados com morpholinos concebidos para knockdown da expressão quer do factor de transcrição, ATF2, ou o modulador de Wnt extracelular segregada, Wif-1, mostraram um aumento da expressão foxq2 para o pólo posterior do embrião em fases gastrulação início (Figura 3A - C ). Estes resultados imitar os fenótipos observados quando os membros da via / sinalização JNK Wnt são derrubadas 4, 25, sugerindo que eles são membros deste ramo de sinalização que é necessário para regular negativamente a expressão ANE GRN na metade anterior do embrião. Em contraste, a expressão foxq2 foi eliminada quando derrubado a expressão do factor de transcrição, NFAT (Figura 3D), e o modulador extracelular segregada, sFRP3 / 4 (Figura 3E),sugerindo que estas moléculas estão envolvidas na via Wnt / PKC que é necessário para antagonizar a regulação para baixo da ANE GRN por sinalização de Wnt / JNK. Com base nestes resultados rapidamente obtidos agora somos capazes de realizar análises funcionais mais detalhados que colocarão esses fatores dentro da rede de sinalização Wnt evoluindo envolvido no GRN que governa AP padronização no embrião ouriço-do-mar. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55113/55113fig1.jpg" /> Figura 1. O Modelo de Especificação AP e padronização na ouriço do mar e do foxq2 transcricional Leitura Sistema. (A) A regulação progressiva para baixo da ANE GRN a um território em torno do pólo anterior pela rede de sinalização Wnt detalhada no texto e em 4, 9. (B) Um transcriptionaG sistema de leitura que mostra a expressão foxq2 nas knockdowns via Wnt indicados (KO). Barra de escala = 20 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55113/55113fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55113/55113fig2.jpg" /> Figura 2. Um Experimental Diagrama de Fluxo para Eficiente Wnt Análise de Redes no embrião Sea Urchin. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55113/55113fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55113/55113fig3.jpg" /> Figura 3. Transdução de Sinal moléculas envolvidas na Administração AP Especificação Axis Wnt rede e padronização identificados utilizando o </strong&gt; foxq2 transcricional Leitura Sistema. Knockdowns (A, B, C) morfolino sugerem que um modulador de sinalização intracelular, ATF2, e modulador extracelular segregada, Wif-1, são potenciais jogadores da via / JNK sinalização Wnt. (A, D, E) knockdown experiências indicaram que a NFAT, um modulador de sinalização intracelular, e sFRP3 / 4, um modulador de sinalização Wnt segregada, estão envolvidos na sinalização Fzl1 / 2/7-PKC. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55113/55113fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

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The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

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Principles of Cell Signaling

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia do Desenvolvimento

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biologia

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Química

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Geração de Explantes de Blastoderm ingênuos de Embriões de Zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

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