Nós gostaríamos de agradecer fazendas Smithfield pela doação do tecido pulmonar porcina intacta. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang e do Departamento de Cirurgia Plástica VCU por nos permitir usar o seu equipamento. amostras de hidrogel e de tecido foram preparados para MEV no Departamento de Anatomia e Neurobiologia Microscopia Facility VCU apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Centro Núcleo Grant 5 P30 NS047463 e, em parte, pela forma de financiamento NIH-NCI Cancer Center Support Grant CA016059 P30. SEM imagem de amostras no VCU Nanotechnology Núcleo Caracterização Facility (NCC). Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Solução </td><td> filtro esterilizado </td><td> Instruções </td></tr><tr><td> 2 O DIH </td><td> sim </td><td> DIH 2 O; esterilizada por filtração </td></tr><tr><td> 0,1% de solução de Triton X-100 </td><td> sim </td><td> Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado. </td></tr><tr><td> 2% de desoxicolato Solução </td><td> sim </td><td> Sob exaustor adicionar 2 g solução de desoxicolato de sódio por 100 ml DIH 2 O e agitar até à dissolução; Filtrar em condições estéreis </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> sim </td><td> Adicionar 58,44 g de NaCl para 1 L de DIH 2 O; agitar até se dissolver; filtro esterilizado </td></tr><tr><td> solução de DNase </td><td> sim </td><td> Adicione 12.000unidades de ADNase a 1 L DIH 2 O; Adicionar 0,156 g MgSO4 (Anidro), e 0,222 g de CaCl 2; agitar até se dissolver; filtro esterilizado </td></tr><tr><td> PBS </td><td> sim </td><td> Combine 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibico hepta-hidratado), 80 g de NaCl e 2 g de KCl com 10 L DIH 2 O; agitar até se dissolver; ajustar o pH para 7,4; filtro esterilizado </td></tr></tbody></table> Tabela 1: soluções necessárias para Decelularização Tissue. Faça as soluções acima para o processo de descelularização. Armazenar a 4 ° C. Cerca de 2,5 L será necessário para um pulmão de porco. 1. Formação Hidrogel <ol><li> Porcina Lung Decelularização (adaptado a partir de referências 9,10) <ol><li> Obter, um en bloc pulmão de porco normal, de um matadouro, com coração e vasculature intacta. </li><li> Use tesouras de tecidos ou um bisturi para dissecar afastado do coração, vasculatura tão próximo quanto possível do coração de corte, mantendo-se a vasculatura irá ser usado em passos posteriores para perfusão. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado o tecido conjuntivo em torno da traqueia, brônquios e vasculatura utilizando um bisturi ou tesoura. NOTA: Determinar o melhor pulmão para usar para o resto do procedimento, escolhendo um pulmão sem grandes cortes ou perfurações através da pleura e grandes quantidades de atelectasia ou oclusão vascular que podem impedir a eficácia do processo de descelularização. </li><li> Cortar o pulmão subóptima deixando tanto brônquio ligados à traqueia quanto possível (coração, o tecido conjuntivo e os lóbulos dos pulmões removidos podem ser eliminados). Deve haver um pulmão que continuem ligadas ao traqueia e vasculatura. NOTA: Manter seções para histologia, se desejar. 9 </li><li> Feche brônquios desconectados com grampos ou suturas para prevent excesso de refluxo. </li></ol><ol start="6"><li> Preparar as soluções de decelularização e refrigerar a 4 ° C até serem necessárias (Tabela 1). </li><li> Usando uma bomba manual canulada para se ajustar a artéria pulmonar, a perfusão do tecido pulmonar 3 vezes com água desionizada, tanto através da artéria pulmonar e traqueia. Perfundir vasculatura primeiro de cada vez. Comece com cerca de 1 L para a vasculatura e 1,5 L em cada traqueia para perfusão, mas como os detritos celulares são removidos mais líquido pode ser perfundido através do sistema. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia com Triton solução X-100. </li><li> Submerge tecido pulmonar em solução de Triton X-100 durante 24 h a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de desoxicolato. </li><li> Submergir as secções de tecido em desoxicolato durante 24 h a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li>Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de NaCl. </li><li> Submergir o tecido em solução de NaCl filtrada durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Perfundir vasculatura e traquéia 3 vezes com água DI para enxaguar. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traquéia, com solução de DNase. </li><li> Submergir o tecido em solução de ADNase filtrada durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Perfundir tanto vasculatura e traqueia 5 vezes com PBS. </li><li> Dissecar o tecido cartilaginoso perceptível, traqueia e todos os túbulos de 2 mm ou maior em diâmetro (encontrado principalmente em torno do hilo e porções mediais dos pulmões) de condução das vias aéreas, deixando apenas a zona respiratória (principalmente nas áreas periféricas). </li><li> Dissecar tecido em 1 seções polegadas ou menores. Orientação do tecido não interessa para este passo. </li><li> Deitar fora o excesso de tecido líquido e coloque em tubos de 50 ml cônico. Congelar o tecido a -80 ° C. NOTA: Manter seções para histologia para assegurar a remoção de células e debri celulars, se desejado. Usamos H &amp; E, α-galactosidase, PicoGreen, hidroxiprolina, ninidrina, azul de alcian, SDS-PAGE e espectrometria de massa para caracterizar. 9 </li></ol></li><li> Lung Processing <ol><li> Retirar as tampas de tubos congelados contendo tecido pulmonar decelularizado. </li><li> Coloque papel de filtro sobre a abertura do tubo e prenda com elástico. NOTA: Tubo e conteúdo ainda deve ser congelado qualquer outro modo, em -80 ° C até congelados. </li><li> Liofilizar o tecido até que todo o excesso de líquido está desaparecido, usando um secador de gelo de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para moinho. </li><li> Antes de iniciar adicionar nitrogênio líquido para fábrica de freezer para esfriar isolamento e componentes internos às condições de trabalho. </li><li> Retirar bar mill magnético do tubo moinho e adicionar o tecido para cobrir parte inferior. </li><li> Substitua bar moinho e adicionar o tecido ligeiramente comprimido. O bar moinho ainda deve mover-se livremente. </li><li> Fechar o tubo moinho e place no moinho congelador. </li><li> Preencha nitrogênio líquido para linha de preenchimento máximo. </li><li> Moinho congelador todo o tecido em pó fino (aproximadamente 5 min, taxa de compactação de ~ 600 min-1), em um cilindro de policarbonato com um pêndulo de aço inoxidável, bem como tampões de extremidade de aço inoxidável usando o moinho de congelador de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> A formação do gel micro-porosa (8 mg / ml) (adaptado a partir de referências 9,11) <ol><li> Adicionar 1% (w / v) do pó descelularizado e 0,1% (w / v) de pepsina a HCl 0,01 M, sob agitação constante (deve ser capaz de ver o fluxo no nível superior do líquido), à temperatura ambiente, durante 48 hr. NOTA: O pó é estaticamente carregada, então a adição do HCl, depois do pó proporciona a oportunidade para lavar o excesso de fora das paredes do tubo. </li><li> Após a digestão durante 48 h, e colocar a solução de reagentes em gelo durante 5 min. </li><li> Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, umad 11,11% (v / v) de PBS 10X (para trazer toda a solução de concentração 1x), levar a solução de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4. NOTA: A solução pode agora ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana. Execute cinética de gelificação utilizando reometria 9 se desejar. </li></ol></li></ol> 2. Cross-ligando hidrogéis para melhorar a força mecânica <ol><li> Soluções de 1%, 0,1%, e 0,01% w / v solução de genipina de reticulação foram preparadas por dissolução da quantidade necessária de pó de genipina em 10% de DMSO. </li><li> Vortex a solução cada 15 minutos durante 1 hr. </li><li> Adicionar solução genipina para cobrir hidrogéis ECM (100 uL para cada poço de uma placa de 96 poços) que foram previamente montados na parte 1.3.4. </li><li> Deixar cada hidrogel ECM para reticular durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Lavar o hidrogel ECM 3 vezes com PBS até a solução de lavagem não é mais azul. Os hidrogéis reticulados então estará pronta para posterior caracterização e ceEstudos de cultura II. </li></ol> 3. Cultura de Células com microporosa Gel <ol><li> Revestimento Bidimensional <ol><li> Usando a solução de 1.3.3, adicionar 20 ul de solução Pregel a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não tratados. </li><li> refrigere durante a noite a 4 ° C para permitir a adsorção de proteína à placa. </li><li> solução Aspirar Pregel e enxaguar com PBS. </li><li> Células de passagem 9. </li><li> Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços. </li><li> Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C. </li></ol></li><li> Três de cultura de células tridimensional 9 <ol><li> Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, ressuspender as células peletizadas a uma concentração de 1.000.000 células / ml de solução Pregel. </li><li> dispensar rapidamente 16 ul de suspensão de células Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços, de modo a formar um hidrogel de espessura ~ 500 um para a cultura de células em 3D. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30min para o gel para formar. </li><li> Adicionar 100 ul de meios de comunicação para o topo de hidrogeles formados e incubar a 37 ° C. </li></ol></li><li> Três de cultura de células tridimensional em geles de rigidez variável <ol><li> Utilizando uma solução a partir de 1.3.3, pipeta 100 uL de solução Pregel em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para formar gel. Nota: Cross-ligando passos da parte 2 podem ser usados ​​aqui. </li><li> Células de passagem 9. </li><li> Adicionar células 10.000 / cm 2 a poços. </li><li> Aumentar a mídia para 100 jil por poço e incubar a 37 ° C. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 3D Cell Culture. , (2011).</li><li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture protocols. , (2012).</li><li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials:+where+we+have+been+and+where+we+are+going.">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li><li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation.">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li><li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+human+lung+stem+cells.">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li><li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+Krt5++distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration.">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. 13 No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro. resposta celular aos sinais biofísicos de ECM não pode ser pesquisado usando polímeros. Tissue resposta celular específica para sinais biofísicos não pode ser pesquisada usando outros tecidos. pesquisadores de regeneração e clínicos acreditam que o uso andaimes descelularizados melhora a regeneração de tecidos e cicatrização de feridas. portadores de doenças pulmonares crônicas necessitam de melhorias terapêuticas para aumentar a disponibilidade de órgãos e diminuir a imunogenicidade. Órgão, interações célula-ECM específicos deve serpesquisado para mais biologia órgão. Usando o ECM como um andaime para as células do pulmão de células mostrou resultados consistentes. 14,15 Usando fatias de pulmão a partir de modelos doentes incentiva a renovação doença 16-tronco ou progenitoras células, encontradas nos pulmões distais, 17,18 e exige nichos especiais para evitar a formação de teratomas. Utilizando tecido específico ECM como um veículo de entrega, os efeitos regenerativos de células progenitoras pode ser melhorada. O hidrogel ECM estabelece um ambiente mais aplicável para avaliar as reacções celulares a matriz extra-celular. Um grande corpo de pesquisa existe olhando rigidez no que se refere à sinalização celular. Nosso método de reticulação genipina permitir a célula-rigidez sinalização, bem como célula-ECM interações de componentes. Enquanto rigidez hidrogel pode ser manipulado por ECM quantidade e proporção de proteínas, a utilização de genipina permite mudanças de rigidez de hidrogel tanto independente do teor de ECM. ajustar genconcentração EPIN pode permitir uma sintonização precisa das propriedades mecânicas para assemelhar-se mais estreitamente tecido natural pulmonar 6. A partir de dados obtidos usando genipina hidrogéis de pulmão periférica no presente estudo, um aumento de 15 vezes (de 5 Pa a 75 Pa) foi anotado. Com base em dados reológicos de tecido de pulmão normal de rato biopsiado que foi descelularizados utilizando os mesmos métodos, podemos conseguir aproximada da rigidez do tecido pulmonar periférica (dados não mostrados) através da adição de 1% de genipina de hidrogéis pulmonares periféricas ou a adição de 0,01% de hidrogéis pulmão inteiro (avaliado ). Usando o ECM pulmonar periférica que consiste de parênquima pulmonar feito um gel consideravelmente mais macio em comparação com os nossos resultados pulmão inteiro ECM hidrogel anteriormente publicados 7. Portanto, além de genipina, selecção de regiões específicas de tecido pulmonar para decellularize pode impactar significativamente a rigidez. Existem oportunidades para melhorar este método, o que pode incluir passos adicionais habitualmente utilizados em perfusina descelularização do tecido pulmonar todo. Este método tem sido utilizado em tecido pulmonar normal e podem necessitar de modificação para descelularização de pulmões doentes. Nós ainda não analisou este processo em estados de doenças específicas. Obtemos nossos pulmões remetidos em gelo durante a noite de um matadouro. Este método poderia limitar a eficácia do nosso processo devido à atelectasia ou oclusão vascular; no entanto, raramente temos para remover áreas de pulmão que não foram completamente descelularizados. Ao obter o tecido pulmonar fresco, nós recomendamos fazer todas as soluções necessárias antes de começar os pulmões para evitar qualquer pausa no processamento de tecidos. Pesquisas anteriores descobriram que o uso de ácido peracético como uma fase de esterilização final a matriz produtiva provoca uma regenerativa fenótipo de macrófagos M1 na infiltração de células do sistema imunológico, 19 potencialmente melhorando efeitos proregenerative de tecido decelularizado. Outra pesquisa tem ido para o uso de outros detergentes para concluir o processo, mas aqueles appear ser preferências específicas de laboratório com finalmente o mesmo impacto sobre a descelularização. O procedimento e digestão passos decelularização possa ser otimizado, dependendo da aplicação específica do pesquisador. Por exemplo, alterar o tempo de neutralização ou métodos de digestão de gel pode alterar a composição de proteína, propriedades mecânicas, ou cinética de gelificação. Alternativas para o método discutido aqui pode variar no nível de complexidade de acordo com os resultados experimentais desejados. Por exemplo, se o objectivo era manter a membrana basal intacta, tanto quanto possível, uma bomba de perfusão com um controlo limitado pressão pode diminuir danos na barreira. Além disso, se um tinha uma configuração de laboratório disponível para manter ambos os pulmões intactos para as espécies maiores, o processo de descelularização pode melhorar a eficácia. Por outro lado, uma mão de moagem técnica com um almofariz e pilão pode ser aplicada ao tecido liofilizado para laboratórios que não têm um CryoMill. Seria de esperar que grindin mãog para produzir fragmentos maiores, o que limita a área da superfície disponível para a digestão com ácido de modo que os tempos de digestão pode precisar de ser alterada neste caso. Alternativas não estão limitados aos passos descelularização e à formação de hidrogéis. Gluteraldeído tem sido utilizado como um agente de reticulação para hidrogeles, proporcionando uma alternativa possível para o aumento da resistência mecânica dos hidrogeles biológicos utilizados para sistemas modelo. Outros sistemas modelo incluem pulmões descelularizados intactas como um in vitro sistema de cultura 3D, ou mais comumente olhando fatias pulmonares como um modelo 3D in vitro andaime. 20 Já mencionamos as limitações que vêm de trabalhar com andaimes de polímeros, bem como andaimes de componentes individuais, mas aqueles permanecer como possíveis alternativas para o procedimento apresentado aqui. Além disso, existem métodos alternativos para determinação da eficácia descelularização (tais como o isolamento do ADN), a gelificação (pode usar ensaios de turbidez), e uma ligação de célulasproliferação nd (como o uso de CCK8). Descobrimos que os métodos descritos aqui são mais que suficientes para caracterizar hidrogéis para uso como andaimes modelo 3D. Os hidrogéis ECM pulmonares que descrevemos aqui fornecer uma plataforma eficaz para estudar as interações célula-ECM. A solução Pregel tem potencial como um revestimento para transportadores de droga de polímero, ajudar na distribuição de células estaminais mesenquimais, ou como plataforma de administração de fármaco por si só. O protocolo aqui apresentado fornece os passos para a criação de uma base de hidrogel versátil derivado de ECM pulmão.

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6. 
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research. 
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td style="width:371px;">Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Genipin</td>
			<td style="width:135px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">078-03021</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10x</td>
			<td style="width:135px;">Quality Biological</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>45000-448</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">8519</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand pump</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-239-1</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graduate Beaker</td>
			<td style="width:135px;">VitLab</td>
			<td align="right" style="width:119px;">445941</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomill</td>
			<td>SPEX</td>
			<td>6700</td>
			<td>Use cryogloves and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lyophilizer</td>
			<td>FTS FlexiDry</td>
			<td></td>
			<td>Use gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rheometer</td>
			<td>Discovery</td>
			<td>HR-2</td>
			<td>Use gloves and eye protection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tunable hydrogels from pulmonary extracellular matrix for 3d cell culture

Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.

Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve aparecer homogénea durante meses se armazenada a 4 ° C. Nós incluímos uma tabela básica solução de problemas para ajudar a identificar fontes de erro durante o processo (Tabela 2). Após gelificação, hidrogéis pode ser usado imediatamente ou armazenado para uso futuro. Ensaio reológico confirma que mais de 90% de a gelificação ocorre nos primeiros minutos depois de atingir 37 ° C (Figura 3). hidrogéis formados são estáveis ​​por longos períodos em PBS, mas a fixação das células e proliferation pode alterar (Figura 4). Embora este protocolo é escrito para pulmão de porco, limitações de espaço nos limita a usar apenas um pulmão quando descelularizante pulmões de suínos. Temos usado o mesmo procedimento com pequena modificação para decellularize ambos os pulmões para outras espécies. Para os ratos e ratinhos, os pulmões pode ser deixado intacto e o coração em anexo, mas o tecido conectivo ainda deve ser removido com um bisturi ou tesouras. Nós manter o coração intacto e em anexo para ratos e camundongos e perfundir as soluções através do ventrículo direito em vez da artéria pulmonar. Perfusão da traqueia é ainda o mesmo; No entanto, a cânula pode ser suturado na traqueia para facilitar o acesso de espécies menores. Temos adicionados vários tipos de células, as células estaminais mesenquimais humanas, 9 de ratinho células estaminais mesenquimais, as linhas celulares epiteliais humanas (A549s), endo humano microvascular primáriacélulas Thelial (HpuVECs), e células da veia umbilical humana (HUVECs) epiteliais dentro e na superfície dos hidrogéis ECM pulmão. Nós não encontrou problemas em relação a natureza xenogenética dos géis formados. O nosso trabalho anterior demonstrou uma redução significativa em α-galactosidase nos hidrogéis suína. 9 A solução de pré-gel pode também ser usado como um revestimento a 4 ° C, para melhorar a fixação celular. A solução Pregel melhora a adesão e proliferação HpuVEC quando adicionado a placas de cultura de tecido revestido de pulmão ECM. Poços revestidos demonstram melhorou significativamente a adesão celular em comparação com os poços não tratados (Figura 5). Adicionando genipina aumenta hidrogel de ligação cruzada. Este aumento da reticulação pode proporcionar uma rigidez mais fisiologicamente relevante, ao diminuir a degradação do ECM. A diminuição da degradação, embora menor, in vitro, pode ocorrer devido a um aumento da ligação entreproteínas e, portanto, maior resistência à remodelação de ECM por células. Utilizou-se varrimentos de frequência num reómetro para medir as propriedades mecânicas do hidrogel reticulado. Hidrogel rigidez foi encontrado para ser directamente correlacionada com a concentração de genipina com a mediana e a concentração ser de 0,01% a mais relevante (Figura 6, o tecido nativo não mostrado). Um ensaio de MTT foi utilizado para quantificar a proliferação celular e sobrevivência no hidrogel reticulado. A proliferação celular é mais elevada no hidrogel reticulado (Figura 7). Isto suporta a proliferação celular aumentada em aumento da rigidez dos outros. 12 Variando genipina tempo ou temperatura de reticulação pode resultar em diferentes graus de reticulação. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig1.jpg" /> Figura 1: Imagens dos pulmões Nós já decelularizado. Imagens de (A) Rato pulmão após decellularização e o coração removido, (B) de rato depois de Triton X-100 lavado, (C) do porco, antes de enxaguamento inicial; eles produzem ~ 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM pulmonar, respectivamente. (D) mouse pulmão e coração intacto, depois de descelularização, com a cânula ainda suturada no lugar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig2.jpg" /> Figura 2: Visão geral dos métodos. Esta é uma visão geral do método para produzir hidrogéis de pulmões. Começando com en bloc decellularization de pulmão de porco ocorre deixando o tecido branco ou translúcido única opaco que é composta de proteínas da MEC. Em seguida, depois de remover qualquer água remanescente, e aumentando a área de superfície para optimizar a digestão ácida no tecido é solubilizada. Neutralização da ACid e aumentando o sal para níveis fisiológicos cria a solução Pregel pronto para gelificação. Uma vez que a solução forma um hidrogel, a 37 ° C, a caracterização tem lugar com um reómetro de microscopia electrónica de varrimento de gel e. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig3.jpg" /> Figura 3: Representante reológico de dados para gelificação sob rampa de temperatura. Depois de uma amplitude de varrimento inicial para determinar a gama viscoelástica linear, uma rampa de temperatura foi utilizada para determinar a cinética de gelificação. Os dados são apresentados como média +/- desvio padrão. n = 4. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig4.jpg" /> Figura 4: estabilidade a longo prazo. um imidade de um hidrogel de pulmão de porco ECM armazenadas em PBS durante mais de 6 meses à temperatura ambiente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig5.jpg" /> Figura 5: Ensaio de HpuVECs metabólica. dados de proliferação MTT a partir de células endoteliais microvasculares humanas primárias (HpuVECs) cultivadas em placas de não-tratados de cultura de tecidos. Pregel solução de 1.3.3 foi adicionada às placas, refrigerado durante a noite e lavadas para formar placas revestidas de gel pré-ECM pulmão. HpuVECs mostrou maior atividade MTT em placas revestidas de ECM em comparação com não-revestido. * P &lt;0,05 em relação ao controle. Os dados são ± desvio padrão n = 3 por grupo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig6.jpg" /> Figura 6: reológico de dados para reticulação melhorada. dados de reometria de reticulação genipina. A rigidez aumenta com o aumento das concentrações de genipin para um patamar de 1% genipina. Os dados são normalizados para mostrar um aumento de vezes na reticulação com genipina. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig7.jpg" /> Figura 7; A proliferação celular em genipina reticulados Gel. dados MTT normalizados para A549s em hidrogéis reticulados genipina. O aumento da proliferação celular observada com o aumento da rigidez. p &lt;0,05 em relação ao controle. Os dados são ± desvio padrão. n = 3 por grupo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Questão </td><td> Resolução </td></tr><tr><td> / Cor-de-rosa vermelha mantidas após a descelularização </td><td> decellularization ineficaz </td><td> Começar de novo com novos pulmões </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Remover áreas de descelularização incompleta &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td></td><td> A oclusão vascular </td><td> Começar de novo com novos pulmões </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Remover áreas de descelularização incompleta </td></tr><tr><td> detritos celulares significativa retida </td><td> decellularization ineficaz </td><td> Começar de novo com novos pulmões </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Remover áreas de descelularização incompleta </td></tr><tr><td></td><td> A oclusão vascular </td><td> Começar de novo com novos pulmões </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Remover áreas de descelularização incompleta </td></tr><tr><td></td><td> atelectasia </td><td> Começar de novo com novos pulmões </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Remover áreas de descelularização incompleta </td></tr><tr><td> Destruição das membranas encontrados em amostras histológicas </td><td> Excesso de pressurização de navios durante a perfusão </td><td> Reduzir a pressão de perfusãode detergentes </td></tr><tr><td> Grande partículas permanece após a moagem </td><td> Muito material liofilizado em tubo </td><td> Reduzir o material no cilindro de moagem </td></tr><tr><td></td><td> Não moída por tempo suficiente </td><td> aumentar o tempo de moagem </td></tr><tr><td> solução Pregel não gelificação </td><td> Solução de pH demasiado elevado </td><td> Adicione pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Comece solução Pregel com pó fresco </td></tr><tr><td></td><td> Solução pH muito baixo </td><td> Adicione pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Comece solução Pregel com pó fresco </td></tr><tr><td></td><td> ECM ao longo digerido </td><td> Comece solução Pregel com pó fresco </td></tr><tr><td> As células não sobrevivem </td><td> Micróbios introduzidos após HCl digestão </td><td> Comece novamente com pó fresco e usar soluções filtradas estéreis </td></tr><tr><td></td><td> pH off </td><td> Comece solução Pregel novamente </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Adicione pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> células explodiu </td><td> Fix teor de sal em solução Pregel </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Resolução de problemas para identificar fontes de erro potencial.

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Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K visualizações.  Virginia Commonwealth University.  Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões. 

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Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Bioengenharia

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Incapaz para avaliar especificação de fenótipo celular schwann

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...