ברצוננו להודות חוות סמית&#39;פילד על תרומת רקמת הריאה החזירית ללא פגע. אנו רוצים גם להודות לד&quot;ר הו יאנג, ד&quot;ר כריסטינה טאנג והמחלקה לכירורגיה פלסטית VCU עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שלהם. דגימות הידרוג&#39;ל ורקמות הוכנו עבור SEM במחלקה לאנטומיה VCU מתקן מיקרוסקופית לנוירוביולוגיה נתמך, בין השאר, על ידי מימון NIH-NINDS מרכז Core גרנט 5 P30 NS047463 ו, בין השאר, על ידי טופס מימון גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן NIH-NCI CA016059 P30. הדמיה SEM של דגימות במתקן אפיון Core ננוטכנולוגיה VCU (NCC). עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, CMMI 1,351,162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פִּתָרוֹן </td><td> סינון סטרילי </td><td> כיווני </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> כן </td><td> DiH 2 O; סטרילי מסונן </td></tr><tr><td> פתרון 0.1% Triton X-100 </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף 100 μl טריטון-X 100 פתרון ל -100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי. </td></tr><tr><td> 2% פתרון Deoxycholate </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף פתרון נתרן Deoxycholate 2 g לכל 100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> כן </td><td> הוסף 58.44 גרם NaCl 1 ליטר של DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> פתרון DNase </td><td> כן </td><td> להוסיף 12,000יחידות DNase עד 1 L DiH 2 O; הוסף 0.156 גרם MgSO 4 (נטול מים), ו 0.222 גרם CaCl 2; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> PBS </td><td> כן </td><td> שלב 27.2 גרם Na 2 4 HPO · 7H 2 O (dibasic heptahydrate), 80 גרם NaCl, ו -2 גרם KCl עם 10 L DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; כדי להתאים את pH 7.4; סינון סטרילי </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הפתרונות הנדרשים עבור רקמות Decellularization. הפוך את הפתרונות הנ&quot;ל לתהליך decellularization. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. כ 2.5 L יהיה צורך ריאות חזיריות אחד. 1. גיבוש הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר חזירים ריאות Decellularization (עיבוד אזכור 9,10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג, ריאה חזירית נורמלית כמקשה אחת, מביית מטבחיים, עם לב vasculature ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי רקמות או אזמל כדי לנתח משם בלב, חיתוך כלי דם קרוב ככל האפשר אל הלב, כלי דם נותרים ישמשו בצעדים מאוחר יותר עבור זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את הרקמה החיבורית סביב קנה הנשימה, הסמפונות, כלי הדם באמצעות אזמל או מספריים. הערה: בדוק הריאה הטובה ביותר להשתמש למשך שארית של ההליך על ידי בחירת ריאות ללא חתכים גדולים או דקירות דרך הצדר וכמויות גדולות של תמט הריאות או חסימה בכלי הדם שעלולות לעכב את האפקטיביות של תהליך decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הריאות לא הטובות עוזב הסמפונות כפי מאוד קשור אליו קנה הנשימה ככל האפשר (לב, רקמת חיבור ואת האונות של הריאה הוסרה עלול להיות מסולק). לא צריך להיות ריאה אחת נותרים מצורפות קנה נשימת כלי הדם. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה אם תרצה בכך. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור הסמפונות מנותקים עם מהדק או תפר pbackflow העודף יימנע. </li></ol><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות decellularization ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת יד cannulated כדי להתאים את עורק הריאה, perfuse רקמת הריאה 3 פעמים עם מים די דרך הן עורק קנה נשימה ריאתי. Perfuse כלי הדם ראשון בכל פעם. בגין עם כ 1 ליטר לתוך כלי הדם ו -1.5 L לתוך קנה הנשימה עבור כל זלוף, אבל כמו פסולת הסלולר מוסר יותר נוזלי ניתן perfused דרך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמת הריאה ב Triton X-100 הפתרון למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון deoxycholate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את קטעי רקמה ב deoxycholate למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה מסוננת NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה DNase מסונן עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה 5 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משם לנתח רקמות סחוס מורגשות, קנה נשימה וכל tubules 2 מ&quot;מ או גדול בקוטר (נמצא בעיקר סביב hilum מנות המדיאלי של הריאות) מעריכת דרך נשימה, עוזבת אזורי נשימה בלבד (בפריפריה בעיקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמה לתוך 1 סעיפי אינץ או קטנים יותר. כיווניות של הרקמה לא משנה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את רקמות נוזלי במקום עודף 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה כדי להבטיח הסרה של תאים debri הסלולרהים, אם תרצה בכך. אנו משתמשים H &amp; E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrin, כחול, SDS-PAGE alcian, ו ספקטרומטריית מסה לאפיין. 9 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכסים משפופרות קפוא המכיל רקמת הריאה decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר הסינון על פתיחת צינור ומאובטח עם גומייה. הערה: Tube ותכנים עדיין צריך להיות קפוא אחרת למקם -80 ° C עד קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize הרקמה עד שכל הנוזלים העודפים נעלם, בעזרת מייבש להקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן הטחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התחילה להוסיף חנקן נוזלי כדי טחנה במקפיא כדי לקרר בידוד רכיבים פנימיים תנאי עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר בר טחנת מגנטים מצינור טחנה ולהוסיף רקמות כדי לכסות תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף בר טחן ולהוסיף רקמות ארוזות בצורה רופפת. בר הטחנה עדיין צריך לנוע בחופשיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צינור הטחנה ו- PLAce ב טחנה במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו חנקן נוזלי כדי לקו מילוי מקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפיא טחנת כל רקמות לאבקה בסדר (כ 5 דק &#39;, שיעור impaction של ~ 600 דקות -1), בתוך גליל פוליקרבונט עם impactor נירוסטה וכן אטמי סוף נירוסטה באמצעות טחנת במקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו-נקבובי היווצרות קריש (8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) (מותאם מ אזכור 9,11) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (w / v) של אבקת decellularized ו -0.1% (w / v) של פפסין 0.01 M HCl, תחת תסיסה מתמדת (אמור להיות מסוגל לראות זרימה ברמה העליונה של נוזל), בטמפרטורת החדר, עבור 48 שעות. הערה: האבקה טעונה באופן סטטי, כך הוספת HCl לאחר האבקה מעניקה את ההזדמנות לשטוף את העודף מקירות הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול של 48 שעות, במקום פתרון ריאגנטים על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות% 10 בקירור (v / v) 0.1 M NaOH, גידולד 11.11% (v / v) 10x PBS (להביא את הפתרון כולו 1x ריכוז), להביא את הפתרון חלבון מתעכל ל- pH הפיזיולוגי של 7.4. הערה: הפתרון כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. בצע קינטיקה gelation באמצעות rheometry 9 אם תרצה בכך. </li></ol></li></ol> 2. Cross-linking הידרוג כדי לשפר את חוזק מכני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות של 1%, 0.1%, ו 0.01% w / פתרון crosslinking נ genipin הוכנו על ידי המסת את הסכום הדרוש של אבקת genipin ב 10% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס כל 15 דקות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון genipin לכסות הידרוג ECM (100 μL לכל גם צלחת 96-היטב) כי הורכבו בעבר חלק 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו כל הידרוג&#39;ל ECM כדי crosslink למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הידרוג ECM 3 פעמים עם PBS עד פתרון הכביסה כבר לא כחול. הידרוג crosslinked לאחר מכן ניתן יהיה מוכן אפיון נוסף ו- CEלימודי התרבות השני של השנה. </li></ol> 3. תרבית תאים עם Microporous ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי דו מימדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בפתרון מ 1.3.3, להוסיף 20 μl של פתרון pregel היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב שאינם מטופלים רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לילה במקרר ב 4 ° C כדי לאפשר חלבון ספיחה לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב pregel הפתרון ולשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאים ממדית 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, resuspend התאים pelleted לריכוז של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​של תמיסת pregel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לוותר 16 μl של השעיה pregel תאים לבאר כל צלחת 96-היטב, כדי ליצור ~ 500 מיקרומטר הידרוג&#39;ל עבה עבור תרבית תאים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של התקשורת לראש הידרוג נוצר לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאי ממדים על ג&#39;לים קשיחות משתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, פיפטה 100 μl של פתרון pregel לבאר כל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. הערה: Cross-linking צעדים מחלק 2 ניתן להשתמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 3D Cell Culture. , (2011).</li><li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture protocols. , (2012).</li><li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material:+Structure+and+function.">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li><li>Koo, H. -. J., Lim, K. -. H., Jung, H. -. J., Park, E. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract,+geniposide+and+genipin.">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li><li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li><li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa.">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).</li><li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung:+the+matrix+reloaded.">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li><li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix.">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li><li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials:+where+we+have+been+and+where+we+are+going.">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li><li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines,+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+(Cultrex+or+Matrigel)+co-injection.">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li><li>Zhang, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel/microcapsules+scaffolds+in+vitro.">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation.">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li><li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+human+lung+stem+cells.">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li><li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+Krt5++distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration.">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אחד ההיבטים של ביולוגיה הנפרדים הוא הארגון-העצמי של מולקולות לתוך מבנים היררכיים לבצע משימה ספציפית. 13 במעבדה, הרכבה עצמית תלויה בגורמים רבים כגון ריכוז מלח, pH, ומשך העיכול. כפי שניתן לראות, נוצר הידרוג&#39;ל מתארגנת מעצמה כאשר חלבונים solubilized לחזור לטמפרטורה פיזיולוגית. הידרוג נוצר מסוגל לקדם מצורף הסלולר ושגשוגם במבחנה. תגובה תאית לאותות biophysical מ ECM לא ניתן לחקור באמצעות פולימרים. בתגובת רקמות הסלולר ספציפית אותות ביו-לא ניתן נחקרת על ידי שימוש ברקמות אחרות. חוקרים וקלינאים התחדשות מאמינים באמצעות פיגומים decellularized משפר התחדשות רקמות וריפוי פצעים. הסובל ממחלת ריאות כרונית צריכים שיפורים טיפוליים להגדיל זמינות איברים להקטין חיסוני. איברי אינטראקציות ספציפיות, התא-ECM חייבות להיותמחקר לביולוגיה איבר נוסף. ECM שימוש כמו פיגום תא לתאי ריאה הראה תוצאות עקביות. 14,15 שימוש פרוסות ריאה ממודלים חולים מעודד התחדשות מחלה 16 תאי גזע או אב, נמצאים ריאות דיסטלי, 17,18 ודורש נישות מיוחדות כדי למנוע היווצרות של teratomas. באמצעות ECM רקמות ספציפי כרכב משלוח, תופעות התחדשות של תאי אב עשויות להיות מוגברות. הידרוג ECM יוצר סביבה החלימה יותר להעריך תגובות הסלולר מטריצה ​​חוץ-תאי. גוף גדול של מחקר קיים הסתכלות נוקשות בכל הקשור איתות הסלולר. השיטה שלנו של crosslinking genipin לאפשר נוקשות התא איתות וכן אינטראקציות מרכיב התא ECM. בעוד נוקשות הידרוג&#39;ל ניתן להשפיע על ידי ECM סכום ואת היחס של חלבונים, השימוש genipin מאפשר שינויים נוקשים הידרוג&#39;ל מעט עצמאיים של תוכן ECM. התאמת genריכוז epin עשוי לאפשר כוונון מדויק של תכונות מכאניות לרוב דומה ריאות טבעיות רקמות 6. מנתונים genipin שהושגו באמצעות הידרוג מן הריאות היקפיות במחקר הנוכחי, עלייה של 15 פי (מ -5 Pa 75 Pa) צוינה. בהתבסס על נתוני rheological של רקמת ריאת עכברוש נורמלית ביופסיה אשר decellularized באמצעות אותן השיטות, אנחנו יכולים להשיג קשיחות רקמת ריאה היקפית משוערת (מידע לא מוצג) על ידי הוספת 1% genipin כדי הידרוג ריאות היקפי או הוספת 0.01% הידרוג ריאות כולו (משוער ). באמצעות ECM הריאות ההיקפי מורכב parenchyma ריאות עשויות ג&#39;ל משמעותי רך לעומת תוצאות הידרוג&#39;ל ECM הריאות כולו שפורסמו בעבר שלנו 7. לכן בנוסף genipin, בחירת אזורים ספציפיים של רקמת הריאה כדי decellularize יכול להשפיע על נוקשות באופן דרמטי. ישנן הזדמנויות לשפר שיטה זו, אשר עשויה לכלול צעדים נוספים נפוצים perfusiעל decellularization של רקמת הריאה כולה. שיטה זו נעשתה שימוש על רקמת ריאה נורמלית עשוי לדרוש שינוי עבור decellularization של ריאות חולות. אנחנו עדיין לא בחנו את התהליך הזה במדינות מחלה ספציפיות. אנו משיגים הריאות שלנו שנשלחו על קרח בן לילה מבית מטבחיים. שיטה זו יכולה להגביל את היעילות של התהליך שלנו בשל תמט ריאות או חסימה של כלי דם; עם זאת, אנו כמעט ולא צריכים להסיר תחומי ריאות שלא היה decellularized ביסודיות. כאשר קבלת רקמת הריאה טרי, היינו ממליצים לבצע את כל הפתרונות הנדרשים לפני שקיבל את הריאות כדי למנוע הפסקות שום עיבוד רקמות. מחקר קודם מצא כי באמצעות חומצה peracetic כצעד עיקור סופי מטריקס ייצור גורם פנוטיפ מקרופאג M1 רגנרציה שחדר תאים חיסוניים, 19 פוטנציאל לשיפור ההשפעות proregenerative של רקמות decellularized. מחקרים אחרים הושקעו באמצעות ודטרגנטים אחרים כדי להשלים את התהליך, אבל אלה appear להיות העדפות ספציפיות מעבדה עם בסופו של דבר אותה ההשפעה על decellularization. הליך decellularization וצעדי עיכול עשויים להיות מותאמים בהתאם ליישום הספציפי של החוקר. לדוגמה, לשנות את שיטות ג&#39;ל העיכול זמן או נטרולם עשוי לשנות את הרכב החלבון, תכונות מכניות, או קינטיקה gelation. חלופות לשיטה דנה כאן יכולות להשתנות רמת המורכבות בהתאם לתוצאות ניסוי רצויות. לדוגמה, אם המטרה היתה לשמור על קרום במרתף ללא פגע ככל האפשר, משאבה זלוף עם בקרת לחץ מוגבלת עלולה להפחית נזק המכשול. בנוסף, אם הייתה אחד התקנה במעבדה זמינה לשמור בשתי ריאות תילן מינים גדולים, תהליך decellularization עשוי לשפר את היעילות. לעומת זאת, יד שחיקה טכניקה עם ובמכתש ניתן להחיל את הרקמה lyophilized עבור מעבדות אשר אין cryomill. היינו מצפים grindin ידg לייצר שברים גדולים, הגבלת השטח הזמין עבור עיכול החומצה ולכן פעמי העיכול ייתכן שתהיינה צורך לשנות במקרה זה. חלופות אינן מוגבלות צעדי decellularization ההיווצרות של הידרוג&#39;ל. Gluteraldehyde נוצל בעבר בתור crosslinker עבור הידרוג&#39;ל, מתן חלופה אפשרית אחת להגדלת החוזק המכאני של הידרוג ביולוגי המשמש במערכות מודל. מערכות מודל אחרות כוללות ריאות decellularized שלמים כמערכת תרבות במבחנת 3D, או יותר נפוצה מסתכלות פרוסות ריאה כמודל 3D ב פיגום במבחנה. 20 כבר הזכרנו את המגבלות שמגיעות מעבודה עם פיגומי פולימר וכן פיגומי רכיב בודדים, אך אלה נשארים כפי חלופות אפשריות הנוהל שהוצג כאן. בנוסף, ישנן שיטות חלופיות לקביעת יעילות decellularization (כגון בידוד DNA), gelation (ניתן להשתמש מבחני עכירות), וכן מצורף תאהתפשטות nd (כגון שימוש CCK8). מצאנו כי השיטות שתוארו כאן הן יותר מאשר מספיק כדי לאפיין הידרוג לשימוש כמו פיגומי 3D המודל. הידרוג ECM ריאות נתאר כאן לספק פלטפורמה יעילה ללימוד אינטראקציות תא-ECM. פתרון pregel בעלת פוטנציאל כמו ציפוי עבור ספקי סמי פולימר, בסיוע משלוח בתאי גזע mesenchymal, או כפלטפורמת משלוח סמים על ידי עצמו. הפרוטוקול המובא בזאת מספק את הצעדים הבסיסיים ליצירת הידרוג&#39;ל צדדי נגזר ECM ריאות.

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6. 
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research. 
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td style="width:371px;">Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Genipin</td>
			<td style="width:135px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">078-03021</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10x</td>
			<td style="width:135px;">Quality Biological</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>45000-448</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">8519</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand pump</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-239-1</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graduate Beaker</td>
			<td style="width:135px;">VitLab</td>
			<td align="right" style="width:119px;">445941</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomill</td>
			<td>SPEX</td>
			<td>6700</td>
			<td>Use cryogloves and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lyophilizer</td>
			<td>FTS FlexiDry</td>
			<td></td>
			<td>Use gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rheometer</td>
			<td>Discovery</td>
			<td>HR-2</td>
			<td>Use gloves and eye protection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tunable hydrogels from pulmonary extracellular matrix for 3d cell culture

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הידרוג תרבות רכיב תאים מרובה עבור תרבית תאי ריאות במבחנה. החל רקמת ריאה בריאה כמקשה אחת מן חזירי, חולדה או עכבר, הרקמה perfused ו שקוע דטרגנטים כימיים הבאים כדי להסיר את פסולת הסלולר. השוואת היסטולוגית של הרקמה לפני ואחרי עיבוד מאשרת הסרה מעל 95% של מכתים galactosidase דנ&quot;א אלפא גדילים כפול מרמזת רוב פסולת הסלולר מוסר. לאחר decellularization, הרקמה lyophilized ואז cryomilled לאבקה. אבקת מטריקס מתעכלת במשך 48 שעות בתמיסת עיכול פפסין חומצי ולאחר מכן לנטרל כדי ליצור את פתרון pregel. Gelation של פתרון pregel יכול להיגרם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש מייד הנטרול הבא או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. ציפוי יכול להיווצר באמצעות הפתרון pregel על צלחת שאינם מטופלים עבור גמצורף ell. תאים יכולים להיות תלוי pregel לפני הרכבה עצמית כדי להשיג תרבות 3D, מצופה על פני השטח של ג&#39;ל נוצר שממנו התאים יכולים להעביר דרך הפיגום, או מצופים על הציפויים. שינויים אל המתווה שהוצג יכול להשפיע טמפרטורה gelation, כוח, או בגדלים מקטעי חלבון. מעבר היווצרות הידרוג&#39;ל, נוקשות הידרוג&#39;ל ניתן להעלות באמצעות genipin.

באמצעות שיטה זו, הפקנו הידרוג מן החזיר רגיל, חולדה, וריאות עכבר (איור 1). ריאות מעובד לספק מוערכת של 5 מ&quot;ג, 40 מ&quot;ג, ו -10 גרם של אבקת ECM בהתאמה. סקירה כללית של התהליך מוצג באיור 2. חזותי מפתח בתהליך כולל: מראה לבן של הריאות אחרי שטיפת deoxycholate; לאחר היווצרות pregel, הפתרון צריך להיות אטום הפתרון אמור להופיע הומוגנית במשך חודשים אם מאוחסן ב 4 ° C.. כללנו שולחן תקלות בסיסי שיעזרו לזהות מקורות השגיאה לאורך כל התהליך (טבלה 2). לאחר gelling, הידרוג ניתן להשתמש מיד או מאוחסן לשימוש עתידי. בדיקות ראולוגיות מאשרות כי למעלה מ 90% של gelling מתרחשים בדקות הראשונות לאחר שהגיע 37 ° C (איור 3). הידרוג נוצר יציב במשך תקופות ארוכות PBS, אבל מצורף תא proliferation עשוי להשתנות (איור 4). בעוד פרוטוקול זה נכתב עבור ריאות חזיריות, מגבלות מקום להגביל אותנו להשתמש רק ריאה אחת כאשר decellularizing ריאות חזיר. השתמשנו באותו הליך עם שינוי מזערי decellularize בשתי הריאות עבור מינים אחרים. לחולדות ועכברים, הריאות יכולות להיות שלמות שמאל והלב מצורף, אבל רקמת החיבור עדיין יש להסיר עם אזמל או מספריים. אנחנו שומרים בלב שלם המצורפת לחולדות ועכברים perfuse הפתרונות דרך החדר הימני במקום עורק הריאה. זלוף של קנה הנשימה הוא עדיין אותו; עם זאת, את הצינורית ניתן לצורך איחוי בתוך קנה הנשימה כדי להקל על הגישה עבור מינים קטנים יותר. הוספנו סוגי תאים מרובים, אדם בתאי גזע mesenchymal, 9 תאי גזע עכבר mesenchymal, שורות תאים אנושיות אפיתל (A549s), אנדו כלי דם העיקרי אדםתאים thelial (HpuVECs), ותאי אפיתל וריד אדם הטבור (HUVECs) בתוך ועל פני השטח של הידרוג ECM ריאות. לא נתקלנו בבעיות בנוגע לאופי xenogenic של הג&#39;לים נוצר. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה הפחתה משמעותית-galactosidase α ב הידרוג החזירי. 9 הפתרון מראש ג&#39;ל עשוי לשמש גם כציפוי על 4 מעלות צלזיוס כדי לשפר מצורף התא. הפתרון pregel משפר מצורף HpuVEC ושגשוגם כאשר הוסיף ריאות ECM מצופה צלחות בתרבית רקמה. בארות מצופות להפגין שיפור משמעותי מצורפות הסלולר לעומת בארות שאינם מטופלים (איור 5). הוספת genipin מגביר crosslinking הידרוג&#39;ל. crosslinking המוגברת זו עשויה לספק קשיחות רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית, תוך שהיא מפחיתה שפלה של ECM. הקיטון שפל, אם כי קטין במבחנה, עלול להתרחש בשל מליטה גדלה ביןחלבונים ולכן התנגדות יותר שיפוץ ECM על ידי תאים. השתמשנו מטאטא תדירות על rheometer למדוד את התכונות המכאניות של הידרוג&#39;ל crosslinked. קשיחות הידרוג&#39;ל נמצאה בקורלציה ישירות genipin ריכוז עם החציון ולהיות ריכוז הרלוונטי ביותר 0.01% (איור 6, רקמות ילידים לא מוצגות). ב assay MTT שימש לכמת תא התפשטות והישרדות על הידרוג&#39;ל crosslinked. התפשטות תאים גבוהה על הידרוג&#39;ל crosslinked (איור 7). זו תומכת התפשטות תאים מוגברת על קשיחות מוגברת מאחרים. 12 משתנה genipin crosslinking בזמן או בטמפרטורה עלול לגרום מעלות crosslinking שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig1.jpg" /> איור 1: תמונות של ריאות אנחנו האם decellularized. תמונות מ- (A) עכבר ריאות לאחר decellularization ולב מוסר, (ב) חולדה לאחר טריטון X-100 שטוף משם, (C) חזיר, לפני שטיפה ראשונית; הם להניב ~ 5 מ&quot;ג, 40 מ&quot;ג, ו -10 גרם של ריאות ECM, בהתאמה. (ד) עכבר ריאות ולב שלם, לאחר decellularization, עם צינורית עדיין לצורך איחוי במקום. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig2.jpg" /> איור 2: סקירה כללית של שיטות. זוהי סקירה של השיטה לייצר הידרוג מהריאות. החל en decellularization ריאות חזיר הגוש מתרחש עוזב רקמות לבנות או שקופות אטום היחיד מורכבת של חלבוני ECM. אז לאחר הסרת כל מים נותרים, והגדלת שטח הפנים כדי לייעל את עיכול חומצת הרקמה solubilized. ניטרול של acid והגדיל המלח לרמות פיסיולוגיות יוצרת פתרון pregel המוכן gelation. לאחר הפתרון יוצר הידרוג&#39;ל על 37 מעלות צלזיוס, אפיון מתרחש עם במיקרוסקופ אלקטרוני ג&#39;ל rheometer וסריקה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig3.jpg" /> איור 3: נציג ראולוגיות נתונים עבור gelation תחת ramping טמפרטורה. לאחר לטאטא משרעת ראשונית לקבוע טווח viscoelastic ליניארי, רמפת טמפרטורה שמשה כדי לקבוע קינטיקה gelation. הנתונים מוצגים כממוצע +/- סטיית התקן. n = 4. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig4.jpg" /> איור 4: יציבות לטווח ארוך. הודעה מיידיתגיל של הידרוג&#39;ל ECM ריאות חזיר מאוחסן PBS במשך 6 חודשים בטמפרטורת החדר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig5.jpg" /> איור 5: Metabolic Assay של HpuVECs. נתוני התפשטות MTT מתאי אנדותל העיקריים כלי דם אנושיים (HpuVECs) גדלו על צלחות תרבית רקמה שאינן מטופלים. פתרון Pregel מ 1.3.3 התווסף צלחות, בקירור למשך הלילה ושטף כדי ליצור צלחות ריאות מראש ג&#39;ל מצופות ECM. HpuVECs הראה פעילות MTT גבוהה על צלחות מצופות ECM בהשוואה ללא-מצופה. * P &lt;0.05 לעומת שליטה. הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן n = 3 לכל קבוצה. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig6.jpg" /> איור 6: ראולוגיות נתונים עבור Crosslinking משופרת. נתוני Rheometry עבור crosslinking genipin. העליות הנוקשות עם ריכוזי מוגבר GENIלהצמיד רמה ב -1% genipin. הנתונים מנורמלים מצביע על עלייה של פי crosslinking עם genipin. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig7.jpg" /> איור 7; התפשטות תאים על ג&#39;לים Genipin Crosslinked. נתוני MTT מנורמלים עבור A549s על הידרוג crosslinked genipin. התפשטות תאים מוגברת לראות עם קשיחות מוגברת. p &lt;0.05 לעומת שליטה. הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן. n = 3 לכל קבוצה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בְּעָיָה </td><td> נושא </td><td> רזולוציה </td></tr><tr><td> צבע אדום / ורוד נשמר לאחר decellularization </td><td> decellularization יעיל </td><td> התחל מחדש עם ריאות חדשות </td></tr><tr><td></td><td></td><td> סר תחום decellularization השלם &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td></td><td> חסימה של כלי דם </td><td> התחל מחדש עם ריאות חדשות </td></tr><tr><td></td><td></td><td> סר תחומים decellularization השלם </td></tr><tr><td> פסולת הסלולר משמעותית שמר </td><td> decellularization יעיל </td><td> התחל מחדש עם ריאות חדשות </td></tr><tr><td></td><td></td><td> סר תחומים decellularization השלם </td></tr><tr><td></td><td> חסימה של כלי דם </td><td> התחל מחדש עם ריאות חדשות </td></tr><tr><td></td><td></td><td> סר תחומים decellularization השלם </td></tr><tr><td></td><td> תמט ריאות </td><td> התחל מחדש עם ריאות חדשות </td></tr><tr><td></td><td></td><td> סר תחומים decellularization השלם </td></tr><tr><td> הרס של ממברנות שנמצאו בדגימות היסטולוגית </td><td> שמירת לחץ-Over של כלי במהלך זלוף </td><td> להפחית לחץ זלוףדטרגנטים </td></tr><tr><td> חלקיקים גדולים נשארו לאחר טחינה </td><td> חומר lyophilized מדי בצינור </td><td> מנמיכים חומר שחיקה גליל </td></tr><tr><td></td><td> לא הסתובבתי במשך זמן מספיק </td><td> להגדיל את זמן הטחינה </td></tr><tr><td> פתרון Pregel לא gelling </td><td> pH פתרון גבוה מדי </td><td> הפוך 7.4 pH </td></tr><tr><td></td><td></td><td> בגין פתרון pregel עם אבקה טריה </td></tr><tr><td></td><td> pH פתרון נמוך מדי </td><td> הפוך 7.4 pH </td></tr><tr><td></td><td></td><td> בגין פתרון pregel עם אבקה טריה </td></tr><tr><td></td><td> ECM מעל מתעכל </td><td> בגין פתרון pregel עם אבקה טריה </td></tr><tr><td> תאים אינם שורדים </td><td> חיידקים הציגו לאחר עיכול HCl </td><td> להתחיל מחדש עם אבקה טריה ולהשתמש בפתרונות סינון סטרילי </td></tr><tr><td></td><td> pH off </td><td> בגין פתרון pregel שוב </td></tr><tr><td></td><td></td><td> הפוך 7.4 pH </td></tr><tr><td></td><td> תאי פרץ </td><td> תקן תוכן מלח בתמיסה pregel </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פתרון בעיות כדי לזהות מקורות של שגיאה פוטנציאלית.

Watch this Scientific Journal Video about Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture at JoVE.com

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K Views.  Virginia Commonwealth University.  זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים. 

Video: Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...