The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Todos os experimentos, incluindo seres humanos foram aprovados pelo comitê de ética local (aprovação no. 3/2/14). Para a escolha dos pacientes deve-se notar que diversos fatores, tais como idade, sexo, regimes terapêuticos atuais e muitos mais podem influenciar a composição MV no sangue e, portanto, devem ser levados em consideração antes da coleta da amostra 22,23. 1. Preparação de amostras de plasma <ol><li> Desenhe 1 - 2 tubos de sangue por doador, através de uma agulha de borboleta de calibre 21 em um tubo vacutainer colheita de sangue contendo EDTA (1,6 mg / mL de sangue). Certifique-se de inverter o tubo (s) várias vezes para garantir anticoagulação sangue eficiente. NOTA: O volume recomendado de sangue por citometria de fluxo e posterior análise de Western Blot é de 5 - 15 mL. A fim de evitar a degradação e perda de MV, as amostras de sangue deverão ser manuseados &lt;30 min após a retirada do sangue. </li><li> Preparar as amostras de plasma por centrifugação das amostras durante 15 minutos a 1200 xg àtemperatura ambiente (RT). </li><li> Aplicar um filtro de válvula, a fim de ajudar a separação de plasma (= camada superior) do restante células do sangue (= camada inferior). </li><li> Transfira o plasma para um tubo de 15 mL. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1500 xg, temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares e maiores remover plaquetas remanescentes. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 15 ml e proceder diretamente com amostras de isolamento ou de loja MV para até 6 meses a -20 ° C. NOTA: O protocolo apresentado também pode ser usado para isolar e (MVs Exos) a partir de sobrenadantes de cultura de células. A fim de fazer isso, cultivar as células a 60 - 80% de confluência, durante 24 - 48 h em meio de cultura suplementado com FCS a depleção de vesícula, e em seguida, recolher o sobrenadante. Centrifugar durante 5 minutos a 750 xg, a 4 ° C para destruir as células flutuantes residuais, encher o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e centrifugar de novo durante 5 min a 1500 xg, 4 ° C para sedimentar os detritos celulares maior. Este sobrenadante pode então ser usado para o isolamento de MVstal como descrito no Passo 2,1-2,16. </li></ol> 2. Isolamento de MVs <ol><li> Transfira a amostra de plasma num tubo de centrifugação adequado. Se necessário, encher tubo com PBS, a fim de diluir a amostra e evitar o colapso de tubos de paredes finas durante o processo de centrifugação. </li><li> Centrifugar durante 35 minutos a 14000 xg, 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante, mantenha tubos virou de cabeça para baixo e coloque sobre uma toalha de papel. Espera 3-5 minutos até que todo o restante sobrenadante foi embebido na toalha e assim removido a partir da amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento em MV 1000 ul de PBS, transferido para um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se durante 35 min a 14000 xg, a 4 ° C numa centrífuga de mesa. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento MV em 50-500 ul de PBS, dependendo do tamanho do pelete. Alternativamente, lisam MVs directamente, por exemplo, em tampão de RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-desoxicolato / 1% de Triton X-100 / Tris 50 mM, pH 7,2)para análise de Western Blot subsequente. MVs armazenar a -20 ° C. Eles vão permanecer estável durante vários meses, mas evitar congelamento e descongelamento ciclos repetidos. </li><li> Opcional: Determinar a concentração de proteína MV com um ensaio de proteína (por exemplo, Bradford ou método de Lowry), a fim de avaliar o rendimento mV ou dosear MVS para experiências subsequentes. </li><li> Se Exos adicionais são para ser isolado a partir das amostras de plasma, decanta-se o sobrenadante a partir do passo 2.3 para um tubo de ultracentrifugação e centrifuga-se durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C. Decantar o sobrenadante tal como descrito no passo 2.3, ressuspender Exo sedimento em 1000 uL de PBS e transferir para pequenas (1,5 ml) tubos de ultracentrifugação. <ol><li> Ultracentrífuga durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C, o sobrenadante aspirado e ressuspender o pellet em Exo 50-75 ul de PBS ou tampão RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização de MVs por citometria de fluxo <ol><li> Transferir 15 uL de PBS + 1% de soro fetal de vitelo empobrecido de vesículas (FCS) num tubo de citometria de fluxo. NOTA: vesículas com FCS empobrecido é preparado por centrifugação inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de FCS durante 18 h a 110000 xg e filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 um, tal como descrito anteriormente 24. </li><li> Adicionam-se 5 ug (em caso de baixos rendimentos 3 ig), são igualmente aplicáveis ​​de MVs em PBS. </li><li> Incubar as amostras durante 30 min à temperatura ambiente, a fim de bloquear os sítios de ligação não específicos na superfície de MV e, assim, reduzir a coloração de fundo. </li><li> Adicionar um anticorpo marcado por fluorescência contra o interesse da proteína-de-. Titula-se a quantidade de anticorpo utilizada para a mancha, antes da utilização, a fim de determinar a concentração óptima e garantir uma ração baixo sinal-para-ruído. Certifique-se também incluir um tubo com MVs não coradas como controlo negativo e um tubo de MVs coradas com o anticorpo de controlo de isotipo correspondente à mesma concentração (por exemplo, se 1 ug de anticorpo é utilizado, também utilizar um ug do um controlo de isotipotibody) para quantificar a coloração de fundo. NOTA: Também é possível realizar fluxo multicolor citometria adicionando vários anticorpos acoplados a diferentes fluorocromos. </li><li> Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 250 mL PBS e proceder com a medição da amostra usando um citômetro de fluxo. <ol><li> No caso de amostras que não pode ser medida de imediato, adicionar 150 ul de PBS e 50 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as amostras e armazenar a 4 ° C. CUIDADO: PFA é tóxico. Use luvas e equipamento de protecção individual adequado. </li></ol></li><li> Reduzir o limiar do citômetro de fluxo para o valor mais baixo possível e procurar a população MV usando uma dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) enredo em escala logarítmica. Porta na população MV e avaliar o sinal de fluorescência em um histograma correspondente. </li></ol> 4. Caracterização de MVs por Western Blotting <ol><li> Ressuspender o sedimento em MV directamenteum tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). <ol><li> No caso de o sedimento MV já foi ressuspenso em PBS, diluir, pelo menos, 1: 1 num tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). </li></ol></li><li> Determinar a concentração de proteína da amostra MV, por exemplo, por ensaio de Lowry. </li><li> Preparar 10-20 ug de MVs em 22,5 ul de tampão RIPA. Em seguida, adicionar 7,5 mL de 4x tampão de carga Laemmli e calor durante 5 minutos a 95 ° C. </li><li> Carregar as amostras sobre um gel de poliacrilamida e realizar electroforese e imunotransf erência de acordo com protocolos padrão. </li><li> Depois de transferir as proteínas para a membrana, realizar uma coloração de Ponceau como um controlo de carregamento de acordo com protocolos padrão. </li><li> membrana Destain em TBST durante 5 min à TA. </li><li> Bloco de membrana durante 30 min até 1 h, à RT, em 5% de BSA em TBST. </li><li> Incubar membrana com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite ou durante 2 h à TA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubar membrana com o anticorpo secundário acoplado a HRP a uma diluição de 1: 10000 em BSA a 5%. Nota: Em caso de sinais de alta fundo, use leite em pó em vez de BSA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3x 5 minutos. </li><li> Desenvolver membrana com um reagente de detecção ECL e detecção de sinais de quimioluminescência em filmes ou um sistema de imagem de quimioluminescência. NOTA: No fim de discriminar MVs de Exos, proteínas como Tubulin, actinina-4 ou mitofilin pode ser usado que deve ser, sobretudo, presente no MVs 16,25. Prestar atenção que os anticorpos mais tetraspaninas (por exemplo, CD9, CD81), utilizados como marcadores para Exos, não funcionam sob condições redutoras e deve, portanto, ser preparados em tampão não redutor de carga seguido por aquecimento durante 10 min a 70 ° C. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Estudos recentes sobre EVs no sangue demonstraram que a composição e as contagens EV mudar durante a causa de várias doenças. Portanto, a análise e posterior caracterização destas EVs são de grande interesse para avaliar melhor a sua utilização potencial como biomarcadores da doença para diagnóstico e prognóstico ou para avaliar as respostas de terapia. O protocolo apresentamos aqui permite o isolamento de vesículas com um diâmetro de até 600 nm, que não contêm quaisquer organelos celulares. Estas observações estão em consonância com a actual definição de MVs e excluir a presença de corpos apoptóticos 2. Usando a técnica Western Blot, fomos capazes de demonstrar que as MVs isolados mostram uma elevada expressão da tubulina, enquanto que os tetraspanins CD9 e CD81 que são frequentemente usados ​​como marcadores Exo foram apenas ligeiramente expressa. Isto confirma que MVs diferem de Exos e se encaixa a recente caracterização em profundidade e comparação de ambas as populações EV por proteômica 25. conteúdo &quot;&gt; Durante a aquisição de amostras de sangue, é crítico para manter o tempo entre a punção venosa e preparação plasma tão curto quanto possível, a fim de evitar a degradação do MV. Além disso, o armazenamento prolongado de amostras de sangue pode levar à activação de células de sangue causando reforçada MV derramamento e, finalmente, a apoptose, que resulta na libertação de corpos apoptóticos. Outra consideração importante para o isolamento MV é para evitar contaminações de preparações MV com proteínas do plasma ou Exos menores. Portanto, é essencial para remover tanto do sobrenadante quanto possível depois de girar para baixo MVS a 14000 x g. uma vez que o sedimento é normalmente visível e firmemente fixado à parede do tubo, o sobrenadante pode ser facilmente removido com uma ponta de pipeta. Em contraste com Exos que tendem a formar agregados durante a preparação por ultracentrifugação alta velocidade e são muitas vezes difíceis para voltar a suspender, este problema não ocorre com MVs. Nosso estudo mostra que é possible para caracterizar subpopulações MV presentes no sangue por citometria de fluxo. Embora o limite de detecção da maioria dos citómetros de fluxo é de cerca de 200-300 nm, o MVS foram reprodutivelmente medido no dador, bem como amostras de cultura de células com os mesmos parâmetros de análise e portões que permitiram claramente a sua distinção de sinais de fundo. É importante verificar antes das medições que o PBS usado para as análises não contém quaisquer partículas contaminantes que poderiam causar um fundo elevado durante a citometria de fluxo (Figura 3). Embora alguns MVs menores não pode ser capturado numa abordagem por citometria de fluxo, verificou-MVs de todas as principais populações de células do sangue (por exemplo, plaquetas, glóbulos vermelhos, leucócitos, células endoteliais). Em nossas análises usamos marcadores padrão para as diferentes células do sangue que tenham sido previamente encontrados no MVS 26 - 29. Deve notar-se que, a fim de obter os melhores resultados possíveis por citometria de fluxo, tele quantidade e a concentração de todos os anticorpos devem ser tituladas numa amostra MV expressando o antigénio de interesse. Se subpopulações MV específicos no sangue devem ser identificados com maior especificidade, é possível realizar a coloração dupla contra dois antigénios diferentes presentes nos respectivos MVs e considerar apenas todas as MVs duplamente positivas para posterior análise 23. Atualmente, existem esforços para definir uma escala padrão de subpopulações de MT no sangue de indivíduos saudáveis 23,30. Estes estudos já demonstraram que MVs derivados de plaquetas constituem a maior população de MVs no sangue que está em correspondência com as nossas observações. Uma vantagem da citometria de fluxo para caracterizar amostras de MT é que este método já está bem estabelecida para fins de diagnóstico, na maioria dos centros clínicos que permitam o possível uso de MVs como biomarcadores no diagnóstico clínico diárias. Estudos anteriores sobre EVs no sangue que têm na sua maioria focoed em Exos menores, dependem tanto procedimentos de classificação específicos para analisar selectivamente a população alvo desejado Exo 31,32 ou requerem um (2 dias) Processo de isolamento demorado com acoplamento de Exos a pérolas de látex antes da análise 18. As nossas próprias observações não publicadas sugerem que a análise de citometria de fluxo de MVs de preparações de sangue inteiro mesmo permite a detecção de MVs como MVs derivadas de tumor sem qualquer desses processos de selecção. Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite o isolamento rápido de MVs a partir de amostras de sangue periférico com equipamentos de laboratório padrão e sua qualificação ulterior por citometria de fluxo e Western Blotting. Todo o processo pode ser realizado em cerca de 2 h, o que vai facilitar futuros estudos sobre perfis de MT em sangue de pacientes que são necessárias para avaliar o potencial de MVs como biomarcadores da doença.

Nos últimos anos, muitos estudos in vitro têm demonstrado que vesículas extracelulares (VE) desempenham um papel importante na comunicação intercelular. As células vivas constantemente eliminado vesículas que diferem em tamanho, conteúdo e biogênese. Os EVs melhor estudados são exosomes que se originam a partir do sistema endossomal onde eles são armazenados como vesículas intraluminais em corpos multivesiculares. Uma vez que esta última se fundem com a membrana plasmática, as vesículas contidos são libertados como exossomas (Exos, diâmetro de 30-100 nm 1). A segunda população de EV que ganha cada vez mais atenção nos últimos anos, são grandes microvesículas (MVs, diâmetro de 100 - 1.000 nm), que brotam diretamente da membrana plasmática 2. Ambos os tipos de vesículas estão rodeados por uma bicamada lipídica e contêm ácidos nucleicos, por exemplo, ADN, ARNm ou miARN 3-5, e uma variedade de proteínas que se podem transferir para C vizinhaells. Embora, em geral, a composição de proteína das vesículas reflecte o estado de uma célula de origem, algumas proteínas parecem ser selectivamente orientadas e enriquecido em VE 1. Uma grande interesse de pesquisa é caracterizar EVs de células anormais e doentes, a fim de definir assinaturas EV específicas que possam permitir o uso de EVs como novos biomarcadores. Especialmente no cancro, em que muitas vezes o próprio tumor não é facilmente acessível, biópsias líquidos segmentação VE específicos de tumores no sangue pode permitir a monitoração das respostas terapia ou ajudar a caracterização do tumor primário, sem a necessidade de procedimentos invasivos 6. Na verdade, EVs já foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais, incluindo urina 7, 8 CSF, o leite materno 9 ou sangue 10. Vários estudos identificaram alterações nas contagens de EV e composição em diferentes doenças humanas. Por exemplo, em pacientes com sepsia o número de MVs pró-coagulante éaumentou significativamente em comparação com indivíduos saudáveis 11. Também em pacientes com malária cerebral grave um aumento no total de MVs no sangue pode ser observada e contagens de MVs derivados de plaquetas correlacionar com profundidade coma e trombocitopenia 12. Outros estudos relatam números elevados de vesículas derivados do endotélio em doentes com lúpus eritematoso sistémico ou insuficiência cardíaca e, no caso deste último, esta está correlacionada com uma maior probabilidade de eventos cardiovasculares 13,14. Especialmente no câncer, EVs no sangue estão atualmente discutido como novos biomarcadores com valor diagnóstico e prognóstico. Níveis de MVs que expressam proteínas associadas a tumores, tais como MUC-1, EGFR ou FAK parecem ser elevados no sangue de doentes com cancro da mama 15,16. Também para Exos, estudos recentes têm mostrado que Exos derivados do sangue que transportam antígenos específicos do tumor, como glipicano-1 para câncer de pâncreas ou Del-1 para o cancro da mama permitir cedo a doença deproteção com alta especificidade e sensibilidade 17,18. Adicionalmente, o tumor derivada de soro Exos pode conter ADN que pode ser utilizado para a detecção de mutações, tais como KRAS e p53 que sugere a sua utilização para a terapia de previsão 19. Avanços recentes têm mostrado que a análise de Exos no sangue de pacientes com glioblastoma utilizando um chip de microfluidos específica permite a monitorização da terapia 20. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a análise de subpopulações de doenças específicas de vesículas dá informações preciosas sobre diagnóstico, prognóstico, bem como as opções terapêuticas e sucesso. No entanto, o isolamento e análise de Exos de sangue é morosa, requer equipamento especial de laboratório e, por conseguinte, ainda não é adequado para o diagnóstico clínico de rotina. Em contraste, o MVS pode ser isolado muito mais rapidamente e, devido ao seu grande tamanho, podem ser facilmente analisadas por citometria de fluxo, sem a necessidade de associá-los a esferas de látex, uma vez que é necessário para Exos 18, 21. Assim, aqui se apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o isolamento de MVs padronizado a partir de amostras de sangue e a subsequente caracterização de sub-populações de MT por citometria de fluxo. Este protocolo irá permitir o estudo adicional e caracterização em profundidade de perfis de MT em grandes grupos de pacientes que serão necessários, a fim de utilizar MVS para diagnósticos clínicos diárias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

A liberação de vesículas extracelulares (SVE), incluindo as pequenas exossomos-endossomal (Exos, diâmetro &lt;100 nm) e microvesículas derivados de membrana grande de plasma (MVs, diâmetro&gt; 100 nm) é um processo celular fundamental que ocorre em todas as células vivas. Estas proteínas de transporte de vesículas, lípidos e ácidos nucleicos específicas para a sua célula de origem e em estudos in vitro em destaque a sua importância como mediadores de comunicação intercelular. VE foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais e, especialmente, os VE no sangue foram identificados como promissores biomarcadores para cancro ou doenças infecciosas. A fim de permitir o estudo de subpopulações MV no sangue, apresentamos um protocolo normalizado para o isolamento e caracterização de MVs a partir de amostras de sangue periférico. MVS são sedimentadas a partir de amostras de plasma anticoagulado com EDTA por centrifugação diferencial e, tipicamente, possuem um diâmetro de 100-600 nm. Devido ao seu tamanho maior, eles podemfacilmente ser estudada por citometria de fluxo, uma técnica que é utilizada rotineiramente em diagnósticos clínicos e está disponível na maior parte dos laboratórios. Vários exemplos de ensaios para as MVs isolado de controlo de qualidade vai ser dada e marcadores que podem ser utilizados para a discriminação de diferentes subpopulações de MT no sangue vai ser apresentado.

A fim de quantificar o rendimento de MVs que podem ser isolados seguindo o protocolo descrito, calculou-se a quantidade de MVs isoladas a partir de amostras de sangue de 10 dadores. O rendimento MV, que foi avaliada num ensaio de proteínas de Lowry, variou de 10 até 30 ^ g, com uma média de 19,2 ug MVs por mL de sangue (Tabela 1). A concentração de partículas determinado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) variou de 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 com uma média de 5,9 x 10 9 partículas por ml amostra de plasma (Tabela 2). Além disso caracterização das MVs por microscopia eletrônica de transmissão revelou uma população de vesículas com um diâmetro&gt; 100 nm que foram cercados por uma bicamada lipídica e não contêm quaisquer organelos celulares (Figura 1A). NTA confirmou que o tamanho das MVs isolados variou de 100 a 600 nm (Figura 1B) e o tamanho médio foi de 201 MVnm (Figura 1C). A coloração para marcadores típicos de MT e Exo por Western Blotting demonstrado que as MVs isoladas foram positivas para a tubulina e mostrou apenas uma ligeira expressão de CD81 e CD9, enquanto Exos foram negativos para a tubulina e enriquecido em CD9 e CD81 (Figura 2). Análise dos MVs isoladas por citometria de fluxo (Figura 3A) revelaram uma população de vesículas definidas que poderia ser fechado usando os mesmos parâmetros normalmente utilizados para MVS isolados a partir de sobrenadantes de cultura de células e que foi claramente diferente da do sinal de fundo obtido pela medida de PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem a adição de MVs (Figura 3B). De modo a analisar as diferentes populações MV presentes no sangue, o MVS foram coradas com marcadores estabelecidos para as diferentes populações de células do sangue, por exemplo, CD62P para MVS derivados de plaquetas, CD45 para MVS derivados de leucócitos, para CD235aMVs e CD62E sangue vermelho de células-derivadas para MVS derivadas de células endoteliais (Figura 4). Esta caracterização mostrou que a percentagem de subpopulações MV diferiu entre as amostras de sangue do dador investigados, enquanto a maioria de MVs parecia ser derramado por plaquetas em todas as amostras. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Distribuição do Tamanho de MVs isoladas do sangue periférico. A, isolados MVs foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão. B, análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) de MVs que ilustram a distribuição de tamanhos das vesículas. C, O tamanho médio MV a partir de 10 preparações independentes foi medida por NTA (média). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver al</a>versão Arger desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterização de MVs isolado por Western Blotting. a expressão da proteína diferencial nas MVs isoladas e Exos de dois doadores foi visualizado por Western Blot. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Análise de MVs por citometria de fluxo. A, MVs são primeiro visualizadas em frente (FSC) versus espalhamento lateral parcelas (SSC) para a porta na respectiva população MV. Subsequentemente, estes são caracterizados MVs para o antigénio de interesse pela<html> utilizando anticorpos marcados com fluorescência dirigidos contra o antigénio. B, o FSC SSC típica contra parcelas para MVS isoladas a partir do plasma de dois dadores. Como comparação, um lote típico para MVS derivadas de células de tumor a partir de células de cancro do pulmão A549, isolado a partir do sobrenadante de cultura de células, bem como um controlo negativo utilizando apenas PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem MVS são mostradas à direita. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterização de MVs isolado por citometria de fluxo. MVs de três dadores foram caracterizadas para a expressão de marcadores de células de sangue vermelhas estabelecidos (), por citometria de fluxo. Os respectivos controlos isotípicos são mostradas em cinza.https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de sangue [g] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29,4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31,1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22,7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18,7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11,9 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: rendimento de proteína de MV amostras de sangue periférico. </strong&gt; É mostrada a quantidade de MVs por sangue periférico mL que foi elaborada a partir de 10 doadores. MV rendimentos foram quantificados por ensaio de Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de plasma [contagem de partículas] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: MV Rendimento de partículas a partir de amostras de sangue periférico. </stRong&gt; MV foram isolados a partir de amostras de plasma de 10 doadores e contagens de partículas foram determinadas por análise de rastreamento de nanopartículas. É mostrado o valor médio de três medidas independentes.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K visualizações.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Geração e cultura de sangue Conseqüência células endoteliais do sangue periférico humano

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

Isolamento de neutrófilos humanos de whole blood e buffy coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...