Name: surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis at JoVE.com

Os autores agradecem a Jo Hill por assistência de histopatologia, o Dr. John Gleysteen para instrução em técnica cirúrgica, Tessa Diebel para assistência em videografia, todos os membros dos laboratórios de Wong e Coussens para insights críticos e discussões, e OHSU Knight Cancer Institute para apoio financeiro. Os autores reconhecem o apoio de T32GM071388-10 e T32CA106195-11 para CEG, o NCI / NIH, o Departamento de Defesa do Programa de Pesquisa sobre o Câncer de Mama, a Fundação Susan G Komen, a Fundação de Pesquisa sobre o Câncer de Mama e uma Fundação Stand Up To Cancer - Lustgarten Subvenção de Pesquisa Translacional da Equipe de Sonhos de Convergência de Câncer de Pâncreas (SU2C-AACR-DT14-14) para a LMC, um Prêmio da Fundação de Doação Feminina da MHW e o Centro Brenden-Colson para Saúde do Pâncreas para MHW e LMC.

Os animais utilizados no seguinte protocolo são cobertos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Saúde e Ciência da Oregon (IACUC), que é projetado para ser compatível com os regulamentos da Lei de Bem-Estar Animal e com a Política do Serviço de Saúde Pública (PHS). Manutenção de condições estéreis: instrumentos esterilizados devem ser utilizados e entre ratos, devem ser limpos com gaze estéril, enxaguados em PBS, seguido de esterilização com desinfectante a 70% de etanol durante pelo menos 15 minutos. Uma gola cirúrgica, uma faca, vestido e luvas devem ser usadas para cirurgias de sobrevivência. A preparação pré-operatória do animal para cirurgias de sobrevivência está incluída no seguinte protocolo. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes e equipamentos. 1. Isolamento e preparação de suspensões monocelulares de tumores mamários primários <ol><li> Anestesiar os ratinhos transgênicos MMTV-PyMT (FVB / n) transgênicos de 100 dias do sexo doador e manter sob cSedação ontinuosa administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia. Confirme se o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente. </li><li> Em um ambiente estéril, resectam tumores mamários primários de ratos MMTV-PyMT femininos transgênicos (FVB / n) de 100 dias, separando o tumor mamário da pele subjacente e tecido adiposo adjacente e / ou linfonodos usando tesoura estéril. Eutanizar os camundongos anestesiados por luxação cervical. </li><li> Com tesoura estéril ou um bisturi, mole os tumores primários manualmente em pequenos pedaços (~ 1,0 mm 3 ). Coloque peças tumorais em 3,0 mg / mL de colagenase A e 4,0 U / mL de DNase I dissolvidas em DMEM. Use ~ 10 mL do meio de digestão acima por tumor de 1,0 cm de diâmetro. <ol><li> Execute a digestão em um frasco estéril de 25 mL com uma barra de agitação estéril a ~ 125 rpm e 37 ° C durante 40 min. </li></ol></li><li> Pare a digestão adicionando soro bovino fetal (FBS) a uma diluição final de 10% e coloque toda a mistura em wE o gelo onde é mantido. </li><li> Filtre a suspensão do tumor digerido através de um filtro de nylon de 0,7 μm em um tubo cônico de 50 mL e descarte qualquer tumor restante no filtro. Centrifugar o sobrenadante a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM por tumor de 1,0 cm e re-filtrar através de um filtro de nylon de 0,7 μm. Contagem de concentração de células, depois centrifugue a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Resuspender o sedimento em 10% de sulfóxido de dimetilo com 90% de FBS a uma concentração de 2 x 10 7 células vivas / mL. Armazene suspensões monocelulares de tumor primário inteiro a -80 ° C. </li></ol> 2. Injeção orotópica de tumor mamário <ol><li> Parcialmente descongelar suspensões tumorais primárias congeladas a 37 ° C até que o sedimento congelado possa ser liberado do tubo criogênico em 20 mL de DMEM e contar as células. Centrifugação a 300 xg a 4 ° C e ressuspender as células em um DMEM 1: 1: fator de crescimento - preparação de membrana basal solubilizada reduzida eExtraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) em uma concentração de 1 x 10 7 células / mL (ver Tabela de Materiais ). </li><li> Coloque o lado ventral do lado singênico feminino do receptor anestesiado para cima e mantenha-se sob sedação contínua administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia. </li><li> Esterilizar o 4º local de injeção da glândula mamária direita utilizando etanol 70% em aerossol e aplicar Poly (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril. </li><li> Injetar 100 μL (1 x 10 6 células vivas a partir de suspensões tumorais primárias congeladas) lado biselado para cima na glândula mamária direita não esclerada do fVB / n feminino de 6 a 10 semanas usando uma seringa de insulina de 29 g 0,3 mL. </li></ol> 3. Ressecção cirúrgica do tumor ortopopear mamário <ol><li> 38-60 dias após a injeção de células tumorais, eutanizar camundongos que não exibam volumes de tumor ortotópico variando entre 172 a 450 mm 3 em volume [comprimento x (largura 2 </Sup&gt;) / 2] (cerca de 75% dos ratinhos injetados). </li><li> Coloque ratos anestesiados que exibam o lado ventral adequado do lado ventral sob sedação contínua, administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia e confirme que o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente. Aplique pomada veterinária aos olhos para prevenir a secura enquanto estiver sob sedação. </li><li> Pulverize 70% de etanol para esterilizar a área cirúrgica que envolve o tumor primário e, em seguida, aplique Poli (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril. NOTA: A remoção do cabelo no local cirúrgico resultou em escoriações e / ou infecções da pele para ~ 5% de camundongos e, portanto, foi excluída desta etapa (dados não mostrados). </li><li> Conforme mostrado na Figura 1C , faça uma incisão inicial da pele usando tesouras bruscas medial-caudal ao tumor. </li><li> Em seguida, faça uma excisão superior da pele ( Figura 1C ) medial ao tumor. Preste atenção à necessidade de cauterizar qualquer vasculatura fePuxando o tumor localizado na pele antes de estender a incisão. </li><li> Continue a incisão da pele lateralmente (posterior ao tumor), em seguida, faça uma excisão da pele superior (lateral ao tumor) e a excisão medial (superior ao tumor) ( Figura 1C ). </li><li> Depois que a pele foi excisada circunferencialmente em torno do tumor ( Figura 1C ), levante a pele sobreposta ao tumor usando fórceps enquanto dissimulam o tumor distante da musculatura da parede abdominal e mantendo as glândulas mamárias intactas. </li><li> Identificar (por dissecção romba) e cauterizar os vasos grandes que funcionam através das glândulas mamarias 4 e 5 th th. </li><li> Especial de consumo de aproximadamente metade dos 4 e 5 th th glândulas mamárias no local de cauterização para libertar o tumor, sobrepondo-se a pele, e os segmentos das glândulas mamarias (Figura 1C). </li><li> Em caso de sangramento, identifique hemorragia ativamenteVasos e imediatamente cauterizá-los. Se perder mais de 250 μL de sangue, exclua o mouse do estudo e faça uma eutanásia. </li><li> Feche os locais de excisão com clipes de ferida usando um aplicador de clip de ferida ( Figura 1C ). NOTA: Remova os grampos da ferida 10 dias após a cirurgia com um removedor de grampo da ferida. </li><li> Administrar solução salina estéril quente por via subcutânea (4% do peso corporal do animal) e manter o animal quente com uma lâmpada de calor. Verifique os animais a cada 5-10 min durante a recuperação da anestesia. NOTA: A administração de bupivacaína ou lidocaína aumentou a mortalidade pós-operatória (dados não apresentados). Ratos que apresentavam sinais de dor (hunching, não desejoso de se mover, falta de noivo) 1 h após a cirurgia foram eutanasiados. <ol><li> Uma vez que o mouse se tenha recuperado completamente, devolva-o à empresa de outros ratos. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento e processamento de sangue e pulmão para citometria e histologia de fluxo &lt;Ol&gt; <li> Nos pontos finais do estudo, prepare ratos para várias avaliações histopatológicas, se desejar. 90 min antes da eutanásia, dê a cada rato uma injeção intraperitoneal de bromodesoxiuridina (BrdU, 50 μg / g de peso do mouse) a uma concentração de 6,25 μg / μL em 1x PBS. NOTA: Os estoques congelados de bromodesoxiuridina dissolvida são utilizados no prazo de 1 mês após a preparação. </li><li> 10 min antes da eutanásia, com o rato anestesiado, coletar sangue retroorbitário (&gt; 500 μL) usando tubos capilares heparinizados e posteriormente transferir para tubos revestidos com EDTA dipotássico em gelo. </li><li> Para remover dos pulmões e do tecido mamário remanescente, fazer uma incisão na linha média com as tesouras do abdómen inferior ao da boca para expor o torácica e cavidades peritoneais (Figura 2A), e tirar a pele lateralmente para também expor o restante 4 th direita e 5 th mamária Glândulas. </li><li> Impeça o tecido remanescente da glândula mamária e examine iT para excluir o rebrote primário do tumor, avaliando o tecido fixo em parafina (FFPE) seccionado em série, por coloração com hematoxilina e eosina (H &amp; E) ( Figura 1 suplementar ). </li><li> Para remover os pulmões, abra a parede abdominal no diafragma com uma tesoura, eutanize o animal cortando a aorta abdominal para drenar o sangue antes da perfusão de pulmão ( Figura 2B- 2C ). </li><li> Corte o diafragma ao longo da caixa torácica de uma abordagem abdominal certificando-se de evitar o pulmão eo coração. Em seguida, exponha o tórax cortando os lados laterais da caixa torácica ( Figura 2D ). </li><li> Usando uma agulha de calibre 23 em uma seringa de 20 mL, perfume pulmões com ~ 5,0 mL de DPBS (~ 10 mL / min) através do ventrículo direito do coração até que os pulmões fiquem inteiramente brancos ( Figura 2E -2F ). Imediatamente corte o coração do vence principalÉ assim que o sangue não re-perfume no pulmão. </li><li> Para que o tecido pulmonar seja corrigido e processado para avaliações histopatológicas, injete 1,0 ml de formalina a 10% a 4 ° C no lado do bisel da traquéia exposto para cima em direção aos pulmões usando uma agulha de calibre 23 ( Figura 2G - 2H ). Injete a injeção quando os pulmões estiverem completamente expandidos e preenchidos com fixador ( Figura 2I ). </li><li> Os lóbulos de pulmão de consumo de escaras da traquéia e a emersão corrigem o tecido pulmonar em formalina de tampão neutro para subsequente inserção de parafina ou meio de congelação OCT, por procedimentos histopatológicos padrão. </li><li> Avalie quantitativamente a carga metastática nos pulmões por seção serial do tecido pulmonar do FFPE e avalie as seções dos micrótomos (100 μm, treze seções), por coloração H &amp; E ( Figura 1B ). </li></ol>

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Os autores não apresentam divulgação de conflito com os dados aqui apresentados.

Modificações e solução de problemas: Quando o tumor dissecante contundente longe da parede abdominal, o tumor pode permanecer aderente à parede abdominal. Isto foi observado em &lt;5% de ratinhos injetados com tumor (dados não apresentados). Para camundongos com tumores aderentes à parede abdominal, o mouse deve ser eutanásico, pois a ressecção é difícil sem recriação tumoral primária. Limitações do modelo / técnica: Enquanto outros pesquisadores relataram a presença de células metastáticas únicas marcadas com fluorescência disseminadas para fígado, rim, baço e cérebro, além do pulmão, após o reimplante de gemas terminais mamárias derivadas de ratos MMTV-PyMT 7 , além do pulmão, observamos várias Ratos com focos metastáticos no fígado, cuja penetração ainda não foi determinada. Outros locais de potencial fator metastático, como o linfonodoS, baço, osso e cérebro, não foram avaliados. Uma limitação desta técnica também incluiu escoriações pós-operatórias e infecção da pele ao raspar o local cirúrgico. Por isso, a esterilidade do local cirúrgico foi limitada à aplicação de 70% de etanol seguido de Poli (vinilpirrolidona) -Idina. Passos críticos dentro do protocolo: A dissecação brusca do tumor longe da parede abdominal é um passo crítico (passo 3.7) onde a evitação dos vasos dentro da glândula mamária deve ser realizada. As etapas 3.8 e 3.9 também são passos críticos onde há maior risco de sangramento não controlado. As porções proximais e distais distanciadas do vaso devem ser identificadas pós-cauterização para visualizar facilmente fontes de sangramento. Importância em relação aos métodos existentes: Modelos de mouse de câncer humano que imitam estágios da doençaProgressão, cinética e histopatologia fornecem ferramentas inestimáveis ​​para identificar e avaliar novos alvos para terapia, bem como a eficácia potencial de novos agentes terapêuticos visando essas moléculas / caminhos. Embora a ingesta de veia caudal e / ou injeção cardíaca de linhas celulares de câncer estabelecidas seja freqüentemente usada como modelos experimentais de metástase, elas não conseguem recapitular passos críticos no processo metastático e, em vez disso, refletem ensaios de colonização de órgãos ectópicos, onde os aspectos da sobrevivência das células tumorais podem ser avaliados 8 . Além disso, enquanto alguns modelos de ratos transgênicos existentes de desenvolvimento de carcinogênese mamária de novo fornecem sistemas modelo que permitem o estudo de etapas envolvidas em metástases, a carga tumoral primária significativa normalmente limita a duração do estudo. Assim, os grupos injetaram células neoplásicas cultivadas derivadas de tumores primários MMTV-PyMT para permitir a ressecção cirúrgica 9 . Nosso método se expande a partir dessas técnicas, pois dNão é selecionado para linhas celulares neoplásicas cultivadas a partir de tumores in vitro e apresenta diretamente o tumor primário completo e heterogêneo a camundongos receptores. Além disso, a longa latência da formação de metástases pulmonares em nosso modelo permite uma melhor janela terapêutica para vários estudos de tratamento. Aplicações futuras: Quanto à avaliação da eficácia da terapêutica nestes modelos, porque os tumores primários normalmente se desenvolvem em todas as glândulas mamárias, a ressecção cirúrgica de todos os tumores primários e a avaliação adjuvante de terapias destinadas a minimizar o crescimento de colônias metastáticas não é possível. Devido a estas questões, desenvolvemos um modelo autóctone de disseminação metastática em que a disseminação metastática de células tumorais ocorre de novo e, após a ressecção cirúrgica do tumor primário, é estabelecido um período de latência prolongada que permite a identificação de metástases no pulmão. Assim, esse modeloEspelha a metástase do câncer de mama humano e oferece um sistema único para avaliar a eficácia das terapias adiposas administradas por impacto na regulação da sobrevida livre de doença e / ou sobrevivência global com pontos finais definidos por diretrizes da IACUC. Uma vez que uma grande proporção de mulheres com câncer de mama são tratadas por ressecção cirúrgica de tumores primários 10 , e aqueles que progridem posteriormente desenvolvem metástases distal, isso implica que a disseminação e a semente ocorreram antes da ressecção cirúrgica. Os microambientes de órgãos distal fornecem nichos exclusivos para células metastáticas sobreviventes e / ou proliferantes 11 . Assim, é imperativo que os sistemas modelo imitam essas facetas, de modo que moléculas e caminhos operacionais em sites secundários, que são provavelmente distintos dos tumores primários, podem ser identificados, estudados e terapias que os direcionem com precisão para avaliar a eficácia. O modelo aqui desenvolvido fornece esses aspectos para estudo.

As mulheres na América do Norte têm um risco de vida de até 12% de desenvolver câncer de mama 2 ; A maioria destes indivíduos terá tumores primários removidos por cirurgia e, dependendo do subtipo de câncer, receberá terapia direcionada, endócrina, quimioterapia e / ou radioterapia na configuração adjuvante 3 . Exemplos incluem, mulheres diagnosticadas com câncer de receptores hormonais positivos que recebem terapias anti-estrogênio e mulheres com tumores HER2-positivos que recebem terapias direcionadas a HER2 com radiação / quimioterapia, enquanto que não há terapias direcionadas ainda disponíveis para tumores triplos negativos 3 . Apesar dos avanços em terapias de radiação, quimioterapia, terapias hormonais personalizadas que complementam a ressecção cirúrgica, a doença se repete em 30-70% das mulheres diagnosticadas com doença do estágio II ou III 4 , pois as terapias são em grande parte ineficazes na erradicação da doença metastática em órgãos distantes, inclusive Pulmão, osso, bChuva e / ou fígado 5 . Isto é especialmente significativo dado que, quando a doença metastática ocorre na ausência de rebrota primária do tumor, isso implica que as células malignas disseminadas provavelmente já estão presentes nos órgãos secundários no momento da cirurgia definitiva. Assim, as terapias capazes de erradicar ou retardar o crescimento de tumores metastáticos são urgentemente necessárias. Enquanto de novo modelos de ratinho de cancro mamário têm sido notavelmente informativo em revelar os mecanismos que regulam a progressão neoplásica 1, os modelos existentes também têm várias limitações. Um deles é o fato de que os modelos transgênicos de novo tipicamente desenvolvem tumores primários em múltiplas glândulas mamárias, em que a carga tumoral primária limita a duração dos estudos. Enquanto a fuga de células tumorais primárias e a amadurecimento metastático provavelmente ocorrem precocemente na progressão neoplásica nestes modelos, o desenvolvimento franco de tumores metastáticos ocorre tarde e dependendo deNo modelo do mouse e no fundo da tensão, muitas vezes é parcialmente penetrante 1 . Isto limita ainda mais a utilidade de modelos de novo para a descoberta de moléculas que regulam a metástase em órgãos secundários e para avaliar a eficácia pré-clínica da terapêutica no ambiente adjuvante. Para contornar essas limitações, desenvolvemos um modelo autônomo de novo de metástase de carcinoma mamário em pulmões. As fêmeas transgênicas parentais ( isto é , MMTV-PyMT no fundo da cepa FVB / n para os estudos aqui descritos) que levam tumores mamários de novo em estágio de novo são envelhecidos para ~ 100 dias 6 , altura em que seus tumores primários são ressecados cirurgicamente e se dissociaram enzimaticamente Suspensões de célula única. As suspensões (1 x 10 6 células) são, por sua vez, explotadas ortotópicamente em camundongos singênicos receptores de 6-7 semanas de idade, onde os tumores mamários primários isolados se desenvolvem ao longo de um período de 38 a 60 dias ( mm3), os ratinhos receptores são anestesiados e tumores primários são cirurgicamente ressecado de tal modo que o crescimento do tumor no local da cirurgia é minimizado, consistente com a cirurgia em mulheres (Recurso Figura 1). No fundo da tensão FVB / n, os camundongos desenvolvem focos metastáticos histologicamente detectáveis ​​em pulmões com 45% de penetrância por ~ 115 dias após a cirurgia ( Figura 1B ). Com esta latência prolongada de crescimento de tumores metastáticos, o modelo está em posição única para a administração de terapia adjuvante e para elucidar e avaliar a biologia subjacente que influencia a progressão metastática após a remoção cirúrgica de tumores primários.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Mais do que 75% de ratinhos receptores que receberam 1 x 10 6 culas de tumores mamários primários derivados de ratinhos MMTV-PyMT, desenvolver adenocarcinomas mamários individuais que variam em tamanho de 172-450 mm3 dentro de 38-60 dias (dados não mostrados). Os ratos elegíveis para randomização são então matriculados em grupos de estudo após ressecção cirúrgica de tumores primários, como mostrado ( Figura 1C ). O crescimento primário do tumor foi identificado em menos de 2% dos ratos submetidos à ressecção cirúrgica do tumor primário ( Figura 1 suplementar ). 45% dos camundongos receptores avaliados por este protocolo desenvolveram focos metastáticos histologicamente detectáveis ​​no dia 115 ressecção pós-tumoral ( Figura 1B ). Para afirmar histologia de metástases em áreas identificadas contendo células metastáticas por coloração de H &amp; E, as seções de tecido adjacentes foram avaliadas por PCR PyMT (dados nãomostrando). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54852/54852fig1.jpg" /> Figura 1 : ressecção pós-cirúrgica de tumores primários e desenvolvimento de metástase pulmonar de novo . ( A ) Esquema experimental do modelo de metástase do adenocarcinoma mamário murino. † indica que todos os camundongos foram perfundidos cardíacos e injetados com BrdU no dia da eutanásia. ( B ) Representante H &amp; E onde a detecção de focos metastáticos foi avaliada por corte em série do tecido pulmonar FFPE com lóbulos separados. Os focos metastáticos (&gt; 5 células) foram determinados por coloração de H &amp; E a cada 100 μm, refletindo 1.300 μm de tecido. Pulmões de 11 ratos foram analisados. ( C ) Esquema da ressecção cirúrgica do tumor mamário primário. Os números vermelhos e as setas indicam a ordem e a direção das incisões cutâneasFronteira com o tumor primário (esquerda). Os direita 4 e 5 th th glândulas mamárias com grandes vasos são mostrados ligados ao tumor primário (meio), seguido por fecho de feridas com agrafos (direita). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/54852fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54852/54852fig2.jpg" /> Figura 2 : Isolamento, perfusão e fixação do pulmão. A imagem (esquerda) eo desenho correspondente (direito) são mostrados de isolamento, perfusão e fixação do pulmão. (A) Uma incisão na linha média é mostrada com imagem ampliada visualizadas pele retraída expondo a direita 4 e 5 de glândulas mamárias (seta). ( B ) A parede abdominal é mostrada aberta ao diafragma. ( C ) Após a retração oPara o intestino, a aorta abdominal (ponta seta) é identificada e cortada. ( D ) O diafragma e os lados laterais da caixa torácica são cortados para expor a cavidade torácica. ( E ) O pulmão é perfundido através do ventrículo direito do coração até os pulmões ficarem inteiramente brancos ( F ). ( G ) A traqueia exposta é identificada seguida de injeção de formalina ( H ) na traquéia até os pulmões se expandirem ( I ). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/54852fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura complementar 1 : Recuperação tumoral primária no local cirúrgico. Representante H &amp; E (em cima) e (inferior) imagens brutas do 4 e 5 de glândula mamária pós-cirurgia direita remanescente, que mostra a ausência de TUReumatamento morto com linfonodo inguinal ( AB ) e glândula mamária com rebrota primária tumoral ( CE ). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/supplementary_figure_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em&gt; De Novo</em&gt; Metástase do câncer mamário

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K visualizações.  Oregon Health & Science University.  Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas. 

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A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Pesquisa do câncer

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Medicina

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de

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