저자들은 조직 병리학 지원을 담당 한 Jo Hill, 수술 기술 교육을 담당 한 John Gleysteen 박사, 비디오 촬영 지원을 담당 한 Tessa Diebel, 중요한 통찰력과 토론을위한 Wong and Coussens 연구소의 모든 구성원 및 재정 지원을위한 OHSU 기사 암 연구소에 감사드립니다. 저자는 T32GM071388-10 및 T32CA106195-11에서 CEG, NCI / NIH, 국방부 유방암 연구 프로그램, 수잔 G 코멘 재단, 유방암 연구 재단 및 스탠드 업 암 - 루스 가르겐 재단에 대한 지원을 인정합니다. 췌장암 수렴 팀 드림 팀 번역 연구 보조금 (SU2C-AACR-DT14-14)을 LMC, 여성 건강 단체 인 MHW에게, 그리고 Brenden-Colson 췌장 건강 센터를 MHW 및 LMC에 제공했습니다.

다음 프로토콜에 사용 된 동물은 동물 복지 법 규정 및 보건 서비스 (PHS) 정책을 준수하도록 고안된 오리건 건강 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 적용을받습니다. 멸균 조건의 유지 관리 : 멸균 된 도구를 마우스 사이에서 사용해야하며 멸균 거즈로 깨끗이 닦고 PBS로 헹구어 낸 다음 소독제 70 % 에탄올로 최소 15 분 동안 멸균해야합니다. 생존 수술을 위해서는 수술 용 모자, 안면 마스크, 가운 및 장갑을 착용해야합니다. 생존 수술을위한 동물의 수술 전 준비는 다음 프로토콜에 포함되어 있습니다. 시약 및 장비 목록은 표 1을 참조하십시오. 원발성 유방 종양으로부터 단일 세포 현탁액의 분리 및 제조 <ol><li> Donative female 100 일 된 트랜스 제닉 MMTV-PyMT (FVB / n) 마우스를 마취시키고 c마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정 작용. 발 핀치 반사가 없으면 마우스가 올바르게 마취되었는지 확인하십시오. </li><li> 멸균 설정에서 멸균 가위를 사용하여 피부와 주변 지방 조직 및 / 또는 림프절에서 유방 종양을 분리하여 100 일 된 트랜스 제닉 암 MMTV-PyMT (FVB / n) 생쥐의 원발성 유방 종양을 절제하십시오. 자궁 경관 탈구로 마취 쥐를 안락사. </li><li> 멸균 가위 또는 메스를 사용하여 원발 종양을 수작업으로 작은 조각 (~ 1.0 mm 3 )으로 채 웁니다. 종양 조각을 3.0 mg / mL collagenase A 및 4.0 U / mL DNase I에 DMEM에 용해시킨다. 직경 1.0 cm의 종양 당 ~ 10 mL의 위의 소화 배지를 사용하십시오. <ol><li> ~ 125 RPM 및 37 ° C에서 40 분 동안 멸균 교반 막대를 사용하여 멸균 25 mL 병에서 소화를 수행하십시오. </li></ol></li><li> 태아 소 혈청 (FBS)을 최종 희석액 10 %에 첨가하여 소화를 중지하고 전체 혼합물을 w얼음이 유지됩니다. </li><li> 0.7 ML 나일론 여과기를 통해 소화 종양 현탁액을 50 ML 원뿔 튜브로 필터링하고 여과기에 남아있는 종양을 폐기하십시오. 4 ℃에서 300xg로 뜨는 원심 분리기. </li><li> 1.0 cm 종양 당 10 ML DMEM에 펠렛을 Resuspend하고 0.7 μm의 나일론 여과기를 통해 다시 필터링. 셀 농도를 세고 4 x 300xg로 원심 분리한다. </li><li> 2 × 10 7 살아있는 세포 / ML의 농도 90 % FBS와 10 % dimethyl sulfoxide에 Resuspend 펠렛. -80 ° C에서 전체 원발 종양의 단일 세포 현탁액을 저장하십시오. </li></ol> 2. 유방 종양의 정위 주사 <ol><li> 냉동 펠렛이 극저온 튜브에서 20 mL DMEM으로 방출되어 세포 수를 계산할 때까지 37 ° C에서 1 차 종양 현탁액을 부분적으로 해동합니다. 4 X 300 XG에서 원심 분리기와 1 : 1 DMEM에 resuspend 세포 : 성장 요소 - 감소 solubilized 지하 막 준비 전자1 × 107 세포의 농도 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 마우스 육종에서 xtracted / ㎖는 (재료의 도표 참조). </li><li> 마취 된 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 마취 된 여성 동종 마우스의 복부 측면을 위로 놓고 계속 진정 작용을 유지하십시오. </li><li> 에어로졸 70 % 에탄올을 사용하여 오른쪽 제 4 유선 선 주사 부위를 살균하고 무균 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) - 요오드를 적용합니다. </li><li> 29 G 0.3 ML 인슐린 주사기를 사용하여 6 ~ 10 주 된 여성 FVB / n 마우스의 깨끗한 오른쪽 4 번째 유선에 100 μL (냉동 원발 종양 현탁액에서 1 x 10 6 살아있는 세포) 베벨 사이드를 주사. </li></ol> 3. 정위 유방 종양의 외과 적 절제술 <ol><li> 종양 세포 주입 다음 38-60일는 쥐 부피 3mm 450-172 사이 [길이 x 징 동소 종양 부피를 나타내지 않는 안락사 (폭 2 </2) (주입 된 마우스의 약 75 %). </li><li> 마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정하에 적절한 종양 크기 복부 측면을 표시 마취 마우스를 배치하고 마우스가 결석 발 핀치 반사와 함께 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 진정 작용이있는 동안 건조 방지를 위해 수의사에게 눈물을 채우십시오. </li><li> 원발 종양을 둘러싼 수술 부위를 멸균하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이 한 다음 멸균 된 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) -Iodine을 바르십시오. 참고 : 외과 수술 부위의 제모는 ~ 5 % 마우스의 피부 탈출 및 / 또는 감염을 유발 했으므로이 단계에서 제외되었습니다 (데이터는 표시되지 않음). </li><li> 그림 1C에 나타난 것처럼, 종양의 중앙 - 꼬리 부분에 무딘 가위를 사용하여 초기 피부 절개를하십시오. </li><li> 다음으로, 종양의 중간에있는 피부 ( 그림 1C )의 우수한 절제를하십시오. 모든 혈관계를 소작 할 필요성에주의하십시오.절개를 연장하기 전에 피부에있는 종양을 eding. </li><li> 옆으로 (종양의 후방) 피부 절개를 계속 한 다음 탁월한 피부 절제 (종양 측면)와 내과 적 절제 (종양보다 우수) ( 그림 1C )를하십시오. </li><li> 피부가 종양 주위로 절제 된 후 ( 그림 1C ) 종양을 복부 벽 근육에서 멀리 해부하고 유선을 손상시키지 않으면 서 겸자를 사용하여 종양에 붙어있는 피부를 들어 올립니다. </li><li> 4 번째 와 5 번째 유방 땀샘을 관통하는 대형 혈관을 (무딘 절개로) 확인하고 소작하십시오. </li><li> 소작 부위에서 4 번째 및 5 번째 유방 땀샘의 약 절반을 잘라내어 종양, 피부, 그리고 유선의 일부분을 제거합니다 ( 그림 1C ). </li><li> 출혈이있을 경우, 출혈을 적극적으로 식별하십시오.즉시 그들을 소작하십시오. 혈액 250 μL 이상이 손실되면 마우스를 연구에서 제외하고 안락사시킵니다. </li><li> 상처 클립 applier ( 그림 1C )를 사용하여 상처 클립과 excision 사이트를 닫습니다. 참고 : 상처 클립 제거제로 수술 10 일 후 상처 클립을 제거하십시오. </li><li> 피하 (동물의 체중의 4 %) 따뜻한 멸균 식염수를 관리하고 열 램프로 동물을 따뜻하게 유지. 마취에서 회복되는 동안 매 5 ~ 10 분마다 동물을 확인하십시오. 주 : bupivacaine 또는 lidocaine 투여는 수술 후 사망률을 증가시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 수술 후 1 시간 동안 통증의 징후를 보인 마우스 (사냥감, 움직이지 않으려 고 함, 손질에 실패 함)를 안락사시켰다. <ol><li> 마우스가 완전히 회복되면 다른 마우스 회사에 반환하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 유동 세포 계측법 및 조직학을위한 혈액 및 폐의 분리 및 처리 &lt;ol&gt; <li> 연구 종점에서 원하는 경우 다양한 조직 병리학 적 평가를 위해 마우스를 준비하십시오. 안락사하기 90 분 전에 각 마우스에게 bromodeoxyuridine (BrdU, 50 μg / g 마우스 체중)을 1 x PBS에 6.25 μg / μL 농도로 복강 내 주사한다. 참고 : 용해 된 bromodeoxyuridine의 냉동 보관은 준비 후 1 개월 이내에 사용됩니다. </li><li> 마취 된 마우스로 안락사하기 10 분 전에 헤파린 처리 된 모세관을 사용하여 후각 유혈 (&gt; 500 μL)을 수집 한 후 얼음에 낀 EDT로 코팅 된 튜브로 옮긴다. </li><li> 폐와 남아있는 유방 조직을 제거하기 위해 가슴 아래와 복강을 드러내 기 위해 하복부에서 입으로 가위로 정중선 절개를하고 ( 그림 2A ) 피부를 옆으로 떼어 내고 나머지 4 번째 와 5 번째 유방을 노출시킵니다 땀샘. </li><li> 나머지 유선 조직을 잘라 내고hematoxylin과 eosin (H &amp; E) 염색에 의한 연속 절편 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직을 평가하여 원발 종양의 재성장을 배제 하였다 ( 보충 그림 1 ). </li><li> 폐를 제거하려면 가위로 횡격막에 복벽을 열고 복부 대동맥을 절단하여 폐를 관류시키기 전에 혈액을 배출하여 동물을 안락사시킵니다 ( 그림 2B -2C ). </li><li> 복부 접근법에서 흉곽을 따라 횡경막을 잘라 폐와 심장을 피하십시오. 그런 다음, 흉곽의 측면을 절단하여 흉부를 노출시킵니다 ( 그림 2D ). </li><li> 20 ML 주사기에 23 게이지 바늘을 사용하여 폐가 완전히 흰색 ( 그림 2E -2F )로 변할 때까지 심장의 오른쪽 심실을 통해 ~ 5.0 ML DPBS (~ 10 ML / 분)와 폐를 perfuse. 즉시 주요 배에서 심장을 자른다.그래서 피가 폐로 다시 퍼지지 않습니다. </li><li> 폐 조직을 고정하고 조직 병리학 적 평가를 위해 4-C에서 ~ 1.0 mL의 10 % 포르말린을 23 게이지 바늘 ( 그림 2G - 2H )을 사용하여 폐쪽으로 노출 된 호흡 경사 측면으로 주사합니다. 일단 폐가 완전히 팽창되고 정착액으로 채워지면 주입을 중단하십시오 ( 그림 2I ). </li><li> 기관에서 폐엽을 제거하고 표준 조직 병리학 적 절차에 따라 중성 완충 포르말린에서 폐 조직을 고정하여 후속 파라핀 매입 또는 OCT 동결 매질을 만듭니다. </li><li> FFPE 폐 조직의 연속 절편을 통해 폐의 전이성 부하를 정량적으로 평가하고 H &amp; E 염색 ( 그림 1B )을 통해 마이크로톰 섹션 (100 μm, 13 개 섹션)을 평가합니다. </li></ol>

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저자는 여기에 제시된 데이터와의 충돌에 대해 공개하지 않습니다.

수정 및 문제 해결 : 복부 벽에서 종양을 절제 할 때 종양이 복부 벽에 부착 된 채로 남아있을 수 있습니다. 이것은 종양이 주입 된 마우스의 5 % 미만에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 복벽에 부착 된 종양이있는 마우스의 경우 원발 종양 재성장 없이는 절제가 어렵 기 때문에 마우스를 안락사해야합니다. 모델 / 기술의 한계 : 다른 연구자들은 폐를 제외하고 MMTV-PyMT 마우스 7 에서 유래 한 유방 말단 봉우리를 재 주입 한 후 폐뿐만 아니라 간, 신장, 비장 및 뇌에 확산 된 형광 표지 단일 전이 세포의 존재를보고했지만, 간에서 전이 병소가있는 마우스. 이의 침투는 아직 결정되지 않았다. 림프절과 같은 잠재적 인 전이성 부하의 다른 부위비장, 뼈 및 뇌는 평가되지 않았습니다. 이 기술의 한계는 또한 수술 부위를 면도 할 때 수술 후 excoriations과 피부의 감염을 포함했습니다. 이 때문에 외과 수술 부위의 무균 성은 폴리 (비닐 피 롤리 돈) - 요오드가 뒤 따르는 70 % 에탄올의 도포로 제한되었습니다. 프로토콜 내 중요 단계 : 복벽으로부터 종양을 무딘 절개하는 것은 유방 내에서 혈관을 피하는 중요한 단계입니다 (단계 3.7). 3.8 및 3.9 단계는 통제되지 않은 출혈의 위험이 가장 큰 중요한 단계입니다. 혈관의 근위부와 근위부는 출혈의 원인을 쉽게 시각화 할 수 있도록 소작동 후 확인되어야합니다. 기존 방법에 대한 중요성 : 질병의 단계를 모방 한 인간 암의 마우스 모델진행, 동역학 및 조직 병리학은 치료를위한 새로운 표적뿐만 아니라 그 분자 / 경로를 표적으로하는 새로운 치료제의 잠재적 효능을 확인하고 평가할 수있는 귀중한 도구를 제공합니다. 확립 된 암 세포주의 꼬리 정맥 및 / 또는 심장 주사는 종종 전이의 실험 모델로 사용되지만, 전이 과정에서 중요한 단계를 반복하지 못하고 대신 종양 세포 생존의 측면을 평가할 수있는 이소성 장기 집락 분석을 반영합니다 8 . 더욱이, 새로운 유방암 발달의 기존 트랜스 제닉 마우스 모델은 전이와 관련된 단계를 연구 할 수있는 모델 시스템을 제공하지만 상당한 일차적 인 종양 부담은 일반적으로 연구 기간을 제한합니다. 따라서 그룹은 MMTV-PyMT 원발 종양에서 파생 된 신생 종양 세포를 주입하여 수술 절제술 9 을 허용합니다. 우리의 방법은 이러한 기술을 does 는 생체 외에서 종양 으로 성장한 종양 세포주를 선택하지 않고 수혜 쥐에게 완전하고 이질적인 원발 종양을 직접 도입합니다. 또한 우리 모델에서 폐전이 형성의 긴 대기 시간은 다양한 치료 연구를위한 더 나은 치료 창을 허용합니다. 향후 응용 프로그램 : 이 모델에서 치료제의 효능을 평가하는 것과 관련하여 원발성 종양은 일반적으로 모든 유선에서 발생하기 때문에 모든 원발 종양의 외과 적 절제와 전이성 콜로니의 성장을 최소화하기위한 보조제 평가는 불가능합니다. 이러한 문제로 인해 우리는 종양 세포의 전이성 보급이 새롭게 발생하고 원발 종양의 외과 적 절제술 후 폐의 전이를 확인할 수있는 확장 된 대기 시간이 설정되는 전이성 보급 모델을 개발했습니다. 따라서,이 모델인간의 유방암 전이를 반영하고 IACUC 가이드 라인에 따라 정의 된 종점으로 무병 생존 및 / 또는 전체 생존을 조절하는 데 미치는 영향에 대한 보조 전달 요법의 효능을 평가할 수있는 독특한 시스템을 제공합니다. 유방암 여성의 큰 비율을 차 종양 (10), 이후 원위부 전이를 개발 진척 것들의 수술 적 절제에 의해 처리되기 때문에,이 보급 및 시드 전에 수술 적 절제에 일어난 것을 의미한다. 원위부 기관의 미세 환경은 전이 세포의 생존 및 / 또는 증식을위한 고유 한 틈새를 제공합니다 11 . 따라서, 모델 시스템이 일차 종양과는 별개의 이차 부위에서 작용하는 분자 및 경로가 확인되고 연구되고, 이들을 표적으로하는 치료법이 효능에 대해 정확하게 평가되도록 이러한 측면을 모방하는 것이 필수적이다. 여기에서 개발 된 모델은 연구를위한 이러한 측면을 제공합니다.

북미의 여성은 유방암이 개발의 ~ 12 %의 평생 위험이; 이 환자의 대다수는 수술을 통해 제거 된 원발 종양을 가지게되며, 암 부속 유형에 따라 보조제 세팅 3 에서 표적, 내분비, 화학 요법 및 / 또는 방사선 치료를 받게됩니다. 예를 들어, 항 - 에스트로겐 요법을받는 호르몬 수용체 양성 암 및 방사선 / 화학 요법으로 HER2 타겟 요법을받는 HER2 양성 종양이있는 여성으로 진단 된 여성은 삼중 음성 종양 3에 대한 표적 치료법이 아직 없습니다. 치료는 원격 장기에 전이 된 질병 퇴치에 크게 효과가 같은 수술 적 절제를 보완 방사선, 화학 요법, 개인 및 호르몬 기반 치료의 발전에도 불구하고, 질병을 포함, 단계 II 또는 III 질환 4 진단을 여성의 30~70%에 재발 폐, 뼈, b비 및 / 또는 간 5 . 이는 원발성 종양 재성장이없는 상태에서 전이성 질환이 발생했을 때 확진 된 수술 당시 파종 된 악성 세포가 이차 기관에 이미 존재했을 가능성이 높다는 것을 감안할 때 특히 중요합니다. 따라서 전이성 종양을 박멸하거나 성장을 지연시킬 수있는 치료법이 시급히 필요합니다. 유방 발암의 드 노보 마우스 모델, 종양 진행 한 조절 메커니즘을 드러내는 현저 정보되었지만 기존 모델은 몇 가지 제한이있다. 이들 중 하나는 de novo 형질 전환 모델이 일반적으로 원발성 종양 부담이 연구 기간을 제한하는 다중 유방 ​​땀 샘에서 원발 종양을 발병한다는 사실입니다. 일차 종양 세포 탈출과 전이성 파종이이 모델에서 종양 진행의 초기에 일어날 가능성이 있지만, 전이성 종양의 솔직한 발달은 늦게 발생하며,n 마우스 모델 및 변형 배경은 종종 부분적으로 침투합니다 1 . 이것은 이차 장기에서의 전이를 조절하는 분자 발견을위한 de novo 모델의 유용성을 제한하고, 보조제 환경에서 치료제의 전임상 효능을 평가하기위한 것이다. 이러한 한계를 피하기 위해 우리는 폐에 유방암 종양 전이의 자동 신생 모델을 개발했습니다. 부모의 형질 전환 여성 (즉, MMTV-PyMT은 여기에 기술 연구에 대한 FVB / N 변형 배경에) 말기 베어링 드 노보 유방암이되는 자신의 차 종양은 외과 적 절제 및 효소로 분해되어 가리 ~ 백일 6 세되는 단일 세포 현탁액. 일시 정지 (1 x 10 6 세포)는 차례로 동종 이형 유방 종양이 38-60 일의 기간 동안 발병하는 6-7 주령의 수혜자 동족 ​​암컷 생쥐 ( 3 )에서 수혜자 마우스를 마취시키고 원발 종양을 수술 부위에서 종양 재성장이 최소화되도록 외과 적으로 절제하여 여성의 수술과 일치시킵니다 ( 보충 그림 1 ). FVB / n 균주 배경에서 마우스는 수술 후 ~ 115 일까지 45 %의 침투율을 보이는 폐에서 조직 학적으로 검출 가능한 전이 초점을 발달시킵니다 ( 그림 1B ). 이 전이성 종양 성장 지연으로이 모델은 보조 요법 전달, 원발성 종양의 외과 적 제거 후 전이성 진행에 영향을 미치는 기초 생물학을 밝히고 평가하기위한 고유 한 위치에 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

그레이터 MMTV-PyMT 마우스 유래의 기본 유방암에서 1 × 106 세포를 수신받는 마우스의 75 % 이상, 172에서 450mm 3 38-60 일 이내의 크기에 이르는 단일 유방 선암 개발 (데이터는 보이지 않음). 무작위 추출에 적합한 마우스는 그림 과 같이 원발 종양의 외과 적 절제 후 연구 그룹에 등록됩니다 ( 그림 1C ). 원발 종양의 외과 적 절제술을받은 생쥐의 2 % 미만에서만 원발성 종양 재성장이 확인되었다 ( 보충 그림 1 ). 이 프로토콜에 의해 평가받는 쥐의 45 %는 종양 절제 후 115 일까지 조직 학적으로 검출 가능한 전이성 초점을 개발했다 ( 그림 1B ). H &amp; E 염색에 의한 전이 세포 포함 구역에서 전이 조직을 확인하기 위해 인접한 조직 절편을 PyMT PCR로 평가 하였다표시). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54852/54852fig1.jpg" /> 그림 1 : 원발 종양의 수술 후 절제와 새로운 폐 전이 발달 ( A ) 마우스 mammary adenocarcinoma 전이 모델의 실험 스키마. †은 안락사 당일에 모든 마우스에게 심장 관류가 이루어지고 BrdU가 주입 된 것을 의미합니다. ( B ) 대표적인 H &amp; E로 전엽의 분리가 분열 된 FFPE 폐 조직의 연속 절편에 의해 전이성 병소의 검출이 평가되었다. 전이성 초점 (&gt; 5 세포)은 조직의 1,300 μm를 반영하는 매 100 μm의 H &amp; E 얼룩에 의해 결정되었다. 11 마리 생쥐의 폐를 분석했습니다. 원발성 유방 종양의 외과 적 절제술의 스키마 ( C ). 빨간색 숫자와 화살표는 피부 절개의 순서와 방향을 나타냅니다.원발 종양 경계 (왼쪽). 주요 혈관이있는 오른쪽 4 번째 및 5 번째 유선은 원발 종양 (중간)에 붙어 있으며 상처 클립 (오른쪽)으로 상처 봉합이 나타납니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/54852fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54852/54852fig2.jpg" /> 그림 2 : 폐의 격리, 재관류 및 고정. 그림 (왼쪽)과 해당 만화 (오른쪽)는 폐 격리, 관류 및 고정이 표시됩니다. ( A ) 정중선 절개는 오른쪽 4 번째 및 5 번째 유방 땀샘 (화살표)을 드러내는 수축 된 피부를 표시하는 삽입 된 이미지로 표시됩니다. ( B ) 복벽이 횡격막에 열리는 것으로 보여진다. ( C ) 철회 후f 장, 복부 대동맥 (화살촉)이 확인되고 열려 있습니다. ( D ) 흉곽의 횡경막과 측면이 절단되어 흉강을 노출시킨다. ( E ) 폐가 완전히 우울해질 때까지 심장의 우심실을 통해 폐가 관류된다 ( F ). ( G ) 노출 된 기관을 확인한 다음 폐가 확장 될 때까지 기관에 포르말린 ( H )을 주입합니다 ( I ). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/54852fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 그림 1 : 수술 부위의 일차 종양 재성장. 우측 4 번째 와 5 번째 유선의 수술 후 H &amp; E (위)와 총 (아래) 이미지의 대표적인 이미지로 tu가 없음을 보여줍니다.림프절 ( AB ) 및 원발 종양 재성장 ( CE )이있는 유선. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54852/supplementary_figure_1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론<em&gt; 드 노보</em&gt; 유방암 전이

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K 조회수.  Oregon Health & Science University.  유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다. 

비디오: Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

연구

암 연구학

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

의학

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론

요약

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