We are supported by the University of Wisconsin-Madison Medical School start-up (A.V.G.).

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Pub. No. 80-23). Todos os métodos e protocolos utilizados nestes estudos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use Protocolo seguindo as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH (publicação No. 85-23, revista em 1996). Todos os animais utilizados neste estudo receberam cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Remoção Coração e Langendorff Perfusão <ol><li> Antes do isolamento do coração, a solução de Tyrode quente a 37 ° C usando um banho de água e uma camisa de água. </li><li> Anestesiar o rato com 5% de isoflurano / 95% de O 2. </li><li> Assegurar um nível adequado de anestesia, verificando a perda do reflexo dor. </li><li> Execute toracotomia. Abra o peito usando curvas 5.5 &quot;tesoura Mayo e 5,5&quot; hemostática Kelly paraceps para fazer um corte de 1 cm na parte dianteira do tórax. <ol><li> Rapidamente extrair o coração contra o peito (dentro de 30 seg). Use 4 &quot;forceps Iris curvas para agarrar o tecido pulmonar e cortar o pulmão, timo e coração juntamente com o pericárdio usando 4.3&quot; tesoura Iris. Não pegue o coração diretamente. </li><li> Lavá-lo em oxigenada (95% O2 / 5% de CO 2), a temperatura constante-(36,8 ± 0,4 ° C) modificada solução de Tyrode. Utilize a seguinte composição de solução (em mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 de MgCl2, 1,3 de CaCl2, 20,0 de NaHCO3 e 11,1 de glucose (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Enquanto mergulhando na mesma solução, identificar o pulmão, timo, gordura e tecido. Cuidadosamente dissecar-los a partir do coração. Use curva 3 &quot;Vannas-Tübingen tesoura e 4,3&quot; # 5 fórceps. </li><li> Em seguida, identificar a aorta e canular-lo em um 21 G cânula feitos sob medida. Usar duas curvas 4.3 &quot;força # 5Bps. </li><li> Após a canulação, perfundir simultaneamente (através da cânula, a uma taxa de fluxo de ~ 5 ml / min, o que deve ser ajustado com base na pressão aórtica, ver abaixo) e superfuse (no banho a uma taxa de fluxo de ~ 50 mL / min) o coração com solução de Tyrode aquecido e filtrou-se ao longo de toda a experiência. Passar a solução de perfusão através de um filtro de nylon de 11 ^ M em-linha para evitar o entupimento da circulação coronária. </li><li> Utilizando um transdutor de pressão (ou um medidor de pressão), ligado através de um bloqueio de 3 vias torneira de Luer para a linha de perfusão, monitorizar a pressão aórtica e mantê-lo entre 60 e 80 mmHg. Regule a velocidade de perfusão, se necessário para manter a pressão aórtica dentro desta gama. </li></ol> 2. Mapeamento óptica do SAN do coração inteiro perfusão-Langendorff <ol><li> Instrumentação <ol><li> Colocar o coração na horizontal e fixar o ápice ventricular para o fundo revestido de silicone da câmara utilizando 0,1 mm pinos de diâmetro para prevent movimento durante o experimento induzida por fluxo. 12 </li><li> Inserir um ( &quot;ID x 005&quot; .012) pequeno tubo de silicone para o ventrículo esquerdo (VE) através da veia pulmonar, os átrios esquerdo (AE) e da válvula mitral (VM). Fixar o tubo por um fio de seda (4-0) para o tecido conjuntivo soar. </li><li> Posicione o coração com o seu lado posterior virado para cima (Figura 1A, painel esquerdo). </li><li> Pin a borda do apêndice RA (RAA) para a parte inferior da câmara de silicone de 0,1 mm de diâmetro usando pinos minutien. Ajustar o seu nível, a fim de tornar a superfície posterior da RA plana e permitir que ele seja localizado plano focal da câmara. Isto irá permitir que as medições ópticas a partir da área de superfície máxima do átrio. </li><li> Soga superior (VCS) e inferior (IVC) da veia cava por um fio de seda (4-0), esticar e fixar a outra extremidade do fio de sutura para a parte inferior de uma câmara revestida de silicone (ver Figura 3A). Certifique-se de que as suturas não bloqueiam acampo de vista óptico. </li><li> Coloque o eletrodo de estimulação feito por encomenda na beira da RAA. Para fazer com que os eléctrodos, a utilização de silício revestidas de prata fios de diâmetro 0,25 mm, com distância inter-eléctrodo de 0,5 mm e desprovida de silício para um comprimento de 1 mm na extremidade de estimulação. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29 gauge) eletrodos monopolar perto da base dos ventrículos direito e esquerdo. Coloque o eletrodo ECG chão, perto do ápice dos ventrículos. </li></ol></li><li> coloração <ol><li> Desde ambos os corantes fluorescentes e blebbistatin desacoplador electro-mecânica são sensíveis à luz, execute todos os procedimentos descritos a seguir em um quarto escuro. Em primeiro lugar preparar corante sensível à tensão RH-237 ou di-4-ANNEPS como uma solução estoque, 1,25 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que aliquota (30 mL cada) e armazenar as alíquotas a -20 ° C. </li><li> Dilui-se 5-10 uL de solução de corante em 1 ml de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e em seguida injectá-lo na linha de perfusão coronáriaao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha. </li><li> Prepare blebbistatin como uma solução-mãe (2 mg / ml em sulfóxido de dimetilo, 6,8 mM) com antecedência e armazená-lo a 4 ° C. </li><li> Depois de 20 min de estabilização, adicionar (C 37 °) blebbistatin 0,5 ml de aquecido no perfusado e diluir 0,1 ml de blebbistatin em 1 ml de solução (37 ° C) de Tyrode aquecido. Em seguida, injectar na linha de perfusão coronária ao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha. </li></ol></li></ol> 3. mapeamento óptico da SAN a partir da Preparação atrial isolada <ol><li> Instrumentação <ol><li> Para a preparação atrial isolada, isolar e canular o coração, tal como descrito acima nos passos 1,1-1,5 para a preparação de todo o coração. </li><li> Dissecar os ventrículos para longe do lado anterior. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 1 para detalhes. </li><li> Abra o RA, cortando através da va tricúspidelve (TV) ao longo do eixo TV-SVC. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 2 para mais detalhes. </li><li> Cortar o membro medial da crista terminal para abrir o RAA. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 3. </li><li> Abrir a parede livre do átrio anterior através da realização de um corte a partir da linha média do corte anterior # 3 para a aresta de canto inferior direito da RAA, achatar e fixar a parede livre do átrio ao fundo de uma câmara revestida de silicone. Ver a direcção indicada pela seta oca na Figura 1A, cortar # 4. Preservar um rebordo de tecido ventricular para fixar a preparação para evitar danos às aurículas. </li><li> Da mesma forma, aberta LA cortando o MV ao longo do canto MV-superior do apêndice LA (LAA). </li><li> Para abrir o LAA, cortado a partir do meio do AAE aberta, através da parede anterior livre do átrio até perto de uma borda do meio de AAE. </li><li> Abra a fibrilação alo parede livre anteriorng no mesmo sentido, em seguida, achatar e fixá-lo para a parte inferior de uma câmara de Sylgard revestido. </li><li> Parcialmente remover o tecido do septo interatrial. Isto irá reduzir a dispersão do sinal óptico a partir de tecido que não está em foco. Portanto, tanto a LA e RA, bem como a SAN e da junção atrioventricular (AVJ) são acessíveis nesta preparação (Figura 1B). </li><li> Levanta a preparação final de cerca de 0,5 mm a partir do fundo da câmara revestida de silicone, a fim de permitir que a superfusão de ambas as superfícies do epicárdio e endocárdio. </li><li> Superfuse com a preparação aquecido (37 ° C) solução de Tyrode a uma taxa constante de ~ 12 mL / min para um fluxo concentrado localizado perto do VPC e ~ 30 mL / min para um banho de superfusão. </li><li> Coloque a estimulação feita por medida de Ag / AgCl 2 eléctrodo (0,25 mm de diâmetro) na extremidade do RAA dissecados. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29G) eletrodos (monopolar) perto da RAA e LAA, respectivamente. Coloque no chão ECG eleitosmontou perto da AVJ. </li></ol></li><li> coloração <ol><li> Executar uma aplicação directa do corante sensível à tensão (RH-237 ou di-4-ANNEPS). Para isso, dilui-se 1-2 mL da solução stock de corante em 1 mm de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o corante diluída sobre a superfície da preparação usando uma pipeta de 1 mm. </li><li> Alternativamente, fibrilação realização da coloração com o corante sensível à tensão através de uma perfusão coronária do coração de Langendorff-perfundidos semelhante ao descrito acima para a preparação de todo o coração (passos 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Após a coloração de perfusão coronária, isolar a preparação fibrilação tal como descrito. Realização da coloração de superfície adicional, quando necessário para atingir um nível satisfatório de fluorescência. isolamento atrial rápido não branquear o corante e não afeta a qualidade da coloração. </li></ol></li><li> Imobilizar a preparação com o eletro-mecânico desacoplador, blebbistatin. Diluir 3-5 ul blebbistatin solução estoque na solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o blebbistatin diluída sobre a superfície da preparação e da solução circundante. Desde blebbistatin tem sido mostrado para ser leve, 13,14 evite exposição longa sensível à luz durante a preparação e coloração. </li><li> Executar aplicativo blebbistatin adicional, tanto quanto necessário para suprimir a contração. Normalmente até 3 aplicações adicionais (3-5 ul por cada aplicação) pode ser utilizado para suprimir o artefacto de movimento suficiente a fim de reconstruir com precisão SAN e de activação do átrio. </li><li> Adicionar mais 0,5 ml de blebbistatin aquecido no perfusado. Durante este procedimento, a pausa de superfusão durante 30 segundos para permitir que o corante / blebbistatin para corar o tecido atrial. </li></ol></li></ol> 4. Mapeamento óptica Configurar NOTA:. Uma descrição detalhada do sistema de mapeamento óptico é proporcionado noutro local 12 <ol><li> Use uma câmera com um TEMporal resolução de 2.000 frames / seg ou superior, e uma série de lentes de condensador para chegar a resolução espacial de 100 mm / pixel ou superior. Isso é necessário para reconstruir a ativação SAN e propagação intranodal. </li><li> Para reduzir o movimento artefato a partir da solução de vibração, corrigir uma pequena tampa de vidro sobre a superfície da solução sobre o coração / preparação atrial isolada. </li><li> Use luz de excitação (520 ± 45 nm de comprimento de onda) fornecido por um-corrente constante, lâmpada de halogéneo de baixo ruído. Direcionar o feixe de luz filtrada para a preparação usando um guia de luz flexível bifurcada. </li><li> Filtra-se a fluorescência emitida por um filtro passa longo (&gt; 715 nm). Recolha, digitalizar e salvar o sinal fluorescente adquirida em um software de computador usando fornecido pelo fabricante da câmera. </li></ol> 5. Processamento de Dados Nota: Os dados de mapeamento óptico é recolhido e armazenado como uma série de matrizes de intensidade de fluorescência em diferentes pontos de tempo. Cada represe pixelsnts uma medida da intensidade de fluorescência recolhido de um local específico na preparação de tecido em um ponto de tempo específico. fluorescência de fundo é automaticamente removido por pixel para permitir uma melhor visualização das mudanças de fluorescência produzidos por variações de tensão de membrana e invertida para corresponder com potenciais de ação (APs) medidos por sistemas de microeletrodos. Os detalhes dos diferentes passos no processamento de dados de imagens ópticas, incluindo segmentação de imagens, filtragem espacial, filtragem temporal e remoção de desvio da linha de base, são fornecidos na revisão focada 15. <ol><li> Manualmente ou usando o algoritmo especial (por exemplo, uma detecção de limiar ou a borda) 15 para determinar limites de tecido, criar uma máscara binária de 1 (pixels incluído) e 0 (pixels excluídos) e aplicar a máscara para cada quadro na seqüência. Este processo cria uma imagem binária que destaca as áreas de interesse para posterior processamento. </li><li> Para melhorar a relação sinal-ruído do optdados do iCal, filtrar os sinais dentro das áreas de interesse seleccionados. Para isso, use espacial (ou seja, a média de pixels fluorescentes vizinhos, tal como definido por um bin convolução desejado ou kernel, por exemplo, 3 x 3, ou, para os dados ruidosos, 5 x 5) e / ou filtro temporal (por exemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshov tipo 2, elíptico, etc.) (Figura 2). Tenha em mente a possibilidade de artefatos induzida por filtrados na interpretação dos dados. Para mais detalhes, veja o comentário. 15 </li><li> Remover desvio da linha de base em gravações ópticas quando necessário (usando a filtragem passa-alta ou ajuste polinomial ao sinal original) e, em seguida, normalizar a cada sinal de pixel de 0 (fluorescência mínimo) a 1 (fluorescência máxima). </li><li> Selecione uma janela de tempo que abrange os tempos de ativação de todos os pixels para um único propagação AP. Atribuir cada pixel seu tempo de activação como o tempo máximo de derivado movimento ascendente (df / dt max, onde F é fluorescenintensidade ce). Usando todos os tempos de ativação pixel, reconstruir o mapa de activação isócrono. Cada isocrônica mostrará assim os pixels activados ao mesmo tempo. </li><li> Para reconstituir o mapa de distribuição de duração do PA (DPA), para cada pixel calcular a duração entre o momento de activação e o tempo a um nível específico de repolarização (por exemplo, a 80% de repolarização, APD 80). Usando todos os valores de pixel de APD, reconstruir a distribuição Mapa isócrono de APD. Cada isochron vai mostrar, assim, os pixels com o mesmo APD. </li><li> Para calcular a velocidade de condução para a propagação AP, se ajustar à superfície da preparação dos dados de tempo de activação calculados em 5.4. Para isso, utilizar polinomial superfície de adaptação ou local alisamento da superfície do kernel e, em seguida, calcular os vectores de velocidade de condução do local a partir do gradiente da superfície equipada. </li><li> Para criar o mapa repolarização, atribua cada pixel seu tempo de repolarização, definida como a segunda derivada máxima (d 2 F / dt2) do sinal óptico no final do OAP, ou o tempo de 90% de repolarização. </li></ol>

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</ol>

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Aqui, nós apresentamos dois tipos de preparações do rato san: 1) SAN intacta no coração toda Langendorff-perfundidos, e 2) SAN no isolado, abriu preparação atrial. Estes dois tipos de preparação servem diferentes propósitos experimentais. Na preparação do coração inteiro de Langendorff-perfundidos, a estrutura fibrilação intacta é preservado o que torna possível estudar arritmias atriais complexos, tais como fibrilação atrial, bem como as interacções entre o SAN e o átrio durante taquiarritmias reentrantes. 6 Em contraste, na preparação atrial isolada , o átrio é aberta e achatada para uma estrutura tridimensional em que os pseudo dois feixes anatómicas tridimensionais são perturbados. Isto pode afectar a anatomia das vias reentrantes que torna a preparação atrial isolada não é ideal para estudar arritmogênese fibrilação. No entanto, o uso desse tipo de preparação, a localização do pacemaker líder (s) locais, condução intranodal e AP propagação pattern pode ser visualizado com precisão e investigada em detalhe. Além disso, átrios intactos parecem ser limitada por uma vista posterior, enquanto na preparação isolada, toda a superfície auricular está disponível para mapeamento óptico. Além disso, a preparação isolada auricular permite o mapeamento estrutural-funcional do átrio, resolvendo o complexo microestrutura da rede trabecular, como visto na Figura 4. Para isso, alta espacial (100 um / pixel ou superior) e temporal (2000 fps ou superior) resoluções deve ser usado porque é crítica para particularizar ambos os padrões de activação atriais e SAN, que pode ser ainda mais sobrepostas com estruturas correspondentes. Embora a resolução temporal 1000 fps pode ser um mínimo para reconstruir activação auricular (que tem a duração de 10-20 ms), 2000 fps deve ser considerada como uma resolução mínima temporal, para a condução intranodal (que tem a duração de ~ 5 ms e, assim, poderia ser perdida a menor resoluções) e SAN actmedições ivation como visto na Figura 4. Isto pode permitir a localização de arritmogênicas &quot;hot spots&quot; (tais como focos ectópica ou reentrada ancorado) durante fibrilação atrial / flutter que poderiam surgir a partir da sobreposição de regiões de remodelação funcional significativa com os de fibrose elevada e ou redução acoplamento / célula a célula. 21,22 Além disso, a abordagem descrita poderia ser usado para estudar mecanismos eletrofisiológicos de anormalidades SAN, incluindo blocos SAN saída, pausas, arritmias taquicardia-bradicardia, síndrome do nódulo sinusal, etc. Através da introdução de uma segunda (ou mesmo uma terceira) sonda fluorescente, será possível a realização de mapeamento óptico multi-paramétrico de actividade eléctrica em associação com o tratamento de cálcio, assim como outras alterações metabólicas e. Diferentes combinações de corantes pode ser utilizado para a tensão de cálcio-simultânea, raciométrica tensão / cálcio, ou imagiologia potencial mitocondrial. Para mapeamento óptico de alta resolução temporal, devido ao período de recolha de fluoróforo mais curto, os sinais de uma proporção mais fraca sinal-para-ruído pode ser apreciado. Portanto, um processo de transformação de média ser aplicada aos sinais do ritmo cardíaco sinusal ou os sinais de estimulação série, conforme necessário. O dF / dt max é detectada para cada sinal em um longo período de gravação. são então alinhados Estes pontos no tempo de activação. Um período de ajuste da gravação centrada em todos esses momentos é cortado e média de todas ou selecionado Aps, conforme necessário. Por utilização rigorosa da instrumentação e o procedimento de coloração adequada, parâmetros electrofisiológicos atriais, incluindo a velocidade de condução (comparar as Figuras 3C e 4D para mapas de activação S1), ritmo SAN espontânea e longevidade da preparação SAN (Figura 5) não são afectados, que permanece estável durante 3 ou mais horas. Importante, o monit contínuaORing de ECG devem ser realizados ao longo de todo o procedimento de coloração para assegurar a função eléctrica normal do coração. A aplicação de blebbistatin pode induzir uma diminuição da frequência cardíaca transitória, mas fora isso, não induz qualquer mudança na liderança de sites de marcapasso ou alterações na morfologia AP como também foi descrita anteriormente. 13 coloração da superfície da preparação atrial isolada é um passo crítico. Para isso, a aplicação rápida do corante diluída sobre a superfície do tecido deve ser evitada; em vez do corante deve cair sobre a preparação livremente, devido à densidade mais elevada de DMSO, que utilizado tanto para corante e diluições blebbistatin. A quantidade de carga total apropriada ea velocidade deve ser ajustada de modo a não induzir grandes mudanças de ritmo cardíaco. O processo de coloração pode ser aplicado várias vezes até que o sinal alcance um nível razoável. Deve notar-se que a aplicação directa da solução corante pode danificar o tecido e afectar a sua SAN pacemaking. Portanto, o corante deve ser diluído e a quantidade aplicada deve ser cuidadosamente controlada. Manchas na superfície apropriada não deve prejudicar a preparação ou SAN 23, que é avaliada pela freqüência cardíaca comparável e velocidade de condução. protocolos de coloração alternativas também devem ser considerados. Estes podem incluir qualquer um de 10-15 min superfusão do / preparação fibrilação SAN com o corante sensível à tensão (RH-237 ou di-4-ANEPPS) a 35 ± 1 ° C 10,19 ou 30 minutos de incubação da preparação à temperatura ambiente (20-22 ° C) numa solução de Tyrode contendo o indicador de sensíveis à voltagem. 11 Para o mapeamento óptico do SAN a partir do coração de Langendorff todo-perfundido, instrumentação passos importantes incluem a inserção do pequeno tubo no VE e o fecho de VPC e VCI. O ex-impede um aumento de pressão de congestionamento solução durante experimentos de longa duração, bem como i subsequentedesenvolvimento de isquemia após a supressão das contracções ventriculares por blebbistatin e acidificação da solução de perfusão. Este último permite que o RA para manter algum nível de pressão intra-atrial preenchendo assim o átrio com uma solução de perfusão e achatamento da região intercaval a fim de descobrir toda a área de SAN para mapeamento óptico. Finalmente, a coloração coronária, para além da superfície de carga de corante, pode melhorar significativamente a intensidade dos oaps SAN, que pode durar mais tempo quando comparada com a coloração da superfície pura utilizada em estudos anteriores. 8,9 Uso de blebbistatin tem várias vantagens em comparação com outros desacopladores electromecânicos incluindo baixa toxicidade, efeitos secundários menos pronunciada, e resistência à lavagem, quando ele é usado com precaução. Blebbistatin precipita quando é dissolvido a uma temperatura inferior a 37 ° C. 14 cristais blebbistatin pode interromper o fluxo vascular normal e, assim, induzir locaisisquemia e provocam eventos arrítmicos. 24 Além disso, em estudos que utilizam GFP ou outros corantes verde / amarelo, precipitação blebbistatin poderia ser confundido com células marcadas que devem ser tomadas em consideração. Prevenir blebbistatin precipitação é simples, isto é, tem de se dissolver em um blebbistatin pré-aquecido (37 ° C e media mais elevados) e vigorosamente agitada. Para analisar APD, uma elevada concentração de blebbistatin (até 10 uM) poderia ser utilizado. 13,14,25. Da mesma forma, se qualquer substância que aumenta a contracção são usados, a aplicação adicional de blebbistatin é recomendado. Como uma alternativa técnica para estudar a atividade elétrica do mouse SAN, array multi-eletrodo de baixa resolução (64 eletrodos separados em um quadrado de 8 x 8, configuração com uma distância inter-eletrodo de 0,55 mm) 26 e gravações de microeletrodos de vidro consecutivos feitos a curta distância entre impalements <s-se&gt; 17 são usados. Embora aqueles podem representar relativamente abordagens de baixo custo, ambos têm sérias limitações. Matrizes multi-eléctrodos têm uma cerca de 10 vezes mais baixa resolução espacial (são limitadas pelo tamanho físico dos eléctrodos de metal e a distância inter-eléctrodo e ter uma resolução de 550 uM / pixel versus até 50 uM / pixel para óptica mapeamento) e não pode ser utilizado para análise da morfologia AP ou para geração de imagens multi-paramétrico (tais como tensão simultânea e mapeamento óptico de cálcio). Embora gravações microeletrodos de vidro fornecer mais informações sobre a morfologia AP, incluindo os valores absolutos da AP amplitude e potencial de repouso, ele também é limitado por uma resolução espacial baixa. Portanto, só pode ser usado para localização estável do pacemaker líder e não é aplicável para capturar alterações batimento a batimento no local levando pacemaker. Ao mesmo tempo, como demonstrado anteriormente 3,20 e destacadas no presente estudo, a senior co SANnsists de um sinal de duas fases whichincludes tanto SAN e componentes miocárdio AP atriais (Figura 4B). Assim, torna-se difícil extrair um sinal de SAN puro e estimar com precisão a morfologia AP no SAN. Para este efeito, microeléctrodos de vidro 17 ou a abordagem pinça de corrente em miócitos SAN isoladas devem ser considerados.

Novel scientific breakthroughs that lead to leaps in the understanding of human physiology are often preceded by technological advances. Fluorescent optical mapping, for example, enables investigation of multiple physiological parameters in both cells and tissues.1,2 It significantly improved our understanding of how the anatomical structure is associated with electrophysiological functions and dysfunctions. In the heart, the natural pacemaker and conduction systems such as the sinoatrial node (SAN) and the atrioventricular junction consist of nodal myocytes that are insulated by the surrounding atrial myocytes.3-5 Such organization creates complex three-dimensional structures with specialized electrical properties. Both structural and functional remodeling of these pacemaker structures has been recognized to form significant electrophysiological heterogeneities.6,7 Understanding the mechanism underlying how such heterogeneities result in SAN dysfunctions and atrial arrhythmogenesis will dramatically benefit the clinical treatment of these diseases. It requires a technique to visualize the propagation of electrical signals at the tissue level, such as optical mapping. 
Recently, accumulating evidence has proven the advance of optical mapping in studies of atrial electrophysiology and pathology.2 However, novel and rigorous studies are dependent on the accurate interpretation of experimental data, whose validity and stability rely on careful experiment protocols. Genetically modified mice are extensively used for research as animal models of human diseases including sick sinus syndrome, pacemaker abnormalities and atrial arrhythmias.6,8-11 Thus, a combination of fluorescent optical mapping with transgenic mouse models provides a powerful tool to study cardiac electrical abnormalities associated with various pathologies. In this paper, we present a protocol for high-resolution optical mapping of the mouse SAN and atrium. Specifically, we discuss and compare different dye loading approaches, time effects on dye bleaching and heart rate stability during the experiment.

<table><tbody><tr><td>water jacket</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures</td><td></td></tr><tr><td>water bath / circulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>pressure amplifier</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Pressure transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen scissors&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostatic forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Iris forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)&amp;nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>in-line Luer injection port</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS camera&amp;nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>halogen lamp</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution optical mapping of the mouse sino-atrial node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Mapeamento óptica do SAN Intact do coração perfundido-Langendorff Um exemplo típico de um mapa de contorno activação RA reconstruída para o ritmo sinusal espontânea é mostrado na Figura 3 para um coração de rato perfundido de Langendorff-. O ponto de activação precoce está localizada dentro da região perto do intercaval SVC onde o SAN é definido anatomicamente. 3,16 mapas de contorno activação Dois RA adquiridos a 1,0 e 0,5 ms taxa de amostragem são mostrados na Figura 3B. Avaliar SAN funcionamento, medimos o tempo de recuperação SAN (SANRT). 9 Após a estimulação RAA durante pelo menos 1 min a 10-12 Hz, a estimulação elétrica foi interrompido e SANRT foi calculada como o intervalo de tempo entre a última AP capturado eo primeiro AP espontânea (Figura 3C). O SANRT foi corrigido para a frequência cardíaca (ie SANRT &lt;sub&gt; C) através do cálculo da diferença entre o SANRT e o comprimento do ciclo de base. Além disso, identificou-se a localização do primeiro marcapasso pós-estimulação. Para este exemplo, o SANRTc foi de cerca de 49 mseg. Ativação Atria e SAN isolado A activação da preparação atrial isolada durante o ritmo sinusal espontânea é mostrado na Figura 4A. Originou-se na anatomicamente definido SAN perto da SVC com uma frente de onda grande que se espalhou anisotropicamente todo o RA, com dois sentidos de condução preferenciais perto das bordas SAN superiores e inferiores e bloqueio completo para a direção do septo (marcadas em mapas de ativação na Figura 4A) . O mapa de activação adquiridos em 1 taxa de amostragem ms mostra uma extensa área de ativação precoce. Um aumento na taxa de amostragem de 0,5 ms e 0,3 ms permite identificar a área exacta da localização levando pacemaker. We observou-se uma típica, beat-to-beat posição monofocal estável do pacemaker líder, que correspondeu à região do marcapasso primário previamente caracterizados eletrofisiologicamente por microeletrodos de vidro 17 e mapeamento óptico 8-11,18,19, bem como por imunomarcação para connexin45 e HCN4 . 6,16 Como demonstrado anteriormente, o potencial de acção óptica SAN consiste num sinal de duas fases que inclui dois componentes distintos: o componente SAN subindo lentamente e o movimento ascendente rapidamente crescente do miocárdio auricular (componente atrial) (Figura 4B) 20 Devido à dispersão de luz. processos, OAP representa uma actividade eléctrica média resultante a partir de múltiplas camadas de células no interior do tecido. A profundidade e a largura de espalhamento é regida por uma constante de espaço, que é determinada pela luz e propriedades de dispersão e de absorção pode atingir até 1,5-2 mm. Devido à Condu SANatraso cção, a SAN AP sempre precede a atividade atrial durante a ativação fisiológica (Figura 4B). Para calcular a transição do SAN para o átrio (isto é, SAN tempo de condução, Sanct), utilizou-se quer o ponto de tempo em que o sinal de duplo componente SAN atinge 50% do componente de amplitude SAN, ou o primeiro pico dos dois-pico primeira derivada senior (df / dt). O Sanct a partir da área de activação mais rapidamente SAN para a AR foi ~ 5 mseg, semelhante à medida por microeléctrodos de vidro. SAN Tempo de recuperação Da mesma forma, o SANRT foi medido na preparação atrial isolada (Figura 4D). Para isso, as preparações foram atriais estimulado e regulado a 12 Hz através de um eléctrodo de estimulação localizada no canto do RAA durante pelo menos 1 min. 9 Para este exemplo, o SANRTc foi de cerca de 34 ms, o que é comparável com o medido no Langendorff-perfundidos coração (Figura 3C). Além disso, identificou-se a localização do primeiro marcapasso pós-estimulação. Heart Rhythm e fluorescente Signal estabilidade no tempo Se os procedimentos de carregamento de cirurgia e corante são seguidos de forma adequada, não deve haver qualquer mudança significativa nas características fisiológicas do átrio. Na Figura 5, apresenta-se o ritmo cardíaco medido antes e depois do procedimento de isolamento de fibrilação e durante a perfusão de 3 horas. Nenhuma mudança significativa da frequência cardíaca foram observados tanto durante o isolamento átrio ou após o carregamento do corante. Embora a coloração arterial pode necessitar de uma quantidade maior de corante, a estabilidade do sinal fluorescente no tecido da área de San parece ser melhor usando este método de carregamento. Na Figura 6, apresenta-se a intensidade de sinal deterioração ao longo do tempo, tanto para a coloração e a superfície coronária. em t<html> ele tecido SAN, IC 50 (o que indica o período em que a intensidade do sinal tenha falecido a 50%) é de cerca de 107 min após a coloração coronária, quase duas vezes, enquanto que a coloração de superfície. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig1.jpg" /> Figura 1:. O isolamento do auricular Preparação rato procedimentos cirúrgicos (A) realizada para isolar rato preparação fibrilação. A vista posterior do coração é mostrado. Todos os cortes são mostrados por linhas a tracejado vermelhas e marcado por números na ordem executada. Veja detalhes no texto. (B) O esboço esquemático do isolado do rato preparação fibrilação mostrando as principais características anatómicas, incluindo a estrutura trabecular do lado esquerdo e direito apêndices atriais, bem como a localização do nó sino-atrial (SAN; rotulada por uma oval cinzenta). Todas as abreviaturas são explicados na figura.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig2.jpg" /> Figura 2:. Sinais Sinais crus e processados gravados em 0,3, 0,5 e 1 ms / frame Raw são recolhidos a partir de um único pixel. Depois de 3 x 3 binning, os sinais são filtradas usando a low-pass algoritmo de Butterworth. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54773/54773fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig3.jpg" /> Figura 3: Mapeamento óptica total do coração do SAN (A) Esquerda, foto de uma preparação típica utilizada para o mapeamento do SAN a partir do coração intacto.. O quadrado azul mostra o campo óptico deview (6 mm por 6 mm). Certo, campo óptico de vista capturada através da câmera e sobrepostos com marcos anatômicos. SVC e IVC: cava superior e inferior cava; RAA: aurícula direita; RV e LV: ventrículos direito e esquerdo; PVs: veias pulmonares. Mapas (B) Cor de ativação contorno adquirido com 1.0 ms (esquerda) e 0,5 ms (direita) taxa de amostragem. À direita de cada mapa, a escala de tempo de cor correspondente indicando o tempo de ativação atrial (a partir do ponto de ativação mais antigo mostrado em azul, com o último ponto de ativação mostrada em vermelho) é mostrado. O mais antigo local de activação do átrio é marcado por um asterisco. (C) SAN tempo de recuperação (SANRT) medida na preparação de coração inteiro. Exemplos representativos dos mapas de contorno de activação atriais reconstituídas para o estímulo última estimulação (S1) e para o primeiro batimento atrial pós-estimulação (A1) são apresentados para os batimentos seleccionados no rastreio OAP representante no topo.Sites dos primeiros ativação atrial são rotulados por um asterisco. BCL:. Comprimento do ciclo básico <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54773/54773fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig4.jpg" /> Figura 4: De alta resolução de mapeamento óptico do mouse nó sino-atrial (SAN) a partir da superfície endocárdica do Isolated Atria (A) Fotografia de uma preparação SAN rato típico (6 mm x 6 mm) e seus mapas de contorno de ativação correspondente. obtido em 1,0 ms, 0,5 ms, 0,3 e taxas de amostragem mseg. SAN e uma zona de bloco vizinho são mostradas por setas. escalas de tempo de cor indicam o tempo de ativação atrial. O asterisco indica a localização do pacemaker líder. RAA: aurícula direita, SVC e INC: superior e da veia cava inferior, RV: ventrículo direito, AVJ: atrio-ventricul<html> junção ar, CT: crista terminalis, IAS: septo inter-atrial. (B) Mecanismo de os componentes duplos da gravação OAP da área de rato SAN. Veja detalhes no texto. . (C) OAPs gravados a partir do centro da área de SAN (azul), o mais antigo local de excitação atrial (verde) e o mais recente ponto de activação de RA (vermelho) Inserções: transição de nodal a forma de onda atrial com um tempo total de condução igual a 5 mseg. Compará-lo com o tempo de atraso para a activação total de RA igual a 11 ms. (D) SAN tempo de recuperação (SANRT) medido na preparação atrial isolada. Exemplos representativos dos mapas de contorno de activação atriais reconstituídas para o estímulo última estimulação (S1) e para o primeiro batimento atrial pós-estimulação (A1) são mostrados. Um local das primeiras activação auricular é marcado por um asterisco. BCL - comprimento do ciclo básico.k &quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig5.jpg" /> Figura 5: Heart Rhythm medidos antes e depois do procedimento de isolamento atrial (A) e durante a perfusão de 3 horas (B). (A) da frequência cardíaca batimento espontâneo é mostrado antes e após o isolamento atrial para dois tipos de coloração atrial: coloração da superfície após o isolamento (sem coloração coronária prévia) e coloração coronariana antes do isolamento atrial. (B) Espontâneo coração batendo estabilidade ritmo sobre a perfusão de 3 horas é mostrada das preparações não coradas atrial e para corante fluorescente e blebbistatin preparações atriais manchadas. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54773/54773fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig6.jpg" /> Figura 6:. A intensidade do sinal da deterioração com o tempo a intensidades de sinais de ambos os métodos de carregamento (carga coronária indicado em vermelho; e carregamento superficial indicada a azul) foram medidos e representados graficamente ao longo do tempo. As intensidades de sinal foram calculados a partir de uma área de 7 por 7-pixel em quatro locais típicos no átrio direito: trabecula (TREC), do nó sinusal (SAN), anexo átrio direito (RAA) e do seio coronário (SC). Os valores de IC50 foram calculados e rotulados em todas as curvas de decaimento. A decadência intensidade do sinal de ambos os métodos de carregamento foi semelhante em TRAB e RAA. O IC 50 de carregamento arterial no CS foi em torno de 20 min mais. No SAN, este valor para carregamento arterial foi quase duas vezes maior em comparação com a carga de superfície, o que indica que os métodos de carregamento arterial resultou em uma melhor estabilidade do corante nas tiss SANue ao longo do tempo. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54773/54773fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal.

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K visualizações.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health.  Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengenharia

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

Alta Resolução Mapeamento endocárdico e epicárdico óptico em um modelo de Ovinos de Stretch Induzida por Fibrilação Atrial

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Microscopia de folha de luz e limpeza de tecido para imagens cardíacas abrangentes

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Autor em destaque: Imagem de folha de luz personalizada para investigar estruturas miocárdicas em corações de roedores

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Resumo

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Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

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Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

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Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos