This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.

<ol>
	<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).</li><li>Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016)</li><li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coulter+principle:+foundation+of+an+industry.">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li><li>Ormerod, M. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

As etapas críticas, solução de problemas e limitações A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. Por isso, é da maior importância para seguir microscópio e protocolos de calibração de software associados da melhor forma possível. Isto inclui limitar o ruído de fundo, reduzindo partículas indesejáveis, capturando uniformemente imagens em foco brilhante e, e salvar em formatos de arquivo sem perdas, como TIFF. Assim, ambos os plugins são susceptíveis de produzir resultados errados se estes requisitos não são cumpridos. É, portanto, sempre uma boa prática para contagem de células Verifique para determinar se eles correspondem às expectativas visuais quando em Dupt. Se de fato os resultados não corresponderem, comparando a imagem original com a imagem binária pode ajudar a elucidar a questão (10,4 nota). Em alguns casos, mais escuras imagens ensaio de migração podem conter grandes áreas que foram contados devido a valores de pixels que caem dentro dos limites limite de cor. Em geral, usando uma imagem de Flatfield irá remover escuridão e blotchiness e evitar contagens mais indesejadas devido a irregularidades cromáticas. Dadas estas questões possíveis e relativamente comuns, é importante seguir as orientações integridade de imagem padrão, como os propostos pelo Grupo e outros Publishing Nature 13. Para manter a contagem consistente, qualquer ajuste a uma imagem devem ser aplicadas igualmente a todos os outros. Isto inclui, mas não está limitado ao contraste, a saturação, o brilho, o ganho, tais como filtros de média e nitidez, e os filtros de cor. Ajuste de gamma deve ser evitado, pois aplica uma alteração não linear da cor do pixel e assim pode afetar cada imagem diferentely 14. Ao aplicar-se um tempo de exposição comum para imagens com poucas células (&lt;1,000), isto pode conduzir a sobre-exposição e perda de fidelidade da imagem. Por outro lado, uma membrana com milhares de células pode exigir tempos de exposição mais elevados para evitar subexposição. Assim, é melhor prática para ajustar as imagens tão pouco quanto possível, e somente quando necessário, para manter a alta fidelidade de imagem possível. Mesmo com uma alta fidelidade imagem, verdadeiros contagens de partículas pode ser severamente distorcida por partículas indesejadas. Quando usando a calculadora celular Concentração, se uma amostra contém quantidades significativas de restos celulares, especificamente de áreas semelhantes às de células em suspensão, esta pode enviesar o resultado. Em alguns casos, isto pode impedir análise automatizada, se os detritos não pode ser minimizada. Da mesma forma, as membranas ensaio de migração que contêm níveis elevados de coloração da cor de fundo semelhantes a células coradas ou não removidas células da parte traseira da membrana, provavelmente produzirá iresultados nPrecisão. Estas partículas indesejáveis ​​podem normalmente ser removidos em algumas maneiras: aumentando o brilho de origem ou tempo de exposição de luz, modificar o limiar de cores para ser mais rigorosas, ou removidas manualmente via &#39;Abrir imagem com contagens &quot;(10.4). É importante notar que este protocolo produz a melhor qualidade de imagem necessária para CCC e TC para manter a precisão. No entanto, a TC é capaz de contar imagens de significativamente menos qualidade, ampliações diferentes, ou diferentes manchas de cor, geralmente somente exigindo mais tempo gasto em ajustes manuais (10.4). Durante a calibração de qualquer imagem membrana ensaio de migração, é importante levar em consideração a resolução da imagem e o tamanho relativo das células. Conforme descrito anteriormente, Qualidade de Imagem (Q) ea recomendação de Calibração (CR) são dependentes de métricas gráfico de frequência de área de partículas. Das imagens analisadas, cada célula ocupa, em média, 1 / 100.000 doárea total da imagem. Quando se utiliza apenas imagens de milhões de pixels, com uma relação de tamanho de célula pequena, a variação no tamanho das células também é pequena. Isto é, a variação apenas poderá variar 10-60 px. Mas à medida que a área da célula a relação de área de imagem torna-se maior, a distribuição dos tamanhos de célula aumenta, a redução da curtose de uma distribuição normal de tamanho de células, diminuindo a frequência de uma determinada área. Este por sua vez pode fazer cálculo automático de área celular mais difícil ou impossível porque uma área mínima definida não pode ser determinada. Da mesma forma, isso também se aplica a imagens com poucos números de células, onde a frequência de diferentes tamanhos de células pode ser muito baixa (&lt;50). Como resultado, quando a análise de imagens com diferentes resoluções que as utilizadas neste estudo ou diferentes distribuições do tamanho das células, pode ser necessário identificação manual da gama de tamanho de célula (10.3.3). Significado e Direções Futuras O ImageJ plug-in celular Counter foi inicialmente released em 2001 pelo Dr. Kurt De Vos e tem servido como um grampo para contagem de células manual para este dia. Para continuar a tendência de ferramentas disponíveis gratuitamente para a comunidade biológica, calculadora celular Concentração e contra ensaio de migração oferecem o próximo passo na ferramentas gratuitas para ajudar a aumentar a produtividade e reprodutibilidade inter-experimental de ensaios de migração. O resultado final de ensaios de migração é altamente dependente do número de células semeadas. Ergo uma contagem de células de confiança é uma necessidade para reprodutibilidade. Desta forma, CCC oferece tanto maior precisão, devido à maior certeza estatística de concentração de células e contagem de tempos mais curtos preservando a saúde das células. Além disso, o resultado final de ambos os encaixes é uma contagem do número de células e não um índice relativo, tais como fluorescência. Vários outros protocolos que existem fluorescência medida após coloração, mas estes métodos sofrem de falta de sensibilidade 13. Photoshop da Adobe oferece a sua própria análise de partículas tool mas o programa deve ser adquirido para uso e não oferece a análise pós-contagem disponíveis a partir da migração contador de ensaio 20. Ambos os plugins contar com o recurso de contagem de partículas de ImageJ e, consequentemente, pode ser modificado pelo usuário final, editando as macros usadas por ImageJ. Isto oferece maior flexibilidade para o usuário para expandir o escopo dos plugins para outras partículas, criando novas macros. Maior desenvolvimento para aumentar a amplitude de partículas contáveis ​​e incorporar contribuições dos usuários finais é o próximo passo lógico. Ao combinar os princípios fundamentais do contador de células com uma análise algoritmo de contagem e pós-contagem automatizada, o que aumenta consideravelmente a facilidade com que os ensaios de migração pode ser processado sem qualquer perda de precisão. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e 1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens 3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coulter tirar vantagem das células de resistência elétrica para determinar o número e tamanho das células. Eles são rápidos, precisos e mais baratos do que citómetros de fluxo. No entanto, eles raramente são usados apenas para contagem de células devido ao seu custo considerável em comparação com a contagem manual 3. Fluxo citómetros, por outro lado, são caros, mas eles têm muitas aplicações, tais como a contagem celular, análise da forma de células, rructure e célula de medição interna marcadores de 4,5. As máquinas que utilizam qualquer um destes dois princípios estão disponíveis de vários fabricantes. Contagem manual é acessível, mas demorado e sujeito a polarização, enquanto os métodos automáticos vêm com uma fracção do tempo requerido para a contagem manual, mas utilizando máquinas caras 6. Outros procedimentos de cultura de células são comum em ensaios de motilidade das células in vitro, isto é, a migração celular e invasão 7. Os ensaios de migração e invasão são comumente utilizados para investigar a mobilidade celular e capacidade invasiva, em resposta a uma resposta quimiotáctica. Além disso, eles são amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário, a diferenciação, a resposta inflamatória, e a metástase de vários tipos de células 7-11. As células que migraram ou invadem através da membrana porosa de um ensaio de migração pode ser quantificada de duas formas diferentes. Em primeiro lugar, por coloração das células com um corante fluorescente, de dissociação from a membrana, e a quantificação utilizando um leitor fluorescente 12. Uma limitação deste método de quantificação é que nenhuma ficha pode ser retida de membranas e não há nenhuma possibilidade para análise posterior 13. O segundo método de quantificação é de migraram / células a serem fixadas e coradas com corante fluorescente ou, mais comumente, com corantes citológicos como cristal violeta, toluidine corante azul ou hematoxilina invadidos; em seguida, as células são quantificados usando manualmente imagens microscópicas invertidos destas membranas que é uma tarefa demorada muito 12,13. Para ultrapassar os inconvenientes da contagem manual de células, foram desenvolvidos dois contadores de células automatizado fiáveis ​​e precisos para a concentração de células e para o ensaio de migração. Estes contra algoritmos celulares automatizados foram desenvolvidos para ImageJ como um plug-in utilizando a linguagem de programação Java da Oracle. ImageJ é uma ferramenta de processamento de imagem pública e amplamente utilizado, desenvolvido pelo Instituto Nacional de HeaLTH (NIH) 14,15; Assim, escrever esses plugins para ImageJ facilita a fácil integração com a comunidade biológica. Automatização de contagem de células garante alto rendimento e reprodutibilidade em relação à contagem manual. Embora outro software disponível e encaixes podem ser utilizados para calcular a concentração de células por meio de análise de imagem 5,16,17, celular Concentração de encaixe calculadora é rápido e pode também lidar com diluições de células e tratamentos. Além disso, todos os resultados e cálculos destes dois contadores podem ser salvos e exportados. Os dois encaixes descritos no presente documento são optimizados para o uso de um microscópio de contraste de fase para imagens de células vivas e grande campo de visão (toda a captura de membrana) de imagiologia para membranas ensaio de migração através do uso de um escopo de dissecação. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1175">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HyClone Classical Liquid Media: 
			RPMI 1640 - With L-Glutamine</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3002702</td>
			<td style="width:692px;">Cell culturing media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fetal bovian serum (FBS)</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">P00015</td>
			<td>Media suppliment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:240px;">HTR8/SVneo trophoblast cell line</td>
			<td style="width:124px;">Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen&#8217;s University, Kingston, Canada)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software is designed to work with any cell line.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">GIBCO BRL</td>
			<td style="width:119px;">27250-018</td>
			<td>Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA&#160; 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">Accutase</td>
			<td style="width:124px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">10 cm cell culture plates</td>
			<td style="width:124px;">SARSTEDT</td>
			<td style="width:119px;">833902</td>
			<td>Any tissue culture treated plates will be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0&#181;m Pore size</td>
			<td style="width:124px;">Costar 3422 ordered from Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7200150</td>
			<td>For 24-well plates; Pore size: 8.0&#181;m; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 &#38; 3</td>
			<td style="width:124px;">EMD Millipore and ordered from VWR</td>
			<td style="width:119px;">65044A, B, &#38; C</td>
			<td>Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles &#38; includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cotton Tipped Applicator</td>
			<td style="width:124px;">Puritan Medical</td>
			<td style="width:119px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Single-edge industrial razor blades</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411 - 055</td>
			<td>Thickness: 0.30 mm (0.012&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Microscope Slides - Precleaned/Plain</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550A3</td>
			<td>Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545E</td>
			<td>Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:240px;">Leica Stereo dissecting microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:692px;">The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD &#38; camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:&#160; LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 &#38; Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:124px;">Assistant Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.100 mm Depth - 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Olympus inverted light microscope</td>
			<td style="width:124px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:119px;">CKX41SF</td>
			<td>The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2&#160;&#160; 2.0 Megapixel CMOS Color Camera &#38; camera software is Infinity analyze Version 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Laminar flow cabinet 1300 Series A2</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 1375</td>
			<td>Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Model: 370</td>
			<td>Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:240px;">ImageJ</td>
			<td style="width:124px;">NIH</td>
			<td>Version 1.50e</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:240px;">Java Runtime Environment</td>
			<td style="width:124px;">Oracle</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.8.0_66</td>
			<td>Minimum version required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification and analysis of cell counting procedures using imagej plugins

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Calculadora celular Concentração A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" /> P-quadrado de um hemocitómetro tem um volume de 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) Dada esta constante, o volume total da imagem pode ser calculado após conversão de pixels para mm. Figura 1C é uma imagem contável ideal com em foco células exibindo a iluminação de fase característica e não graduações fundo hemocitômetro. Finalmente, o gráfico de dispersão dos Figure 1D mostra uma altamente correlacionada, manual ou de contagem automática de células a partir de 57 imagens tiradas ao longo de várias experiências e tipos de células, incluindo HTR8, ES-2, e Swan71. De nota, o intervalo máximo de concentração foi ~ 5,6 x 10 6 células / mL com uma extremidade baixa de ~ 2,3 x 10 3 células / mL (≈ 5 células por imagem). Sugere-se que se as contagens são abaixo 10-15 células por imagem, a amostra deve ser suspenso em um volume menor para aumentar o poder estatístico. Aquisição e processamento de imagens para as Migrações Ensaio Contador Centenas de membranas de ensaio de migração foram fotografadas ao longo de muitas experiências, todos os quais foram semeados com a linha de células de trofoblasto humano HTR8, Swan71, ou linha celular de cancro do ovário ES-2. Dessas imagens, múltiplos foram escolhidos para representar uma série de categorias de muito pobre a excelente qualidade com base no brilho, clareza e cor da stainecélulas d, e o grau de coloração de fundo e partículas indesejáveis ​​(ruído). Usando essas imagens, as definições de cor RGB limite padrão (≈ 150, 120, 0) foram determinados (Figura 2C) e usado como uma linha de base em todos os desenvolvimentos subsequentes do algoritmo. O objectivo era maximizar a cor nuclear a proporção total de cor, isto é, a maioria dos pixels coloridos deve estar dentro de núcleos celulares. O painel superior na Figura 2A representa o brilho ideal de imagem, célula clareza núcleos e cor, e insignificante ruído de fundo. O brilho da imagem é importante para garantir que há um grande contraste suficiente entre a célula e de fundo para produzir uma imagem binária a preto e branco. Se esta diferença não for cumprido, as áreas grandes ou imprevisíveis podem ser contados pelo ImageJ Analisar função de partículas; o melhor cenário é um fundo completamente branco. Em oposição, o painel inferior Fifigura 2A tem coloração de fundo extrema e células que são quase indistinguíveis. Membranas com este grau de coloração provavelmente irá produzir resultados pouco fiáveis ​​do contador de ensaio de migração. Em alguns casos, aumentar o brilho para o nível ideal pode afectar a fidelidade da imagem por overexposing a imagem. Da mesma forma, a alta exposição ou o brilho podem produzir efeitos cromáticos sistêmicos com regiões escuras luz progressiva ou irregular e. Com correcção Flatfield, estes efeitos podem ser minimizados ou totalmente removido como mostrado na Figura 2B (superior vs. painel inferior). Além disso, a correção Flatfield é uma boa maneira de equalizar o brilho de imagens múltiplas de membrana. Calibração e Validação de Migração Ensaio Contador Para ajudar os EUAer em melhor determinar se as imagens de membrana ensaio de migração cumprir os critérios exigidos para uma contagem precisa, dois qualificadores foram concebidos, a qualidade, designado por imagem (Q), e calibração recomendação (CR). É importante ressaltar que ambos os qualificadores, como o nome sugere CR, são apenas recomendações e atuam como guias em vez de juízes absolutos da responsabilização de cada imagem. Ambos Q e CR têm por base as métricas do gráfico de dispersão de frequência da área das partículas (10.3.2). Por razões de simplificação, uma métrica podem ser consideradas como as várias formas da curva que compõem o gráfico de frequência. A métrica desejada de um Q adequado (≥0.5) foi determinada pela distribuição normal aproximada observada do tamanho da célula. Geralmente, as células que são insolúveis entre si, sobre-coradas, ou apenas particularmente grande, a deslocar skewedness a uma distribuição normal com cauda à direita (Figura 3B). Como tal, esta é a métrica ideal de uma imagem calibrada típico. Coma adição de ruído de fundo, isto normalmente conduz a um grande número de partículas na gama de 1-5 área pixel (Figura 3A). A fim de calcular as métricas de enredo, os dados estão equipados com dez Savitzky-Golay curvas suavizadas de diferentes graus polinomiais produzidos pela Biblioteca Java Científico do Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Essencialmente, isso cria vários pontos da região aproximada de cada extremo. Através de uma série de mapas de cluster densidade de mínimos locais e máximos, um quadro geral das métricas de enredo pode ser computado como uma lista ordenada, ou seja, mínimo, máximo, mínimo / máximo sobreposição, ..., n º extremo. Em breve, o grau em que as curvas suavizadas ajustar os dados de frequência determina quão firmemente embalada os extremos são pontos. Quanto maior a agregação de extremos não sobrepostos, maior se torna Q. Em teoria, Q representa clareza geral da imagem com base em tele distribuição de tamanhos de partículas distintas. Se o booleano CR é verdade ou não depende da seqüência de Extrema. A partir da Figura 3A, a lista ordenada seria mínimo, o máximo, e uma sequência de sobreposição de extremos com base nas propriedades da curva Savitzky-Golay. Desde Figura 3A representa uma imagem não calibrada, esta sequência geral de bandeiras Extrema CR como verdadeiros, sugerindo ao utilizador que a imagem pode precisar de calibração. Movendo-se para a frente, pode ser visto que a partir da Figura 3B, esta lista seriam idênticos, mas com a exclusão do primeiro mínimo. Assim, foram determinadas as métricas de imagens não calibradas e calibrado ideais. Desvios destas métricas geralmente sinalizar uma imagem para a calibração e reduzir Q ≤ 0, como é o caso com a membrana de ruído de fundo elevado na Figura 3C. Aplicando estes qualificadores para uma seleçãode modesto para excelentes imagens, com relação à luminosidade e ruído de fundo, é claro que a contagem de imagem calibrados são significativamente mais perto de contagens manuais que não calibrada (1,9% ± 0,3 vs 21,7% ± 2,9, respectivamente; Figura 3D, E). Dada a elevada qualidade geral das imagens escolhidas para análise (não calibrada <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0,71 ± 0,04; significa ± SE), houve um aumento modesto esperado somente em Q após a calibração ( <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0,90 ± 0,04). Tomados em conjunto, Q sugere o potencial global responsabilização de uma imagem enquanto CR é um forte indicador de que a calibração for bem sucedida ou não. Cronometrando comparações de ambos contador de células Concentração e Migração Ensaio Contador <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Dois pesquisadores (Utilizador 1 e Utilizador 2) foram usados ​​para testar as comparações de velocidade entre os métodos manuais e automatizados. Ambos os pesquisadores tinha experiência substancial com contagem de células e ensaio de migração, mas User 1 foi experimentado no uso de ambos CCC e TC, enquanto o usuário 2 tinha de seguir instruções escritas. Figura 4A compara tempo de calibração CCC entre User 1 e 2. Como esperado, User 1 foi substancialmente mais rápido do que o usuário 2, em conjunto, levando em média cerca de cinco minutos para a calibração do CCC. A fim de comparar contagem em hemocitómetro manual e automatizado taxas, a taxa de contagem manual usando um contador de contagem foi comparado com o tempo que levou a tomar nove imagens da câmara de hemocitómetro e contados em CCC (Figura 4B). Uma concentração típica de células de 1,15 x 10 6 células / ml foi usada para comparar intervalos, levando a uma média de aumento na taxa de transferência 1x. Esta taxa pode variar dependendo do número de células carregadas nohemocitómetro como o tempo total necessário para capturar imagens e processá-los é independente do número de células. Por último, os horários que abrangem a aquisição de imagens de membranas, quantificação dentro de TC e ajustes manuais destas imagens foi medida na Figura 4C. Notavelmente, 12 membranas ensaio de migração com baixo número de células (Total = células 10.571) e coloração de fundo substancial e restos celulares foram escolhidas para facilitar o pior cenário que exigiria ajustes manuais número de células. Isso se reflete no ajuste Figura 4C coluna (ADJ) onde ele teve uma média de 13 min para remover as contagens indesejadas e adicionar células perdidas. Para comparação com contagem manual, as taxas de contagem de células óptimas foram determinadas com contador de células; imagens de membrana de alta qualidade com elevada densidade celular foram usadas (resultados não mostrados). Isto rendeu uma taxa máxima média entre User 1 e 2 de 9,1 x 10 3 células / h(~ 2,5 células / s). Utilizando estes números, as membranas a partir de Figura 4C foram contadas 4,4 vezes mais rápido com o CT do que seria esperado a taxa máxima Manual. A economia de tempo são directamente dependentes do número de células e qualidade de imagem, contando membranas de migração que exigiam pouca ou nenhuma adaptação e alta densidade celular (~ 7.000 células / membrana), TC gerado contagem de células 1,395x mais rápido do que a taxa de manual de máxima. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig1.jpg" /> Figura 1: Calculadora Concentração celular. Micrografia de contraste (A) Fase da praça principal central do hemocitômetro tomada em 40X total. A barra de escala representa 200 fim. (B) A versão da imagem recortada de (A) que descreve o que o comprimento para medir a hemocitômetro. A coluna Comprimento janela de resultados foi destacada para fácil identificação. barra amarela= 1 mm. (C) Uma micrografia ideal de um hemocitômetro contendo células HTR8 após microscópio e software de calibração em 40X ampliação total com uma resolução de 1.600 x 1.200 px. Barra de escala = 200 pm. (D) Um gráfico de dispersão comparando contagens manuais usando o contador ImageJ plug-in celular em comparação com a contagem automatizada de as mesmas imagens que usa a calculadora celular Concentração. n = 57 imagens. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig2.jpg" /> Figura 2: Ensaio de Migração contrariar imagens representativas. (A) O painel superior é uma parte de um oitavo de um total de membrana que descreve uma imagem ideal com fundo mínima; Barra de escala = 200 pm. opainel inferior contém uma imagem com significativa coloração de fundo que afeta gravemente a precisão da contagem automática; Barra de escala = 585 pm. (B) O painel superior representa uma imagem escura de boa qualidade que produziu contagens imprecisas. O painel inferior é uma versão contáveis ​​da mesma imagem após a correcção Flatfield. Barras de escala = 593 pm. (C) O painel superior representa uma vista ampliada em de uma membrana típica. O painel inferior é a mesma imagem seguido pela thresholding cor desejada ImageJ (RGB Limiar = 150, 120, 0) para remover o fundo intercelular e a maioria do citoplasma visivelmente manchadas. Todas as imagens foram tomadas em 1.35X total de ampliação com um escopo de dissecação calibrado com uma resolução de 2.592 x 1.944 px partir de múltiplas invasões ensaio de migração de HTR8 corados com hematoxilina. Barras de escala = 100 pm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para vie</a>wa versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig3.jpg" /> Figura 3: Calibração e validação de ensaio de migração c ounter. (A) Um exemplo típico de uma imagem não calibrada de alta qualidade. (B) A versão calibrada de (A) usando Recount migração do contador de ensaio&gt; &#39;Tamanho sugerido&#39;. (C) Um gráfico de frequência típica de uma membrana de baixa qualidade de imagem com mancha de fundo significativa ou escuridão total. (D) Um gráfico de dispersão comparando a contagem manual usando o ImageJ Contador plug-in celular e migração contador ensaio contagens automatizadas. (E) Um gráfico de barras que mostra a diferença percentual média de calibrado contra contagens automatizadas não calibrados. Os dados são média ± SE. P &lt;0,0001, n = 30, teste-t não emparelhado com Corre de Welchcção. As mesmas imagens foram utilizadas para D e E. Calibração de ambos foi feito com o Recount&gt; &#39;Tamanho sugerido &quot;e Recount&gt;&#39; Configurações manuais &#39;para refinar ainda mais o tamanho mínimo contados e limite de cor. Nenhum ajuste contagem manual foram feitas usando o &quot;Abrir imagem com contagens &#39;função. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig4.jpg" /> Figura 4: Tempo de contador de células Concentração e uso contador ensaio de migração. (A) A comparação dos tempos de calibração CCC (etapas 1 e 2) entre User 1 (CCC / expert TC) e User 2 (CCC / TC iniciante). (B) tempos de contagem de células manual foram em média ao longo de cinco ensaios e expressa em células contadas por min. automatic contagens foram calculados por vezes em média para capturar nove imagens de uma câmara de hemocitômetro e contou com CCC. A concentração celular foi usado ~ 1,15 x 10 6 células / ml. Os dados são média ± SE. n = 5. (C) Transwell Contador horários foram comparados mais de três categorias: aquisição (ACQ; as etapas 7 e 8), a quantificação (QNT; passos 10.1-10.3.3 usando definições de configuração padrão) e ajuste manual (Adj; passos 10,4 -1.4.2). As membranas quantificados tinha um elevado grau de coloração de fundo e detritos, a fim de necessitar de ajuste manual substancial para contagens precisas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54719/54719fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

46.7K visualizações.  York University. This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Vídeo: Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biologia

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Protocolo de varredura do relógio para análise de imagem: plugins ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

Detecção e Análise Automatizada de Exocistose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...