Queremos agradecer especialmente Monique Nenniger Tosato por sua excelente suporte técnico, bem como Jean-Yves Chatton para seus conselhos científicos ea imagem plataforma CIF da UNIL para o equipamento de microscópio. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation suíço.

1. Dissecção da VNO do mouse <ol><li> Use ratos adultos. Como feromônio de sensoriamento está implicado em multimodalities, cuidadosa distinção entre as linhagens, os genótipos, sexos e idades é importante e vai influenciar os resultados. Aqui, escolhemos ratos adultos VG 30 anteriormente utilizado para a identificação de um par receptor de feromônio-(2-heptanona-V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Antes de iniciar a dissecção, prepare limpa e fria fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO 3 mM 25, D-Glicose 10 mM, KCl mM 2, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturado com oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). Para isso, misturar todos os componentes, exceto ACSF CaCl 2. Saturar a solução diretamente borbulhando com oxycarbon. No final, adicione o CaCl 2 e ajuste com DDH 2 0 para o volume desejado. Manter a solução ACSF em gelo até use. </li><li> Eutanásia do mouse deve ser preferencialmente feito por deslocamento cervical ou por inalação de CO 2, pouco antes do experimento. </li><li> Cortar a cabeça de rato. Colocá-lo sob um microscópio de dissecação em ACSF frio continuamente oxycarbonated. </li><li> Cortar o maxilar inferior e posição da cabeça, a fim de visualizar o palato (Figura 1B). </li><li> Faça uma incisão horizontal na parte superior do palato (Figura 1B) com uma tesoura micro e remover a membrana paladar com micro pinças de dissecação. Hidratar e limpar a cavidade exposta com ACSF (Fig. 1C). </li><li> Corte a parte superior ea parte inferior do septo nasal (Fig. 1C). Delicadamente extrair o septo nasal contendo o VNO e colocá-lo diretamente no ACSF no gelo (Figura 1D). </li><li> Separadas verticalmente as duas partes do VNO usando micro pinças de dissecação e delicadamente retire a cápsula cartilaginosa do VNO (Fig. 1E). Certifique-se de que todas as peças cartilaginosas são removidos. </li></ol> 2. VNO preparação fatia do tecido O VNO preparação fatia do tecido descrito nesta seção 2) deve-se principalmente para as investigações de imagens de cálcio. Fatias VNO pode também ser usado para immunohistostainings em fatias flutuante para verificar a integridade estrutural do tecido (ver secção 3) do protocolo). <ol><li> Prepare ponto de fusão baixo agar (3% no padrão PBS) e seu local de trabalho. Você vai precisar de ACSF, um micrótomo e suporta, micro pinças de dissecação, a incorporação de moldes (22 x 22 x 20 mm), toalhetes de precisão, escovas, placas de cultura de tecidos, cyanacrylat cola, gelo e um termômetro. </li><li> Encher o molde com a incorporação de 3% agar ponto de fusão baixo. Certifique-se que a temperatura não é maior do que 41 ° C antes de colocar na vertical do VNO logo enxugou (Fig. 2A) para ser capaz de obter cortes coronais. </li><li> Coloque o molde de incorporação no gelopara 1 min, até a solidificação e depois separá-lo do bloco de agar. Cortar o bloco de ágar-ágar numa forma piramidal e colocá-lo com cola com o apoio micrótomo (Fig. 2B). </li><li> Cortar fatias coronal VNO com o micrótomo, com uma velocidade de 0,5 mm / s, uma amplitude de 0,7 mm e uma espessura de 100 mm em ACSF frio e recolher as fatias de tecido com um pincel antes de colocá-los em uma placa de cultura de tecido cheio de frio ACSF. </li><li> Se o seu fatias contêm fluorescência endógena como GFP (em gene-alvo os neurônios), você pode selecioná-los sob um estereomicroscópio fluorescente (Fig. 2C). </li></ol> 3. Imunohistoquímica em fatias VNO flutuante O objetivo deste procedimento é para verificar a integridade das fatias de tecido VNO obtidos na seção 2). Tubulina-acetilado é um marcador de microtúbulos / citoesqueleto expressa em dendritos e microvilosidades de neurônios sensoriais VNO. Para experimentos com imagens de cálcio, vá direçãoqüentemente a seção 4) do protocolo. O método immunohistostaining em fatias flutuante VNO pode ser adaptado para a avaliação da expressão de qualquer proteína de interesse. Para este fim, recomendamos que você corrigir o VNO por 1h a 4 ° C em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) após o ponto 1.7) do protocolo e usar a partir deste ponto em PBS pH 7,6, em vez de ACSF solução. <ol><li> Na placa de cultura de tecidos, corrigir o seu fatias de interesse em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C. </li><li> Bloco fatias seu tecido durante a noite a 4 ° C em uma solução de PBS contendo NGS (soro normal de cabra) 10% e triton X-100 a 0,5%. </li><li> Incubar as fatias com o anticorpo primário (anti-acetilado-tubulina, Mouse, 1:2000) por 16h em temperatura ambiente (RT) em uma solução de PBS contendo NGS 5% e Triton X-100 em 0,25%. </li><li> Lavar 3 vezes por 5 minutos com uma solução de PBS contendo 2% NGS. </li><li> Incubar no escuro com o secoanticorpo ndary (Cy5 conjugada Goat anti-mouse, 1:200) em uma solução de PBS contendo 2% NGS por 1h em temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 vezes durante 5 minutos com PBS contendo NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS apenas. </li><li> Monte seu fatias em uma mídia fluorescentes de montagem (contendo ou não DAPI), colocando-os no centro das zonas delimitadas hidrofóbica (use uma caneta hidrofóbica) e cubra com as fatias de lamelas. </li><li> Fazer observações e aquisições com microscopia confocal e um software que permite reconstruções em 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Imagem de cálcio em fatias VNO <ol><li> Os procedimentos a seguir terá lugar no escuro. Fatias incubar VNO por 1h a 37 ° C em uma solução de carregamento composto por ACSF frio com Fura-02:00 (7 mM; solução estoque de 1 mM em DMSO) e 0,1% PLURONIC (w / v, solução estoque em 20% em DDH 2 O). </li><li> Manter as fatias carregado no gelo com oxycarbonation até o uso. Fatias carregado pode ser mantida por3-4h. </li><li> Coloque as fatias carregado com um pincel em uma câmara de perfusão contendo ACSF e manter as fatias com uma âncora fatia do tecido (Fig. 3A). </li><li> Coloque a câmara de perfusão no palco de um microscópio de imagem de cálcio (Fig. 3B) e continuamente perfundir com ACSF oxycarbonated na RT. Temperatura pode ser adaptado com o uso de um controlador de temperatura bipolar. </li><li> Observações das fatias carregado VNO (Fig. 3C-E) são realizadas com um microscópio invertido de fluorescência, com um objetivo 25x ou 63x e uma câmera SNAP-HQ CooL. Iluminação é feito sequencialmente (340/380 nm) com um instrumento policromador e gravadas a uma taxa de 5Hz. Emissão filtrada é feito em 510 nm. Alterações de cálcio intracelular ratio (ΔF = 340 nm/380 nm) são monitorados com um software apropriado. </li><li> Chemostimulation devem ser selecionados de acordo com sua própria finalidade experimental. Aqui, perfusões de ACSF contendo um feromônio mix (isobutylamine, 2-heptanona, 4-heptanona, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farneseno, 10 -6 M), 2-heptanona (10 -6 M) ou recém-coletados masculino e feminino (1: 1) urina do rato (1:100) são realizados 32. Perfusão da ATP (125 M) é usado como um teste de viabilidade no final dos experimentos (Fig. 3F) e deve indicar uma proporção de aproximadamente 80% neurônios viáveis. Sob essas condições, as fatias podem ser utilizados até 2 horas. </li><li> Subpopulações GFP-tagged dos neurônios sensoriais são visualizados através de iluminação específica (neste caso, os neurônios V1rb2 expressando) e podem ser analisados ​​com precisão (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Resultados representativos: Para estabelecer um ensaio funcional para investigar a transdução de várias vias de tomar lugar no VNO mouse, ou para identificar novas feromônio receptor-pares, aproveitamos o mouse VG linha (Fig. 1A </strong&gt;). Nesta linha, um de 240 receptores V1Rs, o receptor é V1Rb2 GFP-tagged permitindo a fácil visualização de uma subpopulação particular de neurônios sensoriais vomeronasal. Após a extração e dissecção da VNO (Fig. 1E), nos preparamos fatias aguda VNO (Fig. 2C). Fixamos uma fração deles, a fim de verificar e validar a integridade tissular da preparação através da realização de immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado (Fig. 2D-F). A outra fração das fatias é usado para experimentos com imagens de cálcio. Para isso, as fatias são carregados com Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e do nível de cálcio intracelular de cada neurônio é monitorado como uma relação ΔF (Fig. 3F). Viabilidade dos neurônios é avaliada pela perfusão da ATP (125 mM), após o que aumento rápido e transitório da relação ΔF é esperado (Fig. 3F). Urina sendo uma importante fonte de feromônios, a perfusão de frescoly urina do rato coletados (1:100) é usado como um controle endógeno. Ele dispara transientes de cálcio em aproximadamente 50% dos neurônios registrados (célula 1 e 2, fig. 3F). GFP sob iluminação, V1Rb2 neurônios positivos são observáveis, e perfusão de seu ligante conhecido pheromonal, 2-heptanona, inicia a ativação celular (célula 1, fig. 3I). Curiosamente, ativações neuronais também são observáveis ​​em uma fração de neurônios que não expressam o receptor V1Rb2 (neurônios GFP negativo) (célula 2, fig. 3I), demonstrando a complexidade do feromônio de codificação no VNO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção do órgão vomeronasal do mouse. (A) do mouse A partir da linha de VG. (B) Após a eutanásia do mouse, a cabeça cheia é colocado sob um microscópio binocular e da mandíbula inferior é removida, a fim de visualizar o paladar. Uma pequena incisão horizontal é feita(Linha tracejada preta). (C) Após a remoção do palato, o septo nasal alinhado com o VNO é cortada na parte superior ea parte inferior (branco linhas tracejadas) para facilitar a extração VNO. (D) O VNO é posicionado em solução ACSF e separados (inserir: Vista poder maior das duas partes). (E) A cápsula cartilaginosa do VNO é delicadamente removida eo VNO sem sua cápsula cartilaginosa é utilizado para o resto dos experimentos. Barras de escala são: BE, 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figura 2. Rato vomeronasal preparação fatia aguda e integridade tissular. (A) O VNO mouse é verticalmente integrado em uma solução ágar 3%. A temperatura do ágar deve ser inferior a 41 ° C. (B) O bloco de agar é cortado em forma piramidal e 100 seções M VNO (linha tracejada preta) são gerados em ACSF. (C) fatias VNO pode ser selecionado em um estereomicroscópio fluorescentes, a fim de visualizar uma específicapopulação de tag neurônios sensoriais. (DF) Integridade Tissular pode ser avaliada por immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado, uma visão maior potência do gene-alvo V1rb2 neurônios demonstrar a perfeita conservação da preparação. Neurônios com seus dendritos de longo alcance a superfície do lúmen (E), bem como a expressão da proteína estrutural nos botões dendríticas e microvilosidades podem ser observados (F). Barras de escala são: B, 5 mm; C, 60 mm; D, 40 mm; EF, 20 mM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figura imagens de cálcio 3. E detecção de feromônio no vomeronasal fatias de tecido aguda. (A) Depois de um Fura-2:00 fase de carga, fatias VNO são colocados em uma câmara de perfusão e são mantidas com uma âncora adaptado (vista de alta potência). (B) Os experimentos são realizados no escuro e fatias VNO são continuamente perfundidos com ACSF de RT com um sistema de vácuo. A temperatura pode ser chosen usando um sistema controlador de temperatura composto por um elemento Pelletier bipolar e uma sonda térmica. Essa experiência foi realizada em temperatura ambiente. (CE) fatias VNO são observáveis ​​sob contraste de fase Hoffman (C, Hv) ou iluminação nm Fura 380 antes (D) e durante a ativação neuronal (E, aqui com ATP). (F) a viabilidade neuronal é avaliada com perfusão de ATP (125 mM). Aqui, chemostimulation é feito com urina (urina, 1:100) ou com uma mistura de feromônios mouse (ph mix., 10 -6 M) a uma vazão constante de 165 ml / h. Níveis de cálcio intracelular (ΔF) podem ser gravadas individualmente para cada célula (Cell 1-3). (G) Um neurônio V1Rb2 é visualizado sob iluminação GFP (1). (H) O carregamento deste neurônio (1), bem como um neurônio não expressar V1rb2 (2) é mostrado. (I) O neurônio V1rb2 é capaz de responder a 2-heptanona com um aumento de cálcio intracelular. Este neurônio não V1rb2 especial expressando também responde a 2-heptanona (célula 2). Barras de escala são: CE, 20 mm; GH,15 mm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Duração da aplicação do estímulo é indicado por barras em cada traço. A escala de cores arbitrárias representa a intensidade de fluorescência.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de imagem de cálcio apresentado aqui permite gravar, em uma preparação fatia aguda, as respostas dos neurônios de rato pheromonal VNO. Com esta abordagem, a dissecção do animal para os neurônios vomeronasal é, com alguma prática, facilmente alcançável e oferece uma preparação de tecido de longa vida. Ele permite demorado experimentos como estudos farmacológicos ou o estudo de codificação pheromonal. Com esta técnica fisiológica, grandes populações, bem como precisa subpopulações neuronal pode ser analisado especificamente. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado às abordagens imuno-histoquímica ou experimentos com base em corantes de cálcio outros. O uso destas metodologias combinadas certamente irá permitir a identificação de novos ligantes pheromonal para os quimiorreceptores muitos órfãos expressas no órgão vomeronasal do mouse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-trifosfato dissódico solução salina (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Preferencialmente por imuno-histoquímica </td></tr><tr><td> Agar (ponto de fusão baixo) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Preferencialmente para imagens de cálcio </td></tr><tr><td> CL-100 Controlador de Temperatura Bipolar </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 115-175-071 </td><td> Proteger da luz </td></tr><tr><td> DMSO (dimetil sulfóxido) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação de moldes, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescentes de montagem de mídia (Vectashield com DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Proteger da luz </td></tr><tr><td> Glisseal N (graxa de vácuo, 60 g) </td><td> Chemie Borer </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de gravação grande banho (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software para criação de imagens de cálcio; v.7.6.5.0) </td><td> Sistemas Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal anti-tubulina acetilam,d anticorpo do rato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normais de cabra soro (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de câmaras (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> PLURONIC F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (frasco dosador, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 aquecedor Solução Dual In-line / Cooler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Âncora fatia (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PEN PAP (hidrofóbicoscaneta) </td><td> Pelco Internacional </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrando blade micrótomo VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome policromador sistema de alta velocidade </td><td> Sistemas Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Visualização de Dados (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Software Científico </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson e Lüscher Martin usou o termo feromônio pela primeira vez em 1959 para descrever um produtos químicos utilizados para a comunicação intra-espécies. Feromônios são voláteis e não-voláteis de curta duração moléculas secretadas 2 e / ou contidas em fluidos biológicos 3,4, como a urina, um líquido conhecido por ser a principal fonte de feromônios 3. Comunicação pheromonal está implicado em uma variedade de modalidades de animais chave, tais como interações familiares 5,6, organizações hierárquicas 3 e 7,8 interações sexuais e são, consequentemente, diretamente correlacionado com a sobrevivência de uma dada espécie 9,10,11. Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (VNO) 10,12, uma estrutura pareada localizada na base da cavidade nasal, e fechado em uma cápsula cartilaginosa. Cada VNO tem uma forma tubular com um lúmen 13,14 permitindo o contato com o externomundo químico. O neuroepitélio sensorial é composto principalmente de neurônios sensoriais bipolares vomeronasal (VSNs) 15. Cada VSN estende um único dendrito para o lúmen que termina em um botão dendríticas grande influência até 100 microvilosidades implicados na detecção química 16. Subpopulações de numerosos VSNs estão presentes. Eles são diferenciados pelos quimiorreceptores eles expressam e, portanto, possivelmente pelo ligante (s) que reconheçam 17,18. Duas principais famílias receptor vomeronasal, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, são compostas respectivamente por 240 e 120 23 24 membros e são expressos em camadas separadas do neuroepitélio. Receptores olfativos (ORs) 25 e receptores de peptídeos formil (FPRs) 26,27 também estão expressos em VSNs. Ou não essas subpopulações neuronais use o caminho downstream mesmo sinalização para feromônios de sensoriamento é desconhecida. Apesar de um papel de destaque desempenhado por um cálcio permeável canais (TRPC2) presentes na microvilosidades de neurônios maduros TRPC2 28 canais de transdução independentes têm sido sugeridas 6,29. Devido ao elevado número de sub-populações neuronais ea morfologia peculiar do órgão, investigações farmacológicas e fisiológicas dos elementos de sinalização presente no VNO são complexas. Aqui, apresentamos uma preparação fatia aguda do tecido do VNO do mouse para a realização de exames imagiológicos de cálcio. Esta abordagem permite observações fisiológicas, no ambiente natural de um tecido vivo, de subpopulações geral ou individual de VSNs previamente carregado com Fura-02:00, um corante de cálcio. Este método também é conveniente para estudar qualquer GFP-tagged receptor de feromônio e é adaptável para o uso de outras sondas fluorescentes de cálcio. Como exemplo, usamos aqui um rato VG linha 30, em que a tradução do receptor de feromônio V1rb2 está ligada à expressão de GFP por uma estratégia polycistronic. </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K visualizações.  University of Lausanne. Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Vídeo: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...