This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li><li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening.">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li><li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells:+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways.">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li><li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line.">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li><li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress.">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li><li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells.">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li><li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity.">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li><li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function.">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).</li><li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents.">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li><li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines.">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li><li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse.">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li><li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis:+in+vitro+and+in+vivo+evidence.">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance.">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necrosis:+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells.">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li><li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+necrosis:+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways.">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li><li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation.">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li><li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+signaling+of+the+Fas+receptor:+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways.">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li><li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin's+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events.">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat.">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li><li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+Oxygen+Tension:+Relation+to+Blood+Flow+and+Function.">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li></ol>

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos. Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha celular, que trabalha com células HEI-OC1 requer uma instalação de cultura de células, devidamente equipado, com um gabinete de certificado biológica de segurança, numa centrifugadora refrigerada, um banho de água, e um microscópio invertido para o exame de culturas de células e para a contagem de células se utilizando técnicas hemocytometric. Uma exigência única, no entanto, é a disponibilidade de dois incubadoras humidificadas, um conjunto a 33 ° C / 10% de CO 2 por células P-Hei-OC1 e outro a 39 ° C / 5% de CO 2 por células NP-Hei-OC1s. Se os estudos de envolver previstas apenas as células P-Hei-OC1, segundo a incubadora pode ser fixado em 37 ° C / 5% de CO 2 para ensaios diferentes. O uso de placas de cultura de células de plástico é um importante requisito adicional para trabalhar com células HEI-OC1. De fato, as células HEI-OC1 são muito robusto e eles vão crescimento superfícies diferentes e sob condições muito diferentes. No entanto, seu fenótipo e sua resposta a drogas e outros estímulos dependerá fortemente os parâmetros de cultura (G Kalinec &amp; F Kalinec, não publicado). Como discutimos em um artigo anterior 8, essa plasticidade das células HEI-OC1 podem ser vantajosamente usados ​​para projetar novas experiências. Por exemplo, sabe-se bem que a tensão de oxigénio na perilinfa coclear é muito menor (~ 2 kPa) do que numa incubadora típica ao nível do mar (~ 21,3 kPa) 27. Incubação de células HEI-OC1 em baixa concentrações de O 2 irá mudar suas respostas, talvez tornando-os um modelo melhor para auditoriacélulas sensoriais ORY. Deve ser enfatizado que os protocolos descritos para a cultura e a subcultura de células HEI-OC1 também pode ser utilizado com outras linhas de células auditivas desenvolvidos no nosso laboratório a partir do mesmo ratinho transgénico, tais como OC-K3 do órgão de Corti e 11,12 SV -k1 da estria vascular 13,14. Além disso, estas linhas celulares podem ser úteis como controlo para células HEI-OC1 em experiências seleccionadas. Por exemplo, temos usado recentemente células SV-K1 para demonstrar que a imunorreactividade inversamente proporcional ao prestin e anticorpos Na + K + ATPase na membrana plasmática de células HEI-OC1 foi a resposta dependente do tipo de célula em vez relacionado com o ratinho transgénico a partir de que estas células foram derivadas 9. Outro requisito essencial para trabalhar com células HEI-OC1 é a prática de técnicas de assepsia adequadas, tais como limpeza de todas as superfícies de trabalho dentro do gabinete de segurança, com 70% eThanol ou isopropanol e a descontaminação de todos os materiais necessários para os procedimentos. No entanto, enquanto que outras linhas de células de mamífero são frequentemente protegidos contra contaminação bacteriana inadvertida pelo uso de penicilina-estreptomicina ou outras combinações semelhantes, antibióticos nunca deve ser utilizado com células HEI-OC1 excepto se o objectivo do estudo é investigar os seus efeitos. células HEI-OC1 foram gerados em condições isentas de antibiótico, e que deve ser evitada para diminuir a emergência de células resistentes a antibióticos. Finalmente, queremos voltar a sublinhar um ponto já mencionado várias vezes neste relatório: o fenótipo e a resposta das células HEI-OC1 a drogas e outros estímulos dependerá fortemente os parâmetros de cultura. Portanto, é muito importante que os laboratórios que trabalham com células HEI-OC1 usar protocolos semelhantes e as condições de cultura de células, a fim de fazer os seus resultados verdadeiramente comparáveis ​​com aqueles fornecidos por outros grupos. Além disso, émuito importante lembrar que a linha de células HEI-OC1 é apenas um modelo, com todas as limitações que tem um modelo. Esperando que os experimentos in vitro com células HEI-OC1 irá fornecer dados que representam com precisão as respostas in vivo de células sensoriais auditivas reais é irrealista. No entanto, nós acreditamos fortemente a linha de células HEI-OC1 é um modelo útil para a investigação de respostas funcionais das células sensoriais auditivas e ao rastreio do potencial ototoxicidade de drogas farmacológicas.

House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3. células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos. Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8. Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 </s-se&gt;. Nós relatamos citometria de fluxo e estudos de microscopia confocal de varredura a laser sobre o padrão de expressão prestin, bem como capacitância não-linear (NLC) e os estudos de fixação de células-remendo inteiros em células HEI-OC1 cultivadas na permissiva (P-HEI-OC1) e não permissivas (NP-HEI-OC1) condições. Os nossos resultados indicaram que tanto o aumento total de localização expressão prestin e membrana de plasma de uma maneira dependente do tempo em células NP-Hei-OC1. Curiosamente, também descobrimos que o aumento na localização prestin na membrana plasmática de células NP-Hei-OC1 correlacionada com uma diminuição em Na + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas. Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores. Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não permissivas (39 ° C / 10% de CO 2 = NP-Hei-OC1) apresentaram uma diminuição altamente significativa da viabilidade celular, e um aumento igualmente significativo na morte da célula, relativamente a células cultivadas em condições permissivas (33 ° C / 10% de CO 2 = P-Hei-OC1) (Figura 1). Portanto, qualquer estudo de citotoxicidade realizados em células de NP-IES-OC1 devem dedicar esforços consideráveis ​​em efeitos de drogas a partir de discriminar os efeitos das condições de cultura. em addition, já que os efeitos da droga sobre células já morrendo ou com uma viabilidade diminuiu poderia ser diferente que os efeitos da mesma droga em células saudáveis, recomendamos a utilização de células P-HEI-OC1 para experiências que não especificamente exigem células diferenciadas. Os nossos estudos sobre o efeito de diferentes drogas farmacológicas também produziu resultados interessantes. Por exemplo, a cisplatina, um agente quimioterapêutico frequentemente utilizados para o tratamento de várias malignidades humanas, e acetaminofeno (APAP = N- uma pa ra cetyl--amino henol p), o analgésico mais amplamente vendido over-the-counter nos EUA, ambos foram tóxicos para células HEI-OC1 (Figura 2). No entanto, enquanto APAP diminuiu a viabilidade celular e aumento da caspase 3/7 ativação, ele não induzir a morte celular. A cisplatina, em contraste, aumentaram significativamente as respostas de três (Figura 2). Curiosamente, as caspases 3/7 eram mostlY activada em concentrações mais baixas de cisplatina, sugerindo que a morte celular induzida por doses baixas de cisplatina foi provavelmente mediada por apoptose, enquanto que doses elevadas efeitos letais poderia ser associado com oncose / necroptosis. Enquanto oncose tem sido definida como uma via de pré-letal levando a morte celular desregulado acompanhada por inchaço celular e organela, formação de bolhas, e um aumento da permeabilidade da membrana 17,18, necroptosis é um mecanismo de morte de células não-apoptótico regulada activado pelos mesmos estímulos que iniciam morte celular, mas com características morfológicas semelhantes às do oncose 19-22. Estudos adicionais destinadas a investigar os efeitos da APAP e cisplatina em células P-HEI-OC1 mostrou um efeito claro, dependente da dose da APAP na proliferação de células que poderia explicar a diminuição intrigante da viabilidade celular, sem morte celular descrito no parágrafo anterior (Figura 3A). als cisplatina<html> O decréscimo da proliferação celular, e o seu efeito aumentado com o tempo de exposição até mesmo para pequenas doses (Figura 3A), mas em adição a senescência diminuiu em todas as concentrações e intervalos de tempo compreendidos no nosso estudo (Figura 3B). A diminuição significativa da senescência celular induzida por cisplatina pode ser explicado pelo aumento da morte celular, assumindo que as células senescentes seria, provavelmente, propensas a morrer mais rapidamente do que as células saudáveis ​​23. Mais importante, estes resultados sugerem que as células representativas IES-OC1 respondem a diferentes drogas farmacológicas com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Portanto, uma interpretação correta de um resultado experimental exigirá uma compreensão clara dos processos celulares particulares investigadas e as informações fornecidas por cada uma das técnicas utilizadas para avaliá-los. jove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; confocal e citometria de fluxo experimentos, por outro lado, confirmou a expressão prestin em células P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1, com prestin immunolocalizing principalmente no citoplasma de células P-Hei-OC1 (Figura 4A, setas), e mais concentrado na membrana plasmática nas células NP-Hei-OC1 (Figura 4B, setas). a citometria de fluxo estudos demonstraram um claro aumento em expressão prestin em NP-IES -OC1 células relativamente às células P-Hei-OC1 (Figuras 4C e 4D). O aumento dependente do tempo da expressão e localização da membrana plasmática de células prestin em NP-Hei-OC1 sugere que a translocação foi acompanhada por síntese de mais moléculas prestin. no entanto, estas experiências não fornecer pistas para decidir se moléculas Prestin inicialmente localizadas no citoplasma movimento para a membrana plasmática e novas moléculas substituí-los, se permanecerem no citoplasma e apenas recentemente o sintetizadormovimentos Prestin esized para a membrana plasmática, ou uma combinação de ambos os processos. Estudos electrofisiológicos demonstraram uma NLC robusto nas células P-Hei-OC1 (Figura 5B), com um valor de pico que diminuiu e uma tensão de pico de capacitância que foi deslocado para valores mais despolarizadas, quando as células foram transferidas para condições não permissivas para 1 e 2 semanas (figuras 5C e 5D). Por causa da translocação progressiva de prestin a partir do citoplasma para a membrana plasmática, que originalmente a hipótese de que NLC seria maior em NP-Hei-OC1 do que nas células P-Hei-OC1, e que iria aumentar ainda mais com o tempo de incubação a NP condições. Surpreendentemente, os resultados dos nossos estudos mostraram exactamente a resposta oposta. Especulamos que o aumento da densidade de moléculas Prestin na membrana plasmática poderia ser restringindo a sua função motora. hin-page = &quot;1&quot;&gt; Nota na Figura 5 a despolarização da tensão no pico capacitância em células HEI-OC1 relação aos valores típicos reportados na CCE e em células HEK293 transfectadas 24; Além disso, observa-se que a mudança de despolarização aumenta com o tempo nas condições de NP. A mudança de despolarização progressiva é semelhante ao descrito no CCE durante ratinho e rato desenvolvimento 25,26, e sugeriu-se que pode ser relacionada com o desenvolvimento de outras estruturas celulares associadas com a membrana plasmática do CCE 25, ou um processo de maturação intrínseca para prestin 24. Esperamos que este breve recontagem de alguns estudos com células HEI-OC1 fornecer provas suficientes da utilidade potencial de células HEI-OC1 para investigar um amplo espectro de respostas moleculares das células e. <html> ad / 54425 / 54425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: A viabilidade celular e morte celular na P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 Cells. Viabilidade (A) celular avaliada com o ensaio MTT. A absorvância foi medida com um leitor de placas, e OD média de células de controlo foi tomada como 100% de viabilidade. Morte (B) celular avaliada com um ensaio de citotoxicidade. O número de células positivas (mortos) foi determinada por citometria de fluxo com excitação de 488 nm (laser azul) e FL1: 530 15 nm. Note-se a (P ≤0.001) diminuição altamente significativa da viabilidade celular (A) e aumento da morte celular (B) induzida por condições não permissivas. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificado de referência 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2:. Respostas de células HEI-OC1 expostas para o APAP e cisplatina quando analisado por MTT, as caspases 3/7 e Citotoxicidade viabilidade (A) celular avaliada com o ensaio de MTT, e a absorvância medida com um leitor de placas. (B) A activação de caspases executoras 3/7. (C) Fármaco - induzida morte celular avaliada com um ensaio de citotoxicidade; o número de células positivas (mortos) foi determinada por citometria de fluxo. Os dados em cada experimento foi normalizada para as respectivas condições de controle (controle = 1) para possibilitar a análise estatística simultânea. * = P ≤0.05 relação ao controle. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificada fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig3.jpg" /> Figura 3: Efeitos da APAP e cisplatina em &#39;HEI-OC1 células mitóticas Taxa e senescência. (A) Alterações induzidas pela droga sobre a taxa de divisão mitótica de células HEI-OC1, às 24 e 48 horas, foi avaliada com um BrdU de Ensaio. (B) senescência induzida por drogas em células HEI-OC1 foi medida por citometria de fluxo ea senescência associado β-galactosidase (SA-Bgal) técnica. Os dados em cada experimento foi normalizada para as respectivas condições de controle (controle = 1) para possibilitar a análise estatística simultânea. * = P ≤0.05 relação ao controle. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificada fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da t</a>sua figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig4.jpg" /> Figura 4:. Prestin Expressão em P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 Cells - células foram marcadas com anti-Prestin Antibody e observado por microscopia confocal e citometria de fluxo (A) Em células P-HEI-OC1 prestin imunolocalizada principalmente à o citoplasma (setas). (B) Em células de NP-Hei-OC1, em contraste, a reactividade prestin foi concentrado na membrana plasmática (setas). (C e D) estudos de citometria de fluxo em células HEI-OC1 cultivadas durante 2 semanas em condições NP (D) mostrou um claro aumento em expressão prestin respeito a células P-Hei-OC1 (C). (C) Inset é secundário ab somente (controle negativo). Modificado de referência 9.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig5.jpg" /> Figura 5: estudos NLC em células P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 (A) células HEI-OC1 apertado-Patch.. (B - D) NLC na P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 células. Note-se a diminuição no pico de NLC e a mudança progressiva das curvas de valores em células NP-Hei-OC1 mais despolarizadas. Modificado de referência 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K visualizações.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Vídeo: Working with Auditory HEI-OC1 Cells

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Biologia do Desenvolvimento

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Neurociência

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cultivo in vitro eficiente de células ciliadas cocleares de camundongos

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Autor em destaque: Avanços no cultivo de células ciliadas de camundongos para pesquisa auditiva 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Biologia

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

Resumo

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Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos