This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

<ol>
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The authors declare no existing or potential conflict of interest.

En este informe se describe cómo la cultura células HEI-OC1 y las utilizamos para evaluar los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos y para investigar las propiedades funcionales de prestina, el motor molecular de las CCE coclear. Los procedimientos técnicos, sin embargo, son lo suficientemente generales como para ser adaptado fácilmente a diferentes estudios. Todos los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidos 10. Al igual que con cualquier otra línea celular, se trabaja con células HEI-OC1 requiere una instalación de cultivo celular está debidamente equipado, con un gabinete con certificación de seguridad biológica, una centrífuga refrigerada, un baño de agua, y un microscopio invertido para el examen de cultivos celulares y de células de recuento Si el uso de técnicas hemocytometric. Un requisito único, sin embargo, es la disponibilidad de dos incubadoras humidificadas, un juego a 33 ° C / 10% de CO 2 para las células P-IES-OC1 y otra a 39 ° C / 5% de CO 2 para celular NP-IES-OC1s. Si los estudios previstos implican sólo las células P-HEI-OC1, la segunda incubadora se puede ajustar a 37 ° C / 5% de CO 2 para diferentes ensayos. El uso de placas de cultivo celular de plástico es un requisito adicional importante para trabajar con células HEI-OC1. De hecho, las células HEI-OC1 son muy robustos y lo harán el crecimiento en diferentes superficies y en condiciones muy diferentes. Sin embargo, su fenotipo y su respuesta a los medicamentos y otros estímulos dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo (G &amp; F Kalinec Kalinec, sin publicar). Como argumentamos en un trabajo previo 8, esta plasticidad de las células HEI-OC1 se puede utilizar ventajosamente para diseñar nuevos experimentos. Por ejemplo, es bien sabido que la tensión de oxígeno en la perilinfa coclear es mucho más baja (~ 2 kPa) que en una incubadora típica a nivel del mar (~ 21,3 kPa) 27. La incubación de las células HEI-OC1 en O 2 concentraciones inferiores cambiarán sus respuestas, tal vez ellos haciendo un mejor modelo para la auditoríaORY células sensoriales. Debe hacerse hincapié en que los protocolos descritos para la cultura y subcultivo de células HEI-OC1 también se pueden utilizar con otras líneas de células auditivas desarrollado en nuestro laboratorio a partir de la misma de ratón transgénico, como OC-k3 de órgano de Corti 11,12 y SV -k1 de estría vascular 13,14. Además, estas líneas celulares podrían ser útiles como células control para HEI-OC1 en experimentos seleccionados. Por ejemplo, hemos utilizado recientemente células SV-k1 para demostrar que la inmunorreactividad inversamente proporcional a la prestina y anticuerpos Na + K + ATPasa en la membrana plasmática de las células HEI-OC1 era celular respuesta de tipo dependiente del lugar de asociado con el ratón transgénico de que estas células se obtuvieron a 9. Otro requisito crítico para el trabajo con células HEI-OC1 es la práctica de técnicas asépticas apropiadas, tales como la limpieza de todas las superficies de trabajo dentro de la cabina de seguridad con un 70% eTHANOL o isopropanol y la descontaminación de los materiales requeridos para los procedimientos. Sin embargo, mientras que otras líneas celulares de mamífero son frecuentemente protegidos contra la contaminación bacteriana inadvertida mediante el uso de penicilina-estreptomicina u otras combinaciones similares, antibióticos nunca deben ser utilizados con células HEI-OC1 excepto si el propósito del estudio es investigar sus efectos. células HEI-OC1 se generaron en condiciones libres de antibióticos, y deben evitarse para reducir la aparición de células resistentes a los antibióticos. Por último, queremos volver a insistir en un punto ya se ha mencionado varias veces en este informe: el fenotipo y la respuesta de las células HEI-OC1 a las drogas y otros estímulos dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo. Por lo tanto, es muy importante que los laboratorios que trabajan con células HEI-OC1 utilizan protocolos similares y condiciones de cultivo celular con el fin de hacer que sus resultados realmente comparable con los proporcionados por otros grupos. Además, esmuy importante recordar que la línea celular HEI-OC1 es sólo un modelo, con todas las limitaciones que tiene un modelo. Esperando que los experimentos in vitro con células HEI-OC1 proporcionará datos que representan con precisión las respuestas in vivo de las células sensoriales auditivas real es poco realista. Sin embargo, estamos convencidos de la línea celular HEI-OC1 es un modelo útil para la investigación de las respuestas funcionales de las células sensoriales auditivas y la proyección de la ototoxicidad potencial de los medicamentos farmacológicos.

House Ear Institute-órgano de Corti 1 células (IES-OC1) se derivan del órgano de la audición de un 1,2 ratón transgénico. La incubación de cualquier célula de este ratón transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condiciones permisivas) induce la expresión de un gen de inmortalización que desencadena de-diferenciación y la proliferación acelerada; mover las células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condiciones no permisivas) conducen a disminución de la proliferación, la diferenciación y, por lo menos en el caso de HEI-OC1, la muerte celular 2,3. células HEI-OC1 fueron clonados y caracterizados en nuestro laboratorio hace más de una década, y los estudios iniciales indicaron que expresan marcadores específicos de células ciliadas cocleares, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina y calmodulina, sino también los marcadores de apoyo células como la conexina 26 y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) 2. Por lo tanto, se sugirió que HEI-OC1 podría representar un common progenitoras de las células sensoriales y de soporte del órgano de Corti 2. Estudios paralelos proporcionan una fuerte evidencia de que arquetípica fármacos ototóxicos, tales como cisplatino, gentamicina y estreptomicina inducida por la activación de la caspasa-3 en estas células, mientras que los medicamentos que se consideran no ototóxicos, como la penicilina, no lo hicieron 2,3. Por lo tanto, esta línea celular fue propuesto como un sistema in vitro para investigar los mecanismos celulares y moleculares implicados en la ototoxicidad y para la detección de la ototoxicidad potencial o propiedades otoprotective de nuevos medicamentos farmacológicos. Se estima que las células HEI-OC1 se han utilizado en más de ciento cincuenta estudios publicados en los últimos diez años. Mientras que mirando el potencial pro-apoptóticos efecto de diferentes drogas fue el principal objetivo de la mayoría de los estudios con esta línea celular, otros procesos celulares importantes como la autofagia y la senescencia simplemente han comenzado a ser investigado en células HEI-OC1 4-7. yona reciente estudio realizado en nuestro laboratorio 8, que utiliza células HEI-OC1 para recoger un conjunto completo de datos sobre la muerte celular, la supervivencia, proliferación, senescencia y la autofagia inducida por diferentes drogas farmacológicas utilizadas con frecuencia en la clínica. También comparamos algunas de las respuestas de las células HEI-OC1 con las de células HEK-293 (células de riñón embrionario humano) y HeLa (células epiteliales humanas) que recibe un tratamiento idéntico. Nuestros resultados indican que las células HEI-OC1 responden a la cada fármaco de una forma característica, con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. También hicimos hincapié en que el estudio que una correcta interpretación de los resultados experimentales requerirá la realización de estudios paralelos con más de una técnica 8. En un estudio diferente se investigó el uso de células HEI-OC1 para evaluar la respuesta funcional de prestin, la proteína de motor de las células ciliadas externas cocleares (CCE) 9 </sarriba&gt;. Hemos informado citometría de flujo y estudios de microscopía láser confocal de barrido en el patrón de expresión prestina, así como la capacitancia no lineal (NLC) y los estudios de fijación de células enteras parche en células cultivadas HEI-OC1 al permisiva (P-IES-OC1) y no permisivas (NP-IES-OC1) condiciones. Nuestros resultados indican que tanto la expresión prestina y membrana plasmática aumento total de la localización de una manera dependiente del tiempo en las células NP-IES-OC1. Curiosamente, también se encontró que el aumento en la localización prestin en la membrana plasmática de las células NP-HEI-OC1 correlacionados con una disminución de Na + K + ATPasa, que transloca desde la membrana plasmática al citoplasma sin cambios significativos en la expresión de células total. Además, hemos demostrado que las células P-HEI-OC1 tienen un robusto NLC asociado a prestina la función motora, que disminuye cuando la densidad de las moléculas de prestina presentes en la membrana plasmática se incrementó. En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la utilidad de HEI-OC1 en las células para investigar las proteínas auditivas. En este artículo de vídeo se describe cómo la cultura células HEI-OC1, por lo que es conveniente utilizar células que crecen en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para los estudios de citotoxicidad, la forma de evaluar el mecanismo / s de la citotoxicidad inducida por fármacos y cómo para llevar a cabo estudios electrofisiológicos (por ejemplo, patch-clamp, la capacitancia no lineal (NLC)) para investigar las propiedades funcionales de prestin, el motor molecular de OHCs cocleares.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

En un par de publicaciones recientes se informó de un amplio conjunto de estudios dirigidos a evaluar la respuesta de las células HEI-OC1 a varios medicamentos farmacológicos de uso común, así como la investigación de la función prestina 8,9. En estos estudios hemos hecho uso de todos los protocolos descritos en las secciones anteriores. Uno de los resultados de estos estudios anteriores era que las células HEI-OC1 cultivaron a condiciones no permisivas (39 ° C / 10% de CO 2 = NP-HEI-OC1) mostró una disminución muy significativa de la viabilidad celular, y un aumento igualmente significativo en la muerte celular, respecto a las células cultivadas en condiciones permisivas (33 ° C / 10% de CO 2 = P-HEI-OC1) (Figura 1). Por lo tanto, cualquier estudio de citotoxicidad realizó en las células NP-IES-OC1 deben dedicar esfuerzos considerables para discriminar efectos de los medicamentos de los efectos de las condiciones de cultivo. Ademasn, ya que los efectos del fármaco sobre las células ya morir o con una disminución de la viabilidad podría ser diferente que los efectos de la misma droga en las células sanas, que recomiendan el uso de células P-IES-OC1 para los experimentos que no requieren específicamente las células diferenciadas. Nuestros estudios sobre el efecto de diferentes fármacos farmacológicos también produjeron resultados interesantes. Por ejemplo, el cisplatino, un agente quimioterapéutico que se usa con frecuencia para el tratamiento de varios tumores malignos humanos, y acetaminofeno (APAP = N- un pa cetyl- ra-amino p henol), el over-the-counter analgésico más ampliamente vendidos en los EE.UU., eran ambos tóxicos para las células HEI-OC1 (Figura 2). Sin embargo, mientras APAP disminución de la viabilidad celular y el aumento de la caspasa 3/7 de activación, que no indujo la muerte celular. El cisplatino, por el contrario, aumentó significativamente las tres respuestas (Figura 2). Curiosamente, las caspasas 3/7 eran mostly activa a concentraciones más bajas de cisplatino, lo que sugiere que la muerte celular inducida por dosis bajas de cisplatino probablemente estaba mediada por apoptosis, mientras que las altas dosis efectos letales podrían estar asociados con oncosis / necroptosis. Mientras oncosis se ha definido como una vía pre-letal conduce a la muerte celular no regulado acompañada de inflamación celular y de orgánulos, formación de ampollas, y aumento de la permeabilidad de la membrana 17,18, necroptosis es un mecanismo de la muerte celular no apoptótica regulada activado por los mismos estímulos que inician apoptosis pero con características morfológicas similares a las de oncosis 19-22. Estudios adicionales dirigidos a investigar los efectos de APAP y cisplatino en las células P-IES-OC1 mostraron un claro efecto, dependiente de la dosis de APAP sobre la proliferación celular que podría explicar la disminución intrigante de la viabilidad celular y sin muerte celular descrito en el párrafo anterior (figura 3A). ALS cisplatino<html> o disminución de la proliferación celular, y su efecto aumenta con el tiempo de exposición incluso para pequeñas dosis (Figura 3a), pero además de la disminución de la senescencia en todas las concentraciones y puntos de tiempo incluidas en nuestro estudio (Figura 3B). La disminución significativa en la senescencia celular inducida por cisplatino podría explicarse por el incremento en la muerte celular, en el supuesto de que las células senescentes serían, probablemente, con tendencia a mueren más rápidamente que las células sanas 23. Es importante destacar que estos resultados sugieren que las células representativas HEI-OC1 responden a diferentes medicamentos farmacológicos con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. Por lo tanto, una interpretación correcta de cualquier resultado experimental requerirá una clara comprensión de los procesos celulares particulares investigados y la información proporcionada por cada una de las técnicas utilizadas para evaluarlas. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; confocal y citometría de flujo experimentos, por el contrario, confirmó la expresión en células prestina P-IES-OC1 y NP-IES-OC1, con prestina immunolocalizing sobre todo en el citoplasma de las células P-HEI-OC1 (Figura 4A, flechas), y más concentrado en la membrana plasmática en las células NP-HEI-OC1 (Figura 4B, flechas). la citometría de flujo estudios mostraron un claro aumento de la expresión prestin en NP-HEI -OC1 células respecto a las células P-HEI-OC1 (Figuras 4C y 4D). El aumento dependiente del tiempo en la expresión y localización de la membrana de plasma de prestin en las células NP-HEI-OC1 sugiere que la translocación fue acompañada por síntesis de más moléculas prestina. sin embargo, estos experimentos no proporcionan pistas para decidir si las moléculas prestina originalmente situadas en el citoplasma movimiento a la membrana plasmática y las nuevas moléculas de ellos sustituyen, si permanecen en el citoplasma y sólo el recién synthesized prestina se mueve a la membrana de plasma, o una combinación de ambos procesos. Estudios electrofisiológicos mostraron un robusto NLC en las células P-HEI-OC1 (Figura 5B), con un valor de pico que la disminución y un voltaje en el pico de la capacitancia que se desplazó a valores más despolarizados, cuando las células se trasladaron a condiciones no permisivas para 1 y 2 semanas (Figuras 5C y 5D). Debido a la translocación progresiva de prestin desde el citoplasma a la membrana plasmática, que originalmente la hipótesis de que NLC sería mayor en NP-HEI-OC1 que en las células P-HEI-OC1, y que sería aumentar aún más con el tiempo de incubación a NP condiciones. Sorprendentemente, los resultados de nuestros estudios mostraron exactamente la respuesta opuesta. Especulamos que el aumento de la densidad de moléculas prestina en la membrana plasmática podría ser la restricción de su función de motor. hin-page = &quot;1&quot;&gt; Nota en la Figura 5, la despolarización de la tensión en la capacitancia pico en células HEI-OC1 respecto a los valores típicos reportados en las CCE y en células HEK293 transfectadas 24; Por otra parte, observamos que el cambio de despolarización aumenta con el tiempo en condiciones de NP. El cambio de despolarización progresiva es similar a la descrita en OHCs durante ratón y rata desarrollo 25,26, y se ha sugerido que podría estar relacionada con el desarrollo de otras estructuras celulares asociados con la membrana plasmática de la OHC 25, o un proceso de maduración intrínseca prestina a 24. Esperamos que esta breve recuento de algunos estudios con células HEI-OC1 proporciona suficiente evidencia de la utilidad potencial de las células HEI-OC1 para la investigación de un amplio espectro de respuestas celular y molecular. <html> ad / 54425 / 54425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Viabilidad celular y muerte celular en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células. Viabilidad (A) Cell evaluó con el ensayo MTT. Se midió la absorbancia con un lector de placas, y OD medio en las células de control se tomó como 100% de viabilidad. La muerte (B) de la célula evaluada con un ensayo de citotoxicidad. El número de células positivas (muertos) fue determinada por citometría de flujo con 488 nm de excitación (láser azul) y FL1: 530 15 nm. Tenga en cuenta el (≤0.001 P) disminución muy significativa de la viabilidad celular (A) y el aumento de la muerte celular (B) inducida por condiciones no permisivas. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado de la referencia 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2:. Respuestas de las células HEI-OC1 Expuestos a APAP y cisplatino cuando se analiza por MTT, caspasas 3/7 y la citotoxicidad ensayos de viabilidad (A) Cell evaluado con el ensayo de MTT, y la absorbancia midieron con un lector de placas. (B) La activación de las caspasas ejecutoras 3/7. (C) La muerte celular inducida evaluada con un ensayo de citotoxicidad - Drogas; el número de células positivas (muertos) se determinó por citometría de flujo. Los datos de cada experimento se normalizaron a las condiciones de control respectivos de control (= 1) para hacer posible el análisis estadístico simultánea. * = P ≤0.05 respecto al control. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig3.jpg" /> Figura 3: Efectos de la APAP y cisplatino en HEI-OC1 Cells mitótico tarifas y senescencia. (A) Cambios inducidos por fármacos sobre la tasa de división mitótica de las células HEI-OC1, a las 24 y 48 horas, se evaluó con un ensayo BrdU. (B) la senescencia inducida por fármacos en células HEI-OC1 se midió por citometría de flujo y la senescencia asociado β-galactosidasa (SA-Bgal) técnica. Los datos de cada experimento se normalizaron a las condiciones de control respectivos de control (= 1) para hacer posible el análisis estadístico simultánea. * = P ≤0.05 respecto al control. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de t</a>su figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig4.jpg" /> Figura 4:. Prestina Expresión en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células - células fueron marcadas con anti-prestina de anticuerpos y observado por microscopía confocal y citometría de flujo (A) En las células P-IES-OC1 prestina immunolocalized sobre todo en el citoplasma (flechas). (B) En las células NP-HEI-OC1, en ​​contraste, la reactividad prestin se concentró en la membrana plasmática (flechas). (C y D) La citometría de flujo estudios en células HEI-OC1 se cultivaron durante 2 semanas en condiciones NP (D) mostraron un claro aumento de la expresión respecto prestin a las células P-HEI-OC1 (C). (C) de la inserción es secundario ab solamente (control negativo). Modificado de la referencia 9.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig5.jpg" /> Figura 5: Estudios de NLC en células P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 (A) células HEI-OC1 Patch-montado.. (B - D) NLC en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células. Tenga en cuenta la disminución en el pico de NLC y el cambio progresivo de las curvas de valores de las celdas NP-HEI-OC1 más despolarizadas. Modificado de la referencia 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

El trabajo con células auditivas HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K vistas.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

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Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Neurociencias

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cultivo eficiente in vitro de células ciliadas cocleares de ratón

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Autor destacado: Avances en el cultivo de células ciliadas de ratón para la investigación auditiva 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Biología

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Preparación de cortes de cerebro en cuña para visualizar neuronas auditivas

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

El trabajo con células auditivas HEI-OC1

Resumen

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Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de

La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Preparación de cortes de cerebro en cuña para visualizar neuronas auditivas