The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

1. Preparação de Fly alimentares que contenham radiomarcadas metabólicas Substratos <ol><li> Num tubo de microcentrifuga, misturar 1-2 uCi substrato marcado radioactivamente (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] -glucose ou [1- 14 C] ácido -palmitic, 40-60 mCi / mmol) com 15 ul de FD &amp; amp; C No. 1 de corante alimentar azul e H 2 O para igualar um volume total de 25 ul. CUIDADO: O carbono-14 é um emissor beta de baixa energia e tem um curto alcance no ar. No entanto, tome cuidado para evitar derramamento de moléculas radiomarcadas ou ingestão acidental pelo experimentador. Fly frascos de alimentos tombar facilmente; certifique-se de abrigá-los em um recipiente que vai impedi-los de inflexão, especialmente quando radiomarcador está em forma líquida (passo 1.2) ou em alimentos não solidificada (passo 1.4). Moscas que estão sendo alimentados ou foram alimentados substratos radiomarcados vai começar a exalar pequenas quantidades de CO 2 radiomarcado. Estas moscas devem ser mantidos em caixas de acrílico em exaustores, e um pequeno prato de KOH can ser definida na caixa para o uso como um purificador de CO 2. </li><li> Pipetar todo o substrato marcado radioactivamente e azul mistura corante para o fundo de um frasco vazio alimentar da mosca (altura: 9,4 cm, largura: 2,2 cm). </li><li> padrão de calor voar comida em um forno de microondas até que o alimento é apenas liquefeito (15-20 seg a nível de alta potência para um frasco contendo 10 ml de alimento). </li><li> Adicionar alimentos 975 ul fundido ao substrato radiomarcado / azul mix corante e rapidamente redemoinho, monitorando a uniformidade da cor azul para assegurar a mistura completa. </li><li> Permitir que o alimento para arrefecer e solidificar completamente à temperatura ambiente durante 20 - 30 min. </li></ol> 2. Alimentação Substratos Radiolabeled metabólicas ao moscas adultas fruta <ol><li> Anestesiar moscas adultas utilizando um aparelho de anestesia de CO 2 que consiste de polietileno poroso fundido com uma base acrílica e ligado a um tanque de CO 2 com um regulador de pressão. Fluxo de CO 2 para dentro do aparelho de anestesia em 5 L / min. <ol><li> transferência Anesthetized voa para frascos contendo radiomarcados, alimento azul-tingidas (n = 15 - 30 moscas por frasco). frascos de tampão com uma rolha de espuma, e descansar horizontalmente até moscas acordar. frascos de transferência para um recipiente de acrílico com tampa (180 cm x 180 cm x 240 cm de altura). </li></ol></li><li> Para a alimentação de curto prazo, fome moscas para 18 - 24 horas antes de transferir as moscas ao alimento radiomarcado para um 2 -. Passo de alimentação 3 horas T ele passo fome é importante porque moscas Fed não vai comer de forma confiável uma nova fonte de alimentos que lhes são apresentados . Para uma alimentação de longo termo ao longo de 5 - 7 dias, as moscas não necessitam de ser fome, mas o experimentador deve controlar o teor de água do alimento radiomarcado nos frascos moscas estão alojados dentro e usar uma agulha e seringa para adicionar água para frascos com alimentos secos. </li><li> Transferência voa para alimentos não marcado por &quot;tapping&quot;-los em um novo frasco. Um período de corrida inicial de 2-4 horas permite moscas para limpar as partículas de alimento radiomarcado do seu cutículas e permite a digestão de radiomarcadorEd alimento remanescente no intestino. Monitorar o progresso do alimento através do intestino por inspeção visual de moscas para procurar abdomens azuis. </li><li> Posteriormente, a transferência voa para diferentes tipos de alimentos (12 - 24 horas em alimentos padrão ou 1% agar para a medição dos efeitos das alimentado contra o jejum na respiração) ou temperatura ambiente (12 - 96 horas a 18 C ou 30 ° C para a genética manipulações usando GAL80 sensível à temperatura (ts GAL80), por exemplo). Nota: A duração deste período irá variar de perseguição com a experiência sendo realizada. Por exemplo, pode ser necessária uma perseguição de 96 horas a 30 ° C em experimentos usando GAL80 ts, a fim de ativar totalmente a expressão do transgene GAL4-dependente. </li></ol> 3. Preparação do Dispositivo de CO 2 -Coleção <ol><li> Montar materiais para a construção de &quot;voar&quot; pods, tubos com tampa de malha que irão conter moscas marcadas com ácido C-palmítico 14 C-glicose ou 14 e that permanecerá aberta para a atmosfera. Cortar a parte superior 50 mm de 12 mm x 75 mm tubos de polipropileno, deixando 25, tubos de fundo redondo mm de comprimento. Preparar 35 mm x 35 mm quadrados de malha de nylon de 130 um. Além disso, obter a fita transparente em um dispensador de fita. </li><li> Montar materiais para os aparelhos -collection CO 2. Para cada mosca vagem, montar um frasco de 20 ml de vidro de cintilação, uma tampa superior de borracha com um orifício para fora do centro, um centro de poço a ser inserido através do orifício no topo rolha, GF grau / B papel de filtro de microfibra de vidro (2,1 cm de diâmetro círculo, uma poro). Papel de filtro GF / B é utilizado devido à sua elevada resistência mecânica em húmido e capacidade de carga elevada. </li><li> Prepare a 5% de KOH fresco no dia da utilização. Apenas antes do passo 3.4, dobrar e colocar o papel de filtro GF / B circular no poço central que é enfiada através do orifício do topo rolha de borracha e saturar com 100 ul de 5% de KOH. Consulte a Figura 1. </li><li> A seguir à incubação (s) em suportes não marcado, umanesthetize voa com CO 2. Escova voa para dentro do tubo de corte de polipropileno, tampa com malha de nylon, e use fita adesiva transparente para aderir malha para tubo. Trabalhar rapidamente para evitar moscas acordar e escapar antes que a malha foi solidamente fixados ao tubo. Um número igual de moscas deve ser utilizado em cada vagem mosca para uma experiência particular; 10 - 20 moscas por vagem mosca produzir suficiente radiomarcado-CO 2 para a medida por contagem de cintilação (passo 4.1 abaixo). </li><li> Transferir o pod mosca a um frasco de 20 ml de cintilação de vidro. Tapar o frasco de vidro com a tampa de borracha superior segurando um centro de bem contendo papel de filtro GF / B KOH-saturada. Dobrar a largura superior da rolha de borracha superior sobre o bordo do frasco de vidro de cintilação. Consulte a Figura 1. </li><li> frascos de vidro conjunto contendo moscas de pálpebras, recipiente de acrílico, e incubar durante vários períodos de tempo (2 a 12 h funciona bem). </li></ol> 4. Análise dos Resultados <ol><li> emno final da incubação, os frascos de vidro uncap, e de transferência de papel de filtro GF / B saturado de KOH para um frasco de cintilação de 6 ml contendo plástico de 4 ml de cocktail de cintilação. </li><li> Se necessário, congelar moscas em vagens voar em gelo seco e armazenar a -80 ° C para posterior determinação de substratos armazenados. Note-se que estas amostras são radioactivos e deve ser armazenado em conformidade. </li><li> Prepare frascos de cintilação adicionais: um contendo papel de filtro / B GF não utilizado para servir como pano de fundo e um ou dois outros contendo 0,1-0,5 uCi substrato radiomarcado para determinar cpm / uCi. </li><li> Medir cpm para cada amostra utilizando um contador de cintilação de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Calcule pmol 14 CO 2 / cpm e pmol 14 CO 2 por mosca por hora. Subtrair a cpm de fundo a partir do valor de cpm para cada amostra. A partir dos dados de substratos radiomarcados puro, calcular o cpm / Ci de amostra com correção de fundo contados. <ol><li> Use oactividade específica e concentração radioquímica do substrato marcado radioactivamente (por exemplo, 50 uCi / umol e 0,1 jiCi / mL, respectivamente) para calcular pmol / cpm fornecido pelo fabricante. Utilize este fator para converter dados mosca pod corrigido-fundo de cpm 14 CO 2 / amostra para pmol 14 CO 2 / amostra. Em seguida, dividir pelo número de moscas e o número de horas no pod mosca. </li></ol></li></ol>

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The author declares no competing financial interests.

Este protocolo descreve um método para medir a oxidação de substratos radiomarcados específicos em adulto de Drosophila melanogaster. Esta técnica é simples, quantitativo e reprodutível e sensível, e complementa os métodos existentes que medem de produção total de CO 2 e consumo de O 2, porque pode ser utilizado para identificar o nutriente (s) a ser oxidado para a produção de ATP. Medição de CO 2 libertado a partir da oxidação de substratos radiomarcados específicos usando o método aqui descrito é complementar a técnicas que medem de produção total de CO 2. Total de produção de CO 2 (V CO2) permite estimar a taxa metabólica e, quando o consumo total de O2 (VO2) é conhecido, a taxa metabólica pode ser calculada e a fonte de combustível para a oxidação pode ser estimado com base na taxa de troca respiratória (V CO2 / O2 = V RER). Quandohidratos de carbono são o substrato exclusiva, RER = 1, mas quando os ácidos gordos são a fonte exclusiva, RER = 0,7, devido à estequiometria das reacções de glucose e oxidação de lípidos. Na ausência de equipamento para medir o consumo de oxigénio em Drosophila 14, a fonte de combustível não oxidativo pode ser identificado. No entanto, por meio de etiquetagem voa com quantidades vestigiais de um substracto radioactivo ou outro, e as taxas de medição de radiomarcado produção de CO 2, pode-se tirar conclusões sobre a capacidade de moscas para oxidar um determinado substrato em pontos de tempo diferentes durante um estímulo ou sobre os efeitos de uma dada mutação na oxidação do combustível. Há uma série de passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, deve ser tomado cuidado ao usar materiais radioativos para evitar vazamentos e contaminação de áreas de investigação. Segundo, quando anestesiar moscas durante os passos 2.1 e 3.4, o experimentador deve trabalhar rapidamente para evitar os efeitos de CO 2 prolongadoexposição sobre o metabolismo e o comportamento. Um grupo de 20 moscas podem ser anestesiados e transferidos para um novo frasco ou numa cápsula mosca em 20 segundos ou menos. Quando transferidos de um aparelho de anestesia para um tubo de alimentação, o frasco deve ficar em repouso no seu lado para evitar moscas anestesiadas de ficar presa sobre a superfície do alimento. Quando as moscas são alimentados com alimento radiomarcado ao longo de vários dias, como no passo 2.2, o experimentador que deve segurar a comida não seque como moscas são sensíveis à desidratação. O alimentados ou em jejum antes da marcação, a escolha da etiqueta, o período de tempo de marcação, o comprimento de tempo no pod de mosca, e o método de anestesia são parâmetros que podem ser sujeitos a resolução de problemas e modificação quando se utiliza esta técnica. Em primeiro lugar, moscas submetido a períodos curtos de rotulagem (2-3 hr) é improvável que consomem quantidades significativas de alimento radiomarcado, a menos que submetidas a um período de jejum de antemão. Em segundo lugar, a escolha do marcador Cum efeito as conclusões um é capaz de desenhar sobre fenótipos metabólicos. Por exemplo, a produção de CO2 radiomarcado de D- [1- 14 C] -glucose pode reflectir a oxidação através do ciclo do ácido cítrico ou o shunt das pentoses fosfato, ao passo que a produção de CO2 radiomarcado de D- [6- 14 C] -glucose reflecte oxidação através do ciclo do ácido cítrico única 12,15,16. Alimentando moscas com um marcador marcado radioactivamente para um aminoácido essencial, 17,18 seria uma boa estratégia para avaliar a oxidação de aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, períodos longos de rotulagem com glucose radiomarcada também aumentar a possibilidade de incorporação deste precursor para outras classes de moléculas, tais como triglicéridos e 19 aminoácidos tais como alanina, que prontamente interconverts com piruvato. Isto pode ser avaliado por medição da radioactividade incorporada nestes diferentes classes de moléculas 6. Rad Com efeito, grupos separados de moscas pode ser alimentadoiolabeled substratos da mesma maneira e, em seguida, utilizados em experiências mosca vagem ou medição do marcador radioactivo que é armazenada e permanece em glicogénio e os triglicéridos em jejum e alimentados condições de 6, por exemplo. Outra estratégia é a utilização de períodos de curta de rotulagem que são susceptíveis de oxidação de revelar os nutrientes dietéticos radiomarcados si e não as formas de armazenamento desses nutrientes. Em terceiro lugar, é também possível que dois grupos de moscas pode ter as taxas idênticas de 14 CO 2 de produção ao longo de um determinado período de tempo, mas as taxas muito diferentes inicialmente. Por conseguinte, variando a quantidade de tempo que opera passar no pod de mosca pode ser um importante parâmetro a alterar quando se avalia variação fenotípica. Finalmente, este protocolo exige o uso de um curto período de CO 2 a anestesia ao colocar as moscas para o aparelho de mosca vagem. É possível que o CO 2 anestesia pode afectar a função metabólica sobre o decurso da experiência mosca vagem. Uma alternativa astratégia é usar anestesia azoto que não afeta a taxa metabólica 20. Tal como acontece com qualquer técnica que mede um sistema tão complexo como a oxidação do combustível e a taxa metabólica, o método aqui descrito tem limitações. Em primeiro lugar, é possível que opera em diferentes grupos diferentes poderiam consomem quantidades de alimento radiomarcado e assim iria entrar na fase de recolha de CO 2 do ensaio com diferentes valores de partida de substrato. Isto pode ser controlado para, em certa medida, realizando a experiência com grandes tamanhos de amostra e pela alimentação de moscas em massa. Para períodos curtos de rotulagem, voa com tripas de cor azul semelhantes vão ter consumido o marcador radioactivo e pode ser transportado para a parte perseguição do experimento. A quantidade de marcador radioactivo remanescente em um grupo de moscas também pode ser medido no final da experiência e em coortes separadas de moscas, após o fim da alimentação e período de corrida inicial. Em segundo lugar, os níveis de atividade entregrupos de moscas nas vagens da mosca podem ser diferentes. Isso terá de ser determinada experimentalmente e tidas em conta na interpretação dos dados. Em terceiro lugar, esta técnica não mede total de produção de CO 2, apenas a produção de um nutriente na dieta específica ou a forma (s) de armazenamento desse nutriente. Este protocolo não é um substituto para, mas em vez disso é complementar à medição da VCO 2, pois fornece informações diferentes e adicionais. O método descrito aqui mede exalado, CO 2 marcado radioactivamente que é um produto da oxidação de quantidades vestigiais de substratos metabólicos específicos. Variando o rótulo usado - glicose, ácidos graxos ou aminoácidos - pode-se projetar experimentos cada vez mais sofisticados para avaliar as contribuições de diferentes substratos para o metabolismo sob diferentes condições fisiológicas, tais como fome e em diferentes origens genéticas. futuras aplicações desta técnica incluem a medição da metabolism nas fases de larva e pupa de desenvolvimento, duas etapas do ciclo de vida Drosophila que são caracterizadas por extremos de armazenamento de nutrientes e discriminação, respectivamente.

Trabalho no organismo modelo Drosophila melanogaster tem contribuído grandemente para a compreensão dos princípios genéticos, processos de desenvolvimento, crescimento, envelhecimento, comportamento, imunidade e doença humana 1,2. Uma miríade de abordagens biológicas genéticas e celulares em Drosophila tem impulsionado o progresso nestas áreas. No entanto, o estudo do metabolismo na mosca da fruta desenvolveu mais lentamente, devido em grande parte à dificuldade de medição de parâmetros metabólicos em um animal tão pequeno. O interesse em usar Drosophila como modelo para o estudo de doenças humanas, tais como diabetes e para a compreensão das contribuições do metabolismo ao crescimento e várias patologias tem empurrado o campo para desenvolver e adaptar técnicas metabólicas para este organismo 3,4. métodos fiáveis ​​estão agora disponíveis para a medição de um número de parâmetros metabólicos na mosca da fruta. Por exemplo, é muito simples para avaliar a ingestão de alimentos <s-se&gt; 5, os níveis de triglicéridos armazenados e glicogénio, bem como os níveis circulantes de hemolinfa de glicose e o principal açúcar que circula na mosca, trealose, que é um dissacárido constituído por duas moléculas de glicose 4. O uso de marcadores metabólicos permitiu o estudo da absorção de nutrientes a partir da dieta e a conversão de nutrientes absorvidos tal como a glucose para o glicogénio e os triglicéridos 6 formas de armazenamento. Taxas metabólicas podem ser avaliados na mosca da fruta através da medição do consumo de oxigênio 7,8 e dióxido de carbono (CO 2) produção. O ciclo do ácido cítrico oxida unidades de dois carbonos que pode entrar no ciclo de acetil-coenzima A (CoA), que é derivado do metabolismo de hidratos de carbono dietéticos e armazenados e ácidos gordos. Cada volta do ciclo gera uma molécula de cada um de GTP (ou ATP) e o doador de electrões FADH 2, três moléculas de NADH, e duas moléculas de produto CO 2 resíduos. Produção de CO 2 podeser utilizado para estimar a taxa metabólica basal. A produção total de CO 2 pode ser quantificada em Drosophila através da utilização de respirômetros comercialmente disponíveis ou artesanais 9-10,11. A medição do total de produção de CO 2, especialmente quando combinada com medição do consumo de O 2, fornece informações valiosas sobre o metabolismo energético de todo o corpo. No entanto, esta medida não identifica o nutriente sendo oxidado para adenosina trifosfato de produção (ATP). Três classes principais de nutrientes pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão para acetil-CoA: hidratos de carbono, ácidos gordos e proteínas. Glicose-6-fosfato, derivado de glucose da dieta ou de glicogénio armazenado, pode ser convertida em piruvato que é descarboxilado pela desidrogenase piruvato para formar acetil-CoA. Composição de ácidos graxos derivados da dieta ou de triglicérides armazenados pelo rendimentos ß-oxidação acetil-CoA, que então entra no ciclo do ácido cítrico. Finalmente, A maioria dos aminoácidos pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão de piruvato, acetil-CoA ou ácido cítrico intermediários do ciclo, tais como alfa-cetoglutarato. contribuição específica em nutrientes para o metabolismo de energia durante condições basais e estimuladas pode ser monitorizada através da utilização de marcadores radioactivos. O protocolo aqui apresentado é adaptado para uso em Drosophila a partir de um protocolo utilizado para avaliar a oxidação em células cultivadas em cultura 12,13. Nesta abordagem, as moscas da fruta são alimentados 14 substratos C-radiomarcado metabólicas (hidratos de carbono, ácidos gordos ou aminoácidos) na dieta de uma curta (horas) ou longos (dias) de pulso, perseguida em alimentos não marcada, e, em seguida, expostas a uma câmara contendo hidróxido de potássio (KOH) de papel de filtro saturados para capturar CO 2 exalado como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado pode ser quantificada por contagem de cintilação. Diferenças na radiomarcado-produção de CO 2 entre experimentogrupos ao de moscas pode refletir uso de combustíveis diferentes para a produção de ATP ao longo de uma prolongada diferenças rápidos ou intrínsecas no metabolismo de combustível entre os genótipos, por exemplo.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

O poder da genética de Drosophila está cada vez mais a ser aplicada a questões de sinalização hormonal e metabolismo e para o desenvolvimento de modelos de doenças humanas neste organismo. métodos sensíveis para medições de parâmetros, tais como taxas metabólicas são necessários para impulsionar o entendimento da fisiologia e doenças em animais de pequeno porte, como a mosca da fruta. O método descrito aqui avalia oxidação do combustível, em pequenas quantidades de moscas adultas alimentadas com alimentos contendo quantidades vestigiais de 14 substratos marcados com C, tais como glucose ou ácido gordo. Após o período de alimentação e quaisquer manipulações experimentais adicionais, moscas são transferidos para tubos curtos tapados com malha, que são então colocados em frascos de vidro contendo papel de filtro de KOH-saturado que as armadilhas exalados, CO radiomarcado 2 gerado a partir da oxidação de substratos marcados radioactivamente como bicarbonato de potássio, KHCO3. Este bicarbonato radiomarcado é medida por contagem de cintilação. Este é aqabordagem quantitativa, reprodutível e simples para o estudo da oxidação do combustível. O uso de radiomarcado glicose, ácidos graxos ou aminoácidos permite a determinação da contribuição destas diferentes fontes de combustível para o metabolismo energético em condições diferentes, tais como alimentação e jejum e em diferentes origens genéticas. Isso complementa outras abordagens utilizadas para medir no metabolismo energético vivo e deve favorecer a compreensão da regulação metabólica.

A quantidade de exalado e preso CO 2 marcado radioactivamente que é produzido a partir do metabolismo de um substrato radioactivo deve correlacionar-se com o número de moscas no pod de mosca, bem como a quantidade de tempo que os animais passam no aparelho de recolha de CO 2. Para testar isto, as moscas que foram mantidos em jejum durante 18 horas foram alimentados com ácido palmítico marcado radioactivamente (0,02 uCi / ul comida) durante 2 horas e, em seguida, testados para a produção de CO 2 marcado radioactivamente em grupos de 12 ou 25 animais por 3 ou 6 incubações de RH. A quantidade de CO 2 produzido por 25 moscas foi quase o dobro da quantidade produzida por 12 moscas, ea quantidade para cada grupo dobrou quando o tempo de incubação foi aumentada de 3 horas a 6 horas (Figura 2A). O pmol 14 CO 2 / mosca / hr era quase equivalente em cada grupo. O jejum estimula a decomposição de ácidos graxos por SS oxidation; Por conseguinte, a produção de CO2 a partir da oxidação de ácido gordo devem estar elevados em animais em jejum em comparação com os animais alimentados. Para determinar se este foi o caso, de 18 h de jejum moscas foram alimentados com ácido palmítico marcado radioactivamente, durante 2 h. Seguindo este pulso curto alimentação, moscas foram divididos em dois grupos e transferido para alimentos mosca não marcado ou agar a 1% durante 3 horas e, em seguida, transferidos para fazer vagens durante 2 h. Em duas experiências separadas, moscas perseguido em agar produziram significativamente mais CO 2 radiomarcado com moscas em comparação perseguido no alimento (Figura 2B), indicando que a oxidação SS foi aumentado nos animais em jejum. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figura 1. O aparelho para a recolha exalado, Radiolabeled CO 2. As moscas que foram consumidos substratos metabólicos são radiomarcadoscolocado numa &quot;cápsula fly&quot; (PF), um tubo de centrífuga tapado com corte de malha (M). O pod mosca é colocada num frasco de 20 ml de cintilação de vidro e tapou com uma rolha de borracha superior (S), que contém um orifício para fora do centro, através da qual é colocada uma cavidade central (CW), que contém papel de filtro GF / B saturado com 100 ul 5% de KOH. Exalado CO2 reage com o KOH e é preso no papel de filtro como bicarbonato. Sem saída, CO radiomarcado 2 pode ser quantificada por contagem de cintilação do papel de filtro saturado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figura 2. 14 CO 2 Correlações de Produção com o tempo e o número de moscas em umFly Pod e responde ao Fed e condições de jejum. (A) A quantidade de 14 CO 2 produzido em moscas alimentadas palmitato radiomarcado correlaciona-se com o número de moscas testados (n = 12 (barras abertas) ou 25 (barras a cheio)) e o tempo gasto no pod de mosca (3 ou 6 h ). Em uma base per-fly, moscas produziu 0,99, 1,13, 1,10 e 1,01 pmol 14 CO 2 / hr (dados listados na mesma esquerda para a direita, como dados do gráfico). (B) As moscas que foram perseguidos em agar oxidado mais radiomarcado palmitato de moscas que foram perseguidos em alimentos. Os dados são de duas experiências e são apresentadas como média desvio padrão, n = 16 - 17 moscas / grupo (experimento 1); n = 10 moscas / grupo (experimento 2). * P = 0,017, teste t de Student. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K visualizações.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Bioquímica

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurociência

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Adaptando a microrrespirometria para Drosophila - Insights sobre o metabolismo mutante CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autor em destaque: Influência da temperatura na Drosophila melanogaster e besouros adaptados ao deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em

Resumo

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