Este trabalho foi generosamente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concessão 1R01NS086981 eo Hilton Fundação Conrad N.. Agradecemos ao Dr. Laurent Bentolila e Dr. Matthew Schibler por sua inestimável ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a todos os que contribuíram para o fórum CLAREZA (http://forum.claritytechniques.org). Agradecemos especialmente Dr. Karl Deisseroth para a abertura de seu laboratório para ensinar essa técnica fascinante. Os autores são gratos pelo apoio generoso da Organização Mapeamento Cerebral investigação médica, fundação Mapeamento Cerebral Suporte, Pierson-Lovelace Foundation, a Fundação Ahmanson, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. e Linda R. Fund Filantrópica Dietel e Fundo Northstar . Pesquisa relatada nesta publicação também foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e pelo Escritório do Diretor da Naçãoal Institutes of Health, com os números premiados C06RR012169, C06RR015431 e S10OD011939. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC). THY1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato ratos foram usados ​​para estas experiências, mas nenhum camundongos que expressam proteínas fluorescentes pode ser apagada e fotografada com sucesso. 1. Preparação do Tecido Cuidado: paraformaldeído (PFA) e acrilamida são tóxicos e irritantes. Realizar experimentos utilizando estes reagentes em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Sacrificar o animal na câmara de eutanásia com ~ 1 ml de isoflurano até que a respiração cessa (~ 2-3 min). </li><li> Usar uma bomba peristáltica ajustado para ~ 5 ml / min para perfundir intracardial o rato com uma solução de perfusão (Tabela 1), a 4 ° C até que o sangue é limpo a partir de tecidos (5 - 10 min). </li><li> Alterar o perfusato a solução fixadora (Tabela 1)a 4 ° C até que o pescoço e a cauda endureceram significativamente (5-10 min). </li><li> Terminar a perfusão e decapitar o animal. Cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio removendo primeiro o tecido conjuntivo em torno do crânio e em seguida a remoção de osso a partir da superfície ventral do crânio e o levantamento do cérebro para fora (Figura 1a), tal como descrito em 20. Nota: Dê um cuidado especial para a remoção de osso que circunda os lobos flocculonodular do cerebelo e os bulbos olfatórios. <ol><li> Dissecar a medula espinal a partir da coluna vertebral através da inserção suavemente a ponta de uma fina, tesoura afiada entre a medula espinal e a coluna vertebral e o corte dos segmentos de coluna vertebral individuais embora, tal como descrito em 21. </li></ol></li><li> Hemisect o cérebro, colocando-o numa matriz de plástico de cérebro de ratinho e de corte ao longo da linha média com uma lâmina de matriz. </li><li> Adicionar cada hemisfério e da medula espinhal para separar 50 ml banheira de centrífugaES com ~ 40 ml de solução de hidrogel (Tabela 1). A partir deste ponto tampa para a frente os tubos com folha de alumínio para proteger os fluoróforos durante todas as etapas subseqüentes. </li><li> Incubar o tubo que contém a amostra em hidrogel a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 7 dias. </li></ol> 2. Polimerização <ol><li> Descartar ~ 25 ml de hidrogel, preservando a amostra e ~ 25 ml de hidrogel no tubo de centrifugação. </li><li> Desoxigena-se a amostra removendo a tampa e a colocação do tubo de centrífuga frasco em exsicador e ligar o frasco a vácuo. Aplicar vácuo durante pelo menos 10 minutos para permitir que os gases dissolvidos a sair da solução e formar bolhas. Agite suavemente para desalojar as bolhas. </li><li> Substituir o vácuo no frasco exsicador com gás de azoto a 100% durante 2-3 min. Uma vez que a pressão equaliza (uma vez que a parte superior do frasco exsicador pode ser aberto), rapidamente tampa do tubo para evitar a reintrodução de oxigénio. </li><li> Polímeroize o hidrogel através da colocação do tubo com a amostra num banho de água a 37 ° C durante 3 h até que a polimerização esteja completa. Hidrogel polimerizado irá assumir uma consistência (Figura 1b) do tipo gel. Nota: Uma pequena quantidade de hidrogel não polimerizada no topo é aceitável. </li><li> Usar uma espátula para remover a amostra polimerizada a partir do tubo de centrifugação, depois cortar o excesso de hidrogel a partir da amostra. </li><li> Remover o hidrogel restante, colocando a amostra num fiapos e limpar esfregando suavemente e rolando o tecido nele, deixando para trás apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra. </li></ol> 3. Lipid Remoção Nota: tecido limpou-Lipid é frágil, punho com cuidado. Use um filtro de células durante a drenagem do tubo para evitar a perda de amostra. Além disso, a amostra irá inchar durante o processo de limpeza, no entanto, o inchaço pode ser invertida durante o processo de harmonização do índice de refracção. Cuidado: SodiUM sulfato de dodecilo (SDS) e ácido bórico são irritantes. Realizar experimentos utilizando-os em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga de 50 ml limpos e adicionar 45 ml de tampão de compensação (Tabela 1). Incubar a 45 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). Alterar o tampão por dia durante um período inicial de 7 dias por vazamento fora do buffer de compensação usado para resíduos químicos e adicionando ~ 45 ml de tampão de compensação fresco. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos. </li><li> Após os primeiros 7 dias, incubar a amostra a C e troca de compensação tampão 40 ° a cada 2 - 3 dias. Continue compensação até que todos os lipídios são dissolvidos e tecido atinge a transparência (Figura 1c). Isto vai ser de 4 - 6 semanas para um hemisfério cerebral do rato e 2 - 4 semanas para uma medula espinal. </li><li> Uma vez que o tecido é limpo, transferiramostra para um novo tubo de centrífuga de 50 ml e lava-se 4 vezes em PBST (Tabela 1), a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 horas para remover o SDS residual. </li></ol> 4. Coloração Molecular Cuidado: 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) é um irritante e quaisquer experiências utilizando deve ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 1 ug / ml de DAPI em PBST 1x, pH 7,5. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 24 horas. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos. </li><li> Lavar 3 vezes em PBST à temperatura ambiente durante pelo menos 6 h / lavagem. </li></ol> 5. Índice de Refração Matching Cuidado: 2,2? Tiodietanol (TDE) é um irritante e quaisquer experimentos utilizando-should ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 30% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 h. </li><li> Troca TDE 30% com 63% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave durante 24 horas. Nota: A amostra vai encolher volta ao tamanho de aproximadamente originais. </li><li> Sobre uma superfície plana, limpo rolar um pedaço de adesivo reutilizável para um cilindro com diâmetro uniforme apenas ligeiramente maior do que a espessura da amostra. </li><li> Colocar o cilindro de adesivo reutilizável em um círculo aberto (~ 25 mm de diâmetro interno com uma pequena abertura na parte superior) em um 40 mm prato de vidro de fundo. Se correcções devem ser feitas, remover o cilindro a partir do vidro e cortado com uma lâmina de barbear. </li><li> Utilizar uma ponteira P1000 pipeta para criar um selo entre o adesivo reutilizável e vidro porrolando-o em torno do rebordo exterior do cilindro. </li><li> Lugar ~ 100 mL de 63% TDE para o prato de vidro e se espalhou para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo de adesivo reutilizável. </li><li> Usando uma espátula, coloque cuidadosamente a amostra no meio do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas. </li><li> Pipeta mais 100 ul de 63% TDE diretamente sobre a amostra, em seguida, coloque imediatamente a 40 milímetros circular tampa de vidro sobre o adesivo reutilizável. </li><li> Usando o indicador, médio e anelar de ambas as mãos, pressione cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que a tampa de vidro fez contato com a amostra. </li><li> Lentamente trazer o fundo da placa de vidro para uma posição vertical de descanso de encontro a uma superfície, em seguida, adicionar 63% TDE com uma pipeta até que a solução atinge a pequena abertura na parte superior. Usar um cotão livre limpe para secar a ponta da pipeta de modo a que a solução não goteje sobre o vidro. Para evitar bolhas na câmara, não esvaziar a pipeta de todo o caminho. </li><li> Paraa pequena abertura, adicionar de elastómero de silicone para delimitar o círculo e criar uma câmara fechada. Espere 5 minutos para secar antes de imagem. </li></ol> 6. Microscopia Cuidado: Os lasers usados ​​em confocal, iluminação plano único e microscopia folha de luz são muito poderoso e pode causar cegueira. Quaisquer experiências utilizando lasers deve ser realizada após o treinamento extenso e com grande cuidado e proteção para os olhos adequada. <ol><li> Coloque a câmara de imagem com a amostra dentro no palco de um microscópio de varredura a laser confocal. </li><li> Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais). Para ligar o laser de argônio de excitação, clique na guia de configuração na parte superior do programa, em seguida, no ícone do laser. Verifique a caixa ao lado de argônio para energizar o laser e mover a escala deslizante para 30%. Observar o ponteiro lentamente aquecer para a posição seleccionada. <ol><li> Retornar à guia adquirir no topo. Na caixa grande &quot;Configurações caminho do feixe &amp;# 34; ir para a carga / salvar caixa de configuração e selecione o menu drop-down para selecionar um canal de comprimento de onda adequado para a imagem YFP (527 nm). </li></ol></li><li> Selecione objectivos adequados para imagiologia por localizar a hiperligação vermelho escrito &quot;objetivo: objeto atual&quot; abaixo da caixa de configurações do canal. Ao clicar na guia abre todos os objetivos disponíveis e uma selecção irá girar automaticamente a torre. <ol><li> Utilização objectivos (por ex., 10X), com um raio grande de trabalho (maior do que a espessura do tecido a ser visualizado, por exemplo: 11 mm) e uma grande abertura numérica (por ex., 0,3) para maximizar no plano resolução de imagem e minimizar espessura de corte óptico. </li></ol></li><li> Na coluna à esquerda da menus drop-down, abra o &quot;XY: resolução&quot; janela para definir matriz de aquisição, chamado de &quot;formato&quot;, a 1.024 x 1.024 ou um valor adequado para o limite de resolução lateral do objectivo. Defina o fator de zoom mais baixo possível (por exemplo., 10,7). </li><li> Na mesma janela, jogo 8 média de linha e um quadro de parâmetros médios por cair para baixo os menus marcados individualmente em conformidade. Use valores grandes para uma alta relação sinal-ruído e valores pequenos para a aquisição rápida. Nota: 8 médias de linha e uma média quadro vai adquirir imagens de um hemisfério do cérebro do rato de alta qualidade em aproximadamente 4 horas. </li><li> Localize a amostra usando os controles do estágio. Uma vez que um campo representativo é visível, definir o ganho e offset. Nota: O ganho e offset variará substancialmente com base no tipo de tecido, fluoróforos, e / ou característica anatômica a ser trabalhada. Para YFP, definir valores de 760-780 para o ganho e de -1,0 para -1,5 para o deslocamento. </li><li> Selecione &quot;varredura telha&quot; e selecione os limites da região de interesse. Definir os limites superior e inferior do z-stack a ser adquirido. Definir a espessura da secção óptica baseado em secção de limite de resolução óptica do objectivo. Nota: Um objetivo dolimite de resolução óptica secção é definida principalmente pela sua abertura numérica. A maioria dos softwares de controle microscópio irá calcular automaticamente um valor apropriado para o objetivo que está sendo usado. Para uma objectiva 10X com uma abertura numérica de 0,3 que seria de aproximadamente 11 uM. </li><li> Iniciar a aquisição. Nota: Isso pode demorar vários horas. </li><li> Coletar imagens de alta resolução usando objectivos maior ampliação de regiões específicas de interesse. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

clearing passiva de tecidos de hidrogel incorporado (clareza passiva) é um método simples e barato para limpar grandes pedaços de tecido. Esta abordagem não requer equipamento específico e pode ser facilmente realizada num agitador com temperatura controlada. Durante o período de algumas semanas, mesmo grandes, tecidos altamente mielinizados, como um cérebro inteiro ou medula espinhal, vai se tornar transparente e adequado para microscopia. Embora este relatório concentrou-se a limpeza de tecidos do SNC, Clareza passiva pode ser aplicado a qualquer tecido. Os pontos fortes e fracos de técnicas de limpeza ópticos foram discutidos anteriormente na literatura 13,17,22, mas são mais claramente definidos em 23. Clareza passiva é bem adequado para experiências em que um grande número de amostras simultaneamente, estão a ser apagada e a reprodutibilidade é de grande importância. A utilização de um hidrogel para fornecer suporte adicional ao tecido facilita multiple sondagem do tecido. Neste relatório, uma pequena corante peso molecular, DAPI, foi demonstrada, mas várias rodadas de anticorpo sondagem também são possíveis com esta abordagem. A abordagem descrita acima se desvia do nosso protocolo publicado anteriormente 15 em um par de formas significativas. Em primeiro lugar, no actual abordagem, os espécimes foram perfundidos não intracardial com hidrogel. Isto deveu-se ao facto de o hidrogel pode prematuramente polimerizar na tubagem e agulhas do aparelho de perfusão, levando a perfusões incompletos e de compensação inconsistente. A incubação de tecidos fixados em paraformaldeído hidrogel durante 7 dias é consistente com o protocolo original de 14 Clareza, apesar de uma incubação de um dia é utilizado para 1 - 3 mm de espessura secções de tecido na técnica Clareza passiva (PACT) 17. Em segundo lugar, esta abordagem efectua a remoção de lípidos a uma temperatura ligeiramente mais elevada que a previamente relatada 15-17. temperatur superiore acelera a remoção de lipídios, mas deve ser equilibrado com a possibilidade de uma perda catastrófica da integridade do tecido (fusão). Ao aumentar a temperatura de incubação de 8 ° C (a 45 ° C) durante 7 dias e, em seguida, 3 ° C (40 ° C) durante o restante do processo de remoção de lípidos, limpeza de tecidos é acelerado, sem o risco concomitante de a perda da integridade do tecido. Este aumento de temperatura é consistente com as temperaturas reportadas durante electroforética de Compensação do tecido (etc) no protocolo de Clareza inicial (50 ° C) 14. Além disso, não houve diminuição da intensidade de fluoróforos expressas transgenicamente, nem diminuição da coloração de DAPI foi observada. A desoxigenação é um passo importante na criação do hidrogel. O hidrogel pode polimerizar na presença de oxigênio dissolvido na solução de hidrogel, mas em nossas mãos a taxa e integridade de polimerização foi muito mais variável sem desoxigenação. Se o hO ydrogel não polimerizar, o motivo mais comum é a presença de oxigênio no hidrogel. O processo de compensação óptica é notavelmente fácil de implementar, contudo, a microscopia que se segue pode ser bastante complicado. De importância fundamental são os objectivos utilizados para a imagem do tecido. A distância de trabalho de um objetivo define a profundidade que ele pode imagem em uma amostra de tecido. Um objectivo, com uma distância de trabalho de 2 mm podem única imagem 2 milímetros em uma amostra, por conseguinte, a distância de trabalho de um objectivo deve ser maior do que a espessura da amostra, a fim de imagem-a completamente. Do mesmo modo, a abertura numérica de um objectivo coloca um limite do tamanho de recursos que ela pode resolver ambos no plano e a espessura das secções ópticas que ele pode adquirir significativamente. Selective plano de iluminação Microscopia (SPIM) e folha de Microscopia de Luz (CLS) pode ultrapassar a limitação de espessura de corte óptico pela natureza da iluminação, mas estes microslida não estão amplamente disponíveis. alta abertura numérica, os objectivos de grande distância de trabalho são raros e caros, mas são necessárias para geração de imagens de alta qualidade a partir de grandes secções opticamente limpas. Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, eles são frequentemente muito grandes, variando a partir de várias centenas de MB de baixa resolução (tanto no plano e a direcção z) para alguns TB para uma imagem de alta resolução recolhidas numa LSM. Os computadores utilizados para análise de imagem exigem não só uma grande quantidade de armazenamento, mas grandes quantidades de memória de acesso aleatório (RAM) para o processamento de imagem. Pacotes de software adequado da análise de grandes volumes de imagens opticamente apuradas incluem Amira, Imaris e ImageJ 14-16. Entre as limitações desta abordagem, CLARITY passiva requer mais tempo para limpar tecidos do que outras abordagens de compensação óptica. Diminuindo o volume do tecido a ser limpo por recorte ou corte em pedaços mais pequenos podem accelrar lipídico-remoção. Além disso, diminuindo a concentração de paraformaldeído no hidrogel, por sua vez diminuição de reticulação e aumentar o tamanho hidrogel poros, levando a compensação mais rápida 17, embora isso possa levar a uma maior expansão do tecido, experimentadores individuais pode achar que vale a pena a diminuição da compensação Tempo. Além disso, combinado com TDE como um agente de eliminação, a quantidade de expansão total do tecido pode ser limitada. Embora este relatório descreve o uso de pequenas corantes peso molecular, o anticorpo de sondagem é um passo muito natural. A presença do hidrogel não só proporciona suporte físico para os tecidos apuradas, mas também serve como um impedimento para que a penetração de anticorpos profundamente no tecido. Diminuir a concentração de acrilamida ou paraformaldeído a concentração vai aumentar o tamanho dos poros no hidrogel, facilitando (e, assim, acelerar) anticorpo penetração 17, mas este tem um efeito deletério sobre tissue expansão. No entanto, o anticorpo sondagem de blocos de tecido pode ser realizado em questão de dias e em todo o cérebro de um par de semanas utilizando as concentrações de acrilamida e paraformaldeído descritos no relatório original 14. técnicas de limpeza ópticas permitem olhar profundamente no cérebro, promovendo a compreensão da sua estrutura e função. Estas novas ferramentas vão permitir aos investigadores para visualizar o cérebro em resoluções celulares e moleculares, aumentando a nossa compreensão da mais complexa de órgãos.

The ability to image complete neuroanatomical structures is immensely valuable for understanding the brain in health and disease. Traditionally, 3D imaging has required tissue sectioning to provide the axial resolution and to visualize deep anatomical structures. This approach can produce high-resolution data sets, but requires sophisticated image reconstruction techniques and is very labor intensive. As a result, it has been limited to the imaging of small volumes of tissue1-3. Optical sectioning, on the other hand, is well suited for the creation of high-resolution 3D images of fluorescently labeled tissues. Since optical sectioning is inherently three dimensional, it does not require extensive computation to produce a 3D image volume. However, light scattering and tissue opacity limit the depth at which tissues can be optically sectioned. The depth of imaging is limited to about 150 &#181;m in laser scanning confocal microscopy and to less than 800 &#181;m using two-photon excitation microscopy4-8.
In order to overcome these limitations, several optical clearing techniques have been recently developed and then further refined to permit the deep microscopic imaging of intact tissues. The use of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB) to render fixed tissues transparent was among one of the earliest approaches9. However, this approach was limited by the quenching of fluorescence in the samples and incomplete clearing of highly myelinated structures10. Refinements of this technique, such as 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), have led to very rapid and complete tissue clearing, but still suffer from rapid loss of fluorescent signals, especially yellow fluorescent protein (YFP)10. Water-based clearing solutions, such as Sca/e11 and SeeDB12, preserve fluorescent signals, but do not completely clear highly myelinated tissues. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is a promising new optical clearing technology that appears to overcome the limitations of previously developed water-based clearing solutions13. In contrast with other optical clearing techniques, Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 embeds the brain in a porous matrix that provides structural integrity to proteins, nucleic acids and small molecules, while leaving lipids unbound. The lipids are then removed electrophoretically, culminating in an optically cleared brain that can be easily visualized and equally easily probed using commonly available techniques.
Electrophoretic tissue clearing (ETC) is used to remove lipids from hydrogel embedded tissues in CLARITY, however, ETC can be difficult to implement consistently and tissues subject to electrophoresis can exhibit tissue distortion, browning, loss of fluorescence and antibody reactivity. Passive lipid clearing avoids these limitations, but requires increased clearing times15-17. Passive clearing also permits the clearing of large numbers of samples in parallel, since it is not limited by the number of ETC apparatuses available. Decreasing the concentration of paraformaldehyde and excluding bis-acrylamide from the hydrogel have led to great increases in the speed of clearing at the expense of greater tissue expansion16. Less expensive alternatives to the refractive index matching solution used in the original CLARITY technique have been developed17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is an inexpensive and rapid brain clearing agent that reverses some of the tissue expansion that occurs during lipid removal18. This report incorporates passive clearing of hydrogel embedded tissue and the use of TDE as a refractive index matching solution to the original CLARITY technique to produce a highly reproducible and inexpensive protocol for the optical clearing of the mouse central nervous system.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-1</td>
			<td style="width:203px;">buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:212px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-5</td>
			<td>perfusion and hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2&#39;-thiodiethanol (TDE)</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">166782-500G</td>
			<td>refractive index matching solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2% bis-acrylamide</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0142</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VA-044 initiator</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>VA044</td>
			<td>hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">boric acid</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7901</td>
			<td>clearing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP166-5</td>
			<td>clearing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">55255-1</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium azide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">52002-100G</td>
			<td>preservative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triton x-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-500G</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3393-50KU</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium nitrate</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP360-500</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">99.9% isoflurane</td>
			<td style="width:212px;">Phoenix</td>
			<td style="width:119px;">57319-559-06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">hydrocholoric acid</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A1445-500</td>
			<td>buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass bottom dish</td>
			<td style="width:212px;">Willco</td>
			<td style="width:119px;">HBSB-5040</td>
			<td>Willco dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">reusable adhesive</td>
			<td style="width:212px;">Bostick</td>
			<td style="width:119px;">371351</td>
			<td>Blu-Tack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">silicon elastomer</td>
			<td style="width:212px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-CAST</td>
			<td>Kwik-Cast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lint-free wipe</td>
			<td style="width:212px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td>KimWipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse brain matrix</td>
			<td style="width:212px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">SA-2175</td>
			<td>sectioning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">matrix blades</td>
			<td style="width:212px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-9887</td>
			<td>sectioning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:212px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77122-24</td>
			<td>pefusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">imaging software</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">LAS AF</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Visualizando a organização estrutural do cérebro é fundamental para a compreensão de como morfologia e conectividade afetar a função cerebral na saúde e na doença. técnicas de limpeza ópticas tornam possível a populações de células de imagem em 3D em tecidos intactos, o que nos permite estudar a morfologia e conectividade coesa. Os ratinhos que expressam proteínas fluorescentes impulsionado por promotores específicos para sub-populações de células permitir uma para provocar uma separação do complexo padrão de conectividade neural no cérebro. Ratinhos transgénicos THY1-YFP foram utilizados extensivamente na literatura de compensação óptica porque estes ratinhos expressam YFP em um subconjunto de neurónios de projecção que residem no córtex cerebral e no hipocampo, bem como outras estruturas no cérebro (Figura 2a e b). Além disso, YFP + neurônios corticais camada V do projeto através do trato corticospinal nos sPinal cabo (Figura 2c &amp; d), tornando-os muito útil para avaliar o efeito do insulto axonal e / ou lesões na medula espinal em neurónios corticais 15. Através da utilização de microscopia confocal e seccionamento de tecidos óptica opticamente apuradas pode facilmente avaliar as diferenças na densidade neuronal através de grandes estruturas anatómicas. Além de ratinhos transgénicos THY1-YFP, qualquer número de ratinhos transgénicos podem ser trabalhada. Camundongos transgênicos PLP-EGFP expressa reforçada verde proteína fluorescente (EGFP) em oligodendrócitos maduros que expressam a proteína proteolipï¿½ica (PLP) em todo o cérebro ea medula espinhal (Figura 3a). Ratinhos transgénicos PV-TdTomato expressar TdTomato em um subconjunto de parvalbumina (PV) que exprime interneurónios no cerebelo, corpo estriado e hipocampo (Figura 3b). Mesmo em ratinhos que não expressam transgenes fluorescentes, corantes fluorescentes de pequeno peso molecular, tais como DAPI, pode difundir facilmente para os tecidos de hidrogel incorporado e permitem a avaliação dos núcleos celulares no cérebro (Figura 4). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig1.jpg" /> Figura 1:. Diferentes Fases do Cérebro Clearing Fotografia do cérebro THY1-YFP + mouse que tem sido retirados do crânio (a). Fotografia de THY1-YFP + rato hemisfério cerebral incorporado-hidrogel (b). Fotografia de THY1-YFP + rato hemisfério cerebral após a remoção de lipídios (c). Barras de escala são 5 mm em cada painel. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig2.jpg" /> Figura 2: Expressão THY1-YFP no cérebro de umnd medula espinhal. Thy1-YFP + neurônios no córtex cerebral e hipocampo fotografada em 5X e reconstruída em 3D (a). Uma projeção de intensidade máxima de uma pilha de 10X do córtex cerebral demonstrando a arborização dendrítica de neurônios camada V piramidais corticais (b). expressão THY1-YFP em uma medula espinhal cervical e torácica intacta fotografada em 5X e reconstruída em 3D (c). Uma projeção de intensidade máxima de uma pilha de 10X da medula espinhal demonstrando axônios individuais (d). Barras de escala são de 1 mm de (a), 100 mm em (b), 2 mm em (c), e 100 mm em (d). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig3.jpg" /> Figura 3: PLP-EGFP e PV-TdTomato expressão no cérebro. </strong&gt; expressão EGFP-PLP numa secção coronal do cérebro 2 mm de espessura fotografada em 5X (a). Esta imagem é de cerca de 1 mm em relação à superfície da secção de tecido. expressão PV-TdTomato no cerebelo de um hemisfério cerebral intacta fotografado de ampliação 10X (b). Esta imagem é de aproximadamente 0,5 mm do plano sagital mediano. Barras de escala são de 1 mm de (a) e 250 mm em (b). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig4.jpg" /> Figura 4: Coloração DAPI na expressão DAPI cerebral no cerebelo de um hemisfério cerebral intacta fotografada em 5X.. A imagem é de aproximadamente 1 mm do plano sagital mediano. A inserção mostra o nível de detalhe visível a essa profundidade de imagens em aumento de 10x. Escala de barras de umre 250 mm no painel principal e 50 mm na inserção. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amortecedor </td><td> Químico </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> solução de perfusão </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampão fosfato salino </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> nitrato de sódio </td><td> 0,5% w / v </td></tr><tr><td></td><td> heparina </td><td> 10 U / ml </td></tr><tr><td> solução fixadora </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampão fosfato salino </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyde </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td> solução de hidrogel </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampão fosfato salino </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> paraformaldeído </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> acrilamida </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Bis-acrilamida </td><td> 0,05% v / v </td></tr><tr><td></td><td> VA-044 Iniciador </td><td> 0,25% w / v </td></tr><tr><td> tampão Clearing </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Ácido bórico </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td></td><td> Dodecilsulfato de sódio </td><td> 4% w / v </td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampão fosfato salino </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% v / v </td></tr><tr><td></td><td> A azida de sódio </td><td> 0,1% w / v </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de tampões e soluções.

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K visualizações.  University of California, Los Angeles. Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Vídeo: Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...