Name: isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Ministério da Saúde de Israel. Todos os animais foram tratados de acordo com o protocolo animais cuidado institucional aprovado IL-02302-2015 do Technion Israel Institute of Technology. 1. Preparação Experimental <ol><li> Preparação de Soro Fetal Bovino quelatado Nota: As células epiteliais são muito sensíveis ao cálcio por isso é crucial para controlar a exposição dessas células ao cálcio. A fim de assegurar que as células não estão expostos ao cálcio durante o processo de isolamento de quelação é usado para remover qualquer cálcio residual do Soro Bovino Fetal utilizado para a preparação de tampão de coloração 29. O protocolo a seguir prepara-se aproximadamente 1 L de cálcio livre de Soro Fetal Bovino a necessária para a preparação tampão de coloração de FACS. <ol><li> Adicionar 400 g de material seco quelante, por exemplo,., Chelex, em um 4 L copo e adicionar H2O destilada para um volume total de 4 L. tampa e mexa continuamente por meio de um agitador magnético. </li><li> Ajustar o pH para 7,4 utilizando HCl 10 N solução enquanto se agitava. Continuar a agitação durante 20 min, e re-ajustar o pH conforme necessário até que o pH se mantém estável durante mais de 20 min. </li><li> Incubar proveta a 4 ° C durante a noite para permitir que o material de quelação para formar um sedimento compacto. Cuidadosamente aspirado de H2O destilada e adicionar H 2 O fresco até um volume total de 4 L. </li><li> Repetir o ajuste do pH como no passo 1.1.2. </li><li> Colocar a proveta a 4 ° C durante 1 h para permitir que o material de quelação para formar um sedimento compacto. Aspirar cuidadosamente H 2 O. </li><li> Lentamente, adicionar duas garrafas de 500 ml de soro fetal de bovino para o material quelante. Agita-se lentamente a 4 ° C durante 1 h garantia de que a configuração da velocidade não produz bolhas. </li><li> Colocar a proveta a 4 ° C durante 1 h para permitir que o material de quelação para formar um compagir pellet. </li><li> Transferir cuidadosamente o soro para um frasco de vidro G e filtrar através de um filtro de topo de garrafa, em condições estéreis. Armazenar o soro quelado a -20 ° C ou utilizar imediatamente. </li></ol></li><li> Preparação de Tampão de Coloração <ol><li> Preparação de 100 ml de 3% de FBS em PBS quelatado sem Ca 2+ e Mg 2+ e manter em gelo. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento dos folículos pilosos de adultos Epidermis <ol><li> Anestesiar ratos usando 5% de isoflurano usando uma caixa de indução. O protocolo aqui descrito foi optimizado utilizando ratinhos de idade 50-80 dias que se encontram na fase telogénica do ciclo de HF. </li><li> Eutanásia ratos de acordo com procedimentos laboratoriais normalizados. Aqui, eutanásia ratos usando CO 2 overdose em uma câmara de eutanásia. </li><li> Raspar todo o cabelo da pele dorsal usando cortadores elétricos. Evite cabeça e os membros. Mantenha a tesoura o mais próximo possível para a pele. Evitar danos à pele e subcutâneo. </li&gt; <li> Quando todo o cabelo é removido, use 70% de etanol para remover qualquer resíduo de cabelo e para desinfectar a pele dorsal. </li><li> Posicione o mouse sobre uma almofada de dissecação, e usando uma pinça puxe a pele perto da cauda e fazer uma pequena nick com uma tesoura. Cortar toda a pele dorsal em um sentido póstero-anterior com cuidado cortando a pele e separando-a da fáscia. Evite danificar a camada subcutânea. </li><li> Coloque a pele em uma esteira de dissecação, a equipa de cabelo voltada para baixo e fixar para baixo duas bordas adjacentes da pele para fixar no lugar. Raspe fora da gordura, utilizando um bisturi sem corte até que a derme é claro e limpo. Nota: Quando raspar a gordura, use uma pinça curva para aplicar pressão suave na pele. Aplicar pressão sobre a pele usando o lado curvo de uma pinça. Isso vai impedir que a pele rasgar. </li><li> Coloque a pele, derme lado de baixo, em 100 mm de prato de cultura estéril, e alisar a pele para assegurar que não existem pregas. Adicionar 10 ml de PBS sem Ca 2+ </sup&gt; e Mg 2+ (PBS -) para a placa de cultura e endireitar a pele, se necessário. </li><li> Aspirar o PBS e adicionar 10 ml de tripsina a 0,25%. Certifique-se de que a pele é desdobrado e está flutuando livremente. Incubar um pedaço de pele por 10 ml de 0,25% de tripsina. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C durante 30-120 min ou a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 3. Preparação de suspensão de células individuais partir de folículos pilosos <ol><li> Raspar todo o cabelo fora da pele usando uma pinça curva e um bisturi, num anterior à direção posterior. Segure a pele no local usando o lado curvo de fórceps e usar o bisturi para raspar o cabelo. Nota: raspar o cabelo na solução de tripsina adicionada no passo 2.8. Comece na cauda e seguir a direção do crescimento do cabelo. Raspando contra a direção do crescimento do cabelo irá resultar em perda substancial de HF e redução no rendimento celular. HF tendem a aderir a cada conjunto e formam pequenos aglomerados; a fim de reduzir the tamanho dos aglomerados HF tentar raspar uma pequena área de cada vez. </li><li> Transferir a pele sem pêlos para a nova placa de cultura e adicione 10 ml de PBS - para evitar que a secagem. Inspecione a pele e raspar todo o cabelo restante. </li><li> Quebrar HFS, utilizando um bisturi e pinças até que um único suspensão HF é obtido. Vigorosamente triturar a suspensão HF usando 10 ml pipeta por alguns minutos para quebrar todos os aglomerados de cabelo. Nota: executar todos os passos seguintes em gelo. </li><li> Transferir a suspensão de HF na pré-rotulados 50 ml tubo. </li><li> Aspirar o PBS - a partir da pele e usá-lo para lavar o prato de cultura celular que continha a suspensão HF; transferir para o tubo de 50 ml. </li><li> Lavando <ol><li> Filtra-se a suspensão através da passagem por um filtro celular de 70 uM encaixada sobre um tubo de 50 ml. Lavar o tubo de 50 ml inicial e o filtro com 10 ml de tampão de coloração (PBS - com 3% de FBS quelado). </li><li> Filtra-se a suspensão através da passagematravés de filtro de 40 | iM de células encaixada sobre um tubo de 50 ml. Lavar o tubo com 5-10 ml de tampão de coloração para assegurar que todas as células foram transferidas para o novo tubo. Manter a suspensão em gelo até que todos os animais tenham sido processadas. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 300 xg, a 4 ° C. sobrenadante cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de coloração. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 800 ul de tampão de coloração. Nota: Os volumes indicados acima é suficiente para a coloração de células derivadas de dois ratos adultos. </li></ol></li><li> Transferência de suspensão em tubos de FACS pré-rotulados. <ol><li> Para tubos de controles, tome 25-50 mL de suspensão de células (ou qualquer esquerda residual da suspensão de células) e perfazer um volume total de 300 ul com tampão de coloração. Nota: Preparar tubos de controlo (volume total de 300 ul) para imaculada (sem anticorpoe não DAPI); única DAPI; Integrina β1; Integrina α6; Sca-1; CD34. </li></ol></li><li> Adicionar os anticorpos primários e DAPI (ver tabela Materiais para as diluições adequadas) nas concentrações desejadas para o tubo adequado. Agite suavemente os tubos para misturar a suspensão de células. O retorno sobre o gelo e cobrir com folha de alumínio para proteger da luz. </li><li> Incubar durante 30 min em gelo e agite suavemente os tubos a cada 10 minutos para garantir as células são mantidas em suspensão. </li><li> Lave as células através do preenchimento de cada tubo FACS com tampão de coloração (cerca de 4 ml por tubo); centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 800 ul de tampão de coloração. </li><li> Transferir suspensão de células no tubo de FACS com tampas de filtro de células para assegurar suspensão única célula. </li></ol> 4. Análise por Citometria de Fluxo <ol><li> Prossiga para a separação de células imediatamente, usando um citômetro de fluxo com filtros adequados para signal detecção. Use 405 nm violeta (para medições de DAPI), 488 nm azul (para medições de FSC, SSC, PE, PE-Cy7 e FITC) e 633 lasers vermelhos nm (para excitação do APC) Nota: Certifique-se de que o instrumento está a gravar a partir detectores para todos os três canais fluorescentes. </li><li> portões definir fluorescência com base em amostras não coradas e compensações para sobreposição espectral usando controles manchadas individuais. Nota: Use os controles individuais coradas para ajustar a compensação entre canais, a fim de eliminar qualquer sobreposição nos sinais fluorescentes. ajuste de compensação dependerá do classificador FACS usado. </li><li> Configurar portas primários com base em DAPI para excluir as células mortas. </li><li> Ajuste o gráfico de dispersão (SSC-A vs FSC-A) para selecionar para eventos singlet. </li><li> Configurar FSC e altura SSC e os parâmetros de largura para eliminar para dobletes e discriminar para eventos singlet. </li><li> células portão com alta α6 e expressão β1 e deste população de células de gaveta com qualquer CD34 elevada expressão ou expressão elevada Sca1. </li><li> Ordenar células para um tubo de FACS pré-rotulados. Nota: Duas populações de células gerais pode ser isolado; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - e α6 + / + β1 / Sca-1 + / CD34 -. As células seleccionadas devem ser mantidos em gelo em todos os momentos, até que sejam utilizadas aplicações a jusante, tais como a cultura de células ou de isolamento de ARN </li></ol>

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The authors have nothing to declare

O protocolo aqui descrito está bem estabelecida para isolamento de HFSCs da pele dorsal de ratos adultos, mas pode ser igualmente aplicado para o isolamento de outras populações no interior da estrutura de HF, baseado na selecção de marcadores 2,16,23,28,29. Este método é especialmente vantajosa em relação a outros métodos de isolamento de células, tais como a dissociação de tecidos, em que um tipo específico de célula pode ser seleccionada e colhida a partir de uma mistura de populações de células heterogéneas. Além disso, o método descrito aqui é rápido e fiável e podem ser utilizados para isolar até quatro diferentes populações HFSC com base nos níveis de expressão dos marcadores utilizados diferencial. Ele pode ser utilizado para o enriquecimento e isolamento de HFSCs para posterior análise molecular, tal como ARN-Seq ou espectrometria de massa, mas também para a cultura de células subsequente e expansão e no enxerto in vivo. A preparação de uma alta qualidade, a suspensão de célula única é um componente essencial de uma SUCcessful FACS 29. A eficiência deste protocolo também depende do material de partida usado para o isolamento de HF. A fim de minimizar a quantidade de tecido não-epidérmica na cuidados material de partida deve ser feita quando o barbear e quando dissecando a pele dorsal. Isto melhora a pureza e o rendimento das células epidérmicas. A fim de assegurar uma suspensão de células única óptima, HFS deve ser raspada em uma cabeça a direcção da cauda e em pequenas quantidades de cada vez, assegurando que todos os tufos de cabelo está dividido em peças mais pequenas utilizando um bisturi e que uma única suspensão de HF é obtido . Além disso, as células devem ser manusear com cuidado em todos os momentos e suspensões devem ser mantidas em gelo para garantir a viabilidade celular. Finalmente, técnicas estéreis são críticos para minimizar o risco de contaminação, especialmente se as células que devem ser utilizados para a cultura de células. No protocolo aqui descrito, o isolamento de diferentes populações de células é conseguida por meio de quatro marcadores de superfície celular. UMApasso crucial para a separação de células de sucesso é as configurações iniciais adequadas do FACS, a compensação adequada usando controles manchadas individuais e a hierarquia dos parâmetros de propagação. separação de células bem sucedida também exige a eliminação de detritos e efetivamente discriminar eventos singlet de dobletes / agregados. Singlets foram distinguidos de dobletes com base no FSC e largura e altura SSC parâmetros. Os parâmetros para a separação de células têm de ser ajustados de acordo com o tipo de classificador, mas também para o conjugado com fluorocromo utilizados. Aqui, PE fluorescência foram obtidos utilizando um filtro 585/42, FITC e PE-Cy7 fluorescência foram recolhidos usando um 530/30 e filtro 780/60, respectivamente, e APC de fluorescência foram obtidos utilizando um filtro 780/60. separação de células é realizada inicialmente por gating de células vivas com base em baixa expressão DAPI e dispersão para a frente. eventos singlet foram inicialmente selecionados, ajustando o portão de dispersão e dobletes foram eliminados por gating um<html> gainst singletos para a frente, seguido de interiores de dispersão. Dois anticorpos de integrina, e α6 β1 foram usadas para seleccionar para células epidérmicas para garantir enriquecimento para todos os SCs bojo. Blanpain et al., Mostraram a presença de duas populações de HFSCs bojo que expressam níveis elevados ou baixos quer de integrina α6 mas positivo para CD34 2. Consequentemente, células que expressam tanto β1 alta / baixa e α6 β1 alta / alta α6 deve ser selecionado antes de gating para CD34. Duas populações foram então seleccionadas com base na expressão de um marcador específico a protuberância SCs, CD34, e um marcador que selecciona queratinócitos epidérmicos, Sca-1 23. Sca-1 se co-localiza com a integrina-α6 no infundibulum e a IFE mas não é expresso no bojo HF. Em contraste, HFSCs bojo expressam CD34 e integrinas-α6 23, permitindo que o isolamento diferencial de duas populações distintas; HFSCs e queratinócitos epidérmicos. e_content &quot;&gt; O método robusto discutido aqui tem sido utilizada para uma série de aplicações a jusante, por exemplo, o isolamento de cultura de células para HFSCs 23,28, 23,24 enxerto e análise molecular 17. Além disso, seleccionando uma combinação de marcadores específicos ou utilizando diferentes ratinhos repórter permite o isolamento de subpopulações de dentro da estrutura de HF, por exemplo, Lgr6 21, Lgr5 25, Lrig1 24 e permite uma comparação directa de alterações moleculares que ocorrem nestas células. Além disso, entre outras aplicações, este método pode ser usado para comparar alterações no número HFSC no tipo selvagem contra animais knockout, examinando mudanças nas populações SC em cima da ferida infligida 28 e é, portanto, uma ferramenta valiosa na SC e da pele pesquisa.

As células estaminais adultas (SCS) são essenciais para a manutenção da homeostase do tecido, substituindo células que morrem e reparar tecidos danificados após a lesão. Estes SCs são definidas pela sua capacidade para sofrer auto-renovação contínua e de se diferenciar em linhagens celulares diferentes 1-3. Os sistemas mais bem estudados, as quais são dependentes de SCs adultos para a sua reposição, incluem o sistema hematopoiético, o intestino e o 1,2,4 pele. Durante a embriogénese, a pele começa como uma única camada de células epidérmicas. Morfogênese do folículo piloso (HF) começa quando as células mesenquimais preencher a pele e formam uma subjacentes derme colágenas 5. Especializada células mesenquimais, que mais tarde constituem a papila dérmica (DP), organizam diretamente abaixo da camada epidérmica e estimulam o epitélio para formar placodes cabelo que começam a crescer para baixo 6. Altamente proliferação de células da matriz, situados na parte inferior do HF,envelope estas células mesenquimais e formar o bulbo capilar, enquanto que a camada interna começa a diferenciar-se em cilindros concêntricos de modo a formar o eixo do cabelo (HS) e a bainha envolvente interior raiz (IRS) 2,3. Na vida pós-natal a epiderme da pele é composta de três compartimentos: a epiderme interfoliculares (IFE), a glândula sebácea (SG) e o HF. Em contraste com o IFE e SG, que estão em constante estado de homeostase, o HF é um mini-órgão dinâmico que sofre ciclos contínuos de crescimento (anágena), destruição (catágena) e repouso (telógena) 4,7. As células-tronco do folículo piloso (HFSCs) que o combustível este ciclo perpétuo, residir em um nicho especializado dentro do HF conhecido como o bojo 4. Durante anágena os HFSCs sair do bojo, seguindo sinais de ativação do DP, começam a proliferar e descer para baixo, criando assim uma trilha linear longo de células conhecidas como a bainha externa da raiz (ORS) 8-10. As células da matriz, quecercar o DP na base de HF, rapidamente ciclo e migrar para cima passando por diferenciação terminal gerando assim o HS e o IRS 10 (Figura 1). A duração do anágeno determina o comprimento do cabelo e é dependente da capacidade proliferativa e de diferenciação das células da matriz 6. Quando o HF entra catágena, as células da matriz-amplificação de trânsito na cessar lâmpada a proliferar, sofrem apoptose e regridem completamente enquanto puxa o DP para cima até que ele atinja a parte não-ciclismo do HF 8,11. Durante esta retracção, o HF forma uma estrutura temporário conhecida como a cadeia epitelial, que é característica de catágena e contém muitas células apoptóticas. Em ratinhos, catágena dura entre 3-4 dias e é altamente sincronizadas no primeiro ciclo do cabelo. Quando o HF atinge todos os telógena HFSCs se tornar quiescente. As diferentes etapas do ciclo de IC também são caracterizadas por alterações na cor da pele do rato devido a mprodução elanin. As alterações na pele de preto durante anágena ao cinza escuro durante catágena a rosa durante telógeno 6,7,12,13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Figura 1: O ciclo de folículo piloso. O HF é composto por uma parte superior permanente e um menor em constante remodelação, a porção de ciclismo que sofre ciclos contínuos de crescimento rápido (anágena), destruição (catágena) e uma fase de quiescência parente ou repouso (telógena). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.</a> Os SCs mantendo a HF foram inicialmente identificados utilizando experimentos de perseguição, com timidina tritiada, que revelaram uma população de células de retenção lenta etiqueta ciclismo (LRC) que residiam na região permanente do HF logo abaixo da SG 14. Avanços na HFSCCaracterização revelou um pequeno número de marcadores que podem ser utilizados para identificar e isolar SCs específicos do nicho da IC 15. Talvez o melhor marcador para o enriquecimento de células CD34 é HFSCs, um marcador de superfície celular também identificado como um marcador SC hematopoiéticas em seres humanos 16. Dentro deste CD34 + populações duas populações distintas também foram isoladas com base na expressão da integrina α6 2. Outro marcador é queratina 15 (K15), que é altamente expresso na região da protuberância, co-localiza com a expressão de CD34 e um promotor K15 é usado para o direccionamento e isolando HFSCs em animais transgénicos 15,17-19. Na década passada várias outras populações distintas de células progenitoras HFSCs e também têm sido relatados para residir dentro do IC 17,20-27. Um recurso interessante adicional de HFSCs é a sua contribuição para a reparação da pele. Em condições normais HFSCs reabastecer o HF e não tomar parte em IFE homeostase. HoweVer, em resposta ao ferimento, estas células sair do seu nicho SC e ajuda na repovoamento a IFE 9. Nós demonstramos recentemente que os ratinhos excluído para a exibição do gene SEpt4 / ARTE pró-apoptótica um aumento do número de células CD34, K15 e Sox9 + HFSCs, que demonstram uma resistência à apoptose. HFSCs foram isolados a partir SEpt4 / ARTE - / - peles dorsal utilizando células activadas por fluorescência (FACS) e não havia mais do que um aumento de duas vezes no número de células CD34 + e + K15 HFSCs. Estes SEpt4 / ARTS - / - HFSCs foram expandidas in vitro e não só deu origem a mais colónias, mas também foram capazes de suportar as condições mais severas, em comparação com controles 28. Como resultado de ter um maior número de HFSCs, SEpt4 ARTE / - / - ratos curados significativamente mais rapidamente em resposta a lesões excisão de pele. Surpreendentemente, SEpt4 / Artes - / - ratos displayeda grande número de HF regenerado a partir do leito da ferida, cicatrizes e significativamente menores. Além disso, os ratos excluídos para XIAP (inibidor ligada ao X de apoptose), o alvo bioquímico de ARTS, demonstrou prejudicou a cicatrização 28. Os nossos resultados e trabalho realizado em outros laboratórios mostraram que HFSCs servir como um modelo ideal para o estudo da biologia e função de SCs adultos. Aqui, nós descrevemos a metodologia para o enriquecimento e isolamento de HFSCs e queratinócitos epidérmicos com base na expressão de quatro marcadores: α6 integrina; β1 integrina; Sca-1 (um marcador para queratinócitos epidérmicos) e CD34. Semelhante isolamento de K15 + HFSCs também pode ser realizada utilizando o rato K15 repórter GFP-19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Este protocolo descreve em pormenor o enriquecimento e isolamento de dois tipos de populações:. Protuberância SCs queratinócitos epidérmicos e A Figura 2 ilustra as principais etapas do protocolo. Utilizando a pele dorsal removida da parte de trás de ratinhos com 8 semanas, que enriquecido SCs protuberância usando o marcador CD34, que é expresso apenas em HFSCs; e Sca-1, que rotula queratinócitos epidérmicos. A Figura 3 mostra diferentes padrões de CD34 e Sca-1 expressão dentro do α6 + / β1 + população de células epiteliais da pele. As células foram primeiro fechado de acordo com a expressão da integrina-α6 e integrina-β1, que é designada por P1 na Figura 3. A população de células positiva para com α6 / β1expression foi, em seguida, fechado de acordo com a expressão de CD34 e as células Sca-1. Duas populações distintas de células são vistos no CD34 vs Sca-1 lote. α6 + / β1 <sup&gt; + / CD34 + / Sca-1 - representa os HFSCs (designado como P2 na Figura 3) e α6 + / + β1 / Sca-1 + / CD34 - representando queratinócitos epidérmicos (designado como P3 na Figura 3). Aproximadamente 150-500 x 10 3 células por animal do α6 + β1 + piscina são CD34 + HFSCs. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig2.jpg" /> Figura 2:. HFSC e queratinócitos da pele dorsal de isolamento foi removida dos ratinhos. A gordura foi raspada e a pele foi incubado em tripsina. HF foram desmantelada fora a partir da pele e a suspensão foi filtrada através de 70 uM e 40 uM filtros celulares. Após marcação com anticorpos células superficiais foram classificados utilizando citometria de fluxo e duas populações de células foram recolhidas com base na expressão relativa: CD34 + </sup&gt; / Sca-1 - e CD34 - / Sca-1 +. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig3.jpg" /> Figura 3: Perfis de células classificadas análise FACS de peles dorsais estimativa da percentagem de HFSCs isoladas a partir de ratinhos.. FACS-purificado α6 + β1 + células foram classificadas para CD34 + Sca-1 - (rosa, α6 + β1 + CD34 + Sca-1 -, azul, α6 + β1 + CD34 - Sca-1 +; laranja, α6 + β1 + CD34 - Sca-1 -). Os dados mostrados são de quatro ratinhos combinados e ordenados em conjunto. Em ratinhos do tipo selvagem, aproximadamente, 4-6% da α6 + β1 + piscina (P1 designado) são CD34 + / Sca-1 -. HFSCs (P2) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

isolating-hair-follicle-stem-cells-epidermal-keratinocytes-from

Nanyang Technological University

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JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K visualizações.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Vídeo: Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Biologia do Desenvolvimento

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Biologia

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurociência

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...