This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio di Ministero della Salute di Israele. Tutti gli animali sono stati trattati secondo il protocollo approvato istituzionale cura degli animali IL-02.302-2015 del Technion Israel Institute of Technology. 1. Preparazione sperimentale <ol><li> Preparazione del chelato siero fetale bovino Nota: Le cellule epiteliali sono molto sensibili al calcio quindi è fondamentale per controllare l&#39;esposizione di queste cellule al calcio. Al fine di garantire che le cellule non sono esposti al calcio durante la chelazione processo di isolamento è utilizzato per rimuovere eventuali residui di calcio dal siero fetale bovino utilizzato per la preparazione di tampone colorazione 29. Il seguente protocollo prepara circa 1 L di calcio senza siero fetale bovino richiesto per il FACS buffer di colorazione preparazione. <ol><li> Aggiungere 400 g di materiale chelante secca, es., Chelex, in un 4 L bicchiere e aggiungere acqua distillata H 2 O per un volume totale 4 L. coperchio e mescolare continuamente con un agitatore magnetico. </li><li> Regolare il pH a 7,4 con 10 N soluzione di HCl mescolando. Continuare agitazione per 20 min e ri-regolare il pH se necessario fino a pH rimane stabile per più di 20 min. </li><li> Incubare becher a 4 ° C per una notte per consentire al materiale chelante per formare un pellet compatta. Accuratamente aspirato H 2 O e aggiungere H fresca distillata 2 O ad un volume totale di 4 L. </li><li> Ripetere la regolazione del pH come al punto 1.1.2. </li><li> Porre il becher a 4 ° C per 1 ora per consentire al materiale chelante per formare un pellet compatta. Attentamente aspirato H 2 O. </li><li> Aggiungere lentamente due bottiglie da 500 ml di siero fetale bovino al materiale chelante. Mescolare lentamente a 4 ° C per 1 ora in modo che la velocità non produce bolle. </li><li> Porre il becher a 4 ° C per 1 ora per consentire al materiale chelante per formare bozzettoagire in pellet. </li><li> trasferire con attenzione il siero in bottiglia di vetro da 1 L e filtrare attraverso un filtro bottiglia top in condizioni sterili. Conservare il siero chelato a -20 ° C o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Preparazione di colorazione tampone <ol><li> Preparare 100 ml di 3% chelato FBS in PBS senza Ca 2+ e Mg 2+ e tenere in ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento dei follicoli piliferi dall&#39;epidermide adulti <ol><li> Anestetizzare topo, utilizzando 5% isoflurano utilizzando una scatola di induzione. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato con 50-80 giorni di età i topi che sono in fase telogen del ciclo HF. </li><li> Euthanize topi secondo le procedure standard di laboratorio. Qui, eutanasia topi utilizzando CO 2 overdose in una camera di eutanasia. </li><li> Radersi tutti i capelli dalla pelle dorsale usando tagliatori elettrici. Evitare di testa e gli arti. Mantenere il tagliaunghie più vicino possibile alla pelle. Evitare di danneggiare la pelle e lo strato sottocutaneo. </li&gt; <li> Quando tutti i capelli viene rimosso, utilizzare il 70% di etanolo per rimuovere eventuali residui capelli e per disinfettare la pelle dorsale. </li><li> Posizionare il mouse su un pad dissezione, e l&#39;utilizzo di una pinza tirare la pelle vicino alla coda e fare una piccola scalfittura con le forbici. Tagliare l&#39;intera pelle dorsale in direzione posteriore-anteriore con attenzione tagliando via la pelle separandola dalla fascia. Evitare di danneggiare lo strato sottocutaneo. </li><li> Posizionare la pelle su una stuoia di dissezione, lato capelli rivolto verso il basso, e definire con precisione due bordi adiacenti della pelle per fissare in posizione. Delicatamente togliere il grasso, utilizzando un bisturi smussato fino a quando il derma è chiaro e pulito. Nota: quando raschiando il grasso, utilizzare pinze curve di applicare una leggera pressione sulla pelle. Applicare una pressione sulla pelle con il lato curvo di pinze. Ciò impedirà la pelle da strappo. </li><li> Posizionare la pelle, derma lato verso il basso, in 100 mm piatto di coltura sterili, e raddrizzare la pelle per garantire che non vi siano pieghe. Aggiungere 10 ml di PBS senza Ca 2+ </sup&gt; e Mg 2+ (PBS -) al piatto cultura e raddrizzare la pelle, se necessario. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 10 ml di 0,25% tripsina. Assicurarsi che la pelle è spiegato ed è liberamente fluttuante. Incubare un pezzo di pelle per 10 ml di 0,25% tripsina. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C per 30-120 min o a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Preparazione della sospensione singola cella da follicoli piliferi <ol><li> Raschiare tutti i capelli fuori la pelle con pinze curve e un bisturi, in una anteriori alla direzione posteriore. Tenere la pelle al suo posto con il lato curvo di pinze e usare il bisturi per raschiare i capelli. Nota: Raschiare i capelli nella soluzione tripsina aggiunto al punto 2.8. Inizia la coda e seguire la direzione di crescita dei capelli. Raschiando contro la direzione della crescita dei capelli si tradurrà in una perdita sostanziale di HFS e riduzione del rendimento delle cellule. HF tendono ad aderire ciascun insieme e formare piccoli grumi; per ridurre the dimensioni dei cespi HF cercare di raschiare una piccola area alla volta. </li><li> Trasferire la pelle glabra di nuovo piatto cultura e aggiungere 10 ml di PBS - per evitare che si secchi. Ispezionare la pelle e togliere tutti i capelli rimanenti. </li><li> Abbattere le HF utilizzando un bisturi e pinze fino ad ottenere una sospensione singola HF. Vigorosamente triturare la sospensione HF utilizzando 10 ml pipetta per qualche minuto per rompere tutti i grumi di capelli. Nota: eseguire tutti i seguenti passaggi su ghiaccio. </li><li> Trasferire la sospensione HF in tubo pre-etichettati 50 ml. </li><li> Aspirare il PBS - dalla pelle e utilizzarla per lavare il piatto di coltura cellulare che conteneva la sospensione HF; trasferire al tubo 50 ml. </li><li> Lavaggio <ol><li> Filtrare la sospensione passando attraverso un filtro cella 70 micron montata su un tubo da 50 ml. Lavare il tubo 50 ml iniziale e il filtro con 10 ml di tampone colorazione (PBS - con 3% chelato FBS). </li><li> Filtrare la sospensione passandoa 40 micron colino cella montata su un tubo da 50 ml. Lavare il tubo con 5-10 ml di tampone colorazione per garantire che tutte le cellule sono state trasferite al nuovo tubo. Mantenere la sospensione in ghiaccio fino a quando tutti gli animali sono stati elaborati. </li><li> Centrifugare per 15 min a 300 xg a 4 ° C. surnatante attentamente aspirare senza disturbare il pellet e risospendere pellet in 5 ml di tampone colorazione. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 300 xg a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 800 ml di buffer di colorazione. Nota: I volumi di cui sopra è sufficiente per la colorazione cellule derivate da due topi adulti. </li></ol></li><li> Trasferimento sospensione in pre-etichettati FACS Tubes. <ol><li> Per i tubi controlli, prendere 25-50 ml di sospensione cellulare (o di qualsiasi residuo di sinistro dalla sospensione cellulare) e portare a un volume totale di 300 ml con tampone colorazione. Nota: Preparare le provette di controllo (volume totale 300 ml) per la senza macchia (senza anticorpie non DAPI); solo DAPI; Integrina β1; Integrina α6; SCA-1; CD34. </li></ol></li><li> Aggiungere gli anticorpi primari e DAPI (vedi tabella Materiali per diluizioni appropriate) alle concentrazioni desiderate al tubo appropriato. flick delicatamente i tubi per miscelare la sospensione cellulare. Rientro sul ghiaccio e coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. </li><li> Incubare per 30 min in ghiaccio e delicatamente flick tubi ogni 10 minuti per garantire cellule sono tenuti in sospensione. </li><li> Lavare le cellule compilando ogni tubo FACS con tampone colorazione (circa 4 ml per provetta); centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 800 ml di buffer di colorazione. </li><li> Trasferire sospensione di cellule nel tubo FACS con tappi colino cella per garantire la sospensione singola cella. </li></ol> 4. Flusso Analisi Citometria <ol><li> Procedere alla separazione delle cellule immediatamente utilizzando un citofluorimetro con filtri appropriati per signal rilevamento. Utilizzare 405 nm viola (per le misurazioni di DAPI), 488 nm blu (per le misure di FSC, SSC, PE, PE-Cy7 e FITC) e 633 nm laser rossi (per l&#39;eccitazione di APC) Nota: Assicurarsi che lo strumento sta registrando da rilevatori per tutti e tre i canali fluorescenti. </li><li> cancelli Situato fluorescenza sulla base di campioni non colorati e la compensazione per la sovrapposizione spettrale che utilizzano singoli controlli macchiato. Nota: utilizzare i singoli controlli colorate per regolare la compensazione tra i canali in modo da eliminare qualsiasi sovrapposizione nei segnali fluorescenti. regolazione della compensazione dipende dal sorter FACS utilizzato. </li><li> Impostare porte principali sulla base di DAPI di escludere le cellule morte. </li><li> Regolare il grafico a dispersione (SSC-A vs FSC-A) per selezionare gli eventi di singoletto. </li><li> Impostare FSC e l&#39;altezza SSC e parametri di larghezza per eliminare per doppiette e discriminare gli eventi di singoletto. </li><li> cellule cancello con elevata α6 ed espressione β1 e da questa popolazione cellule cancello con entrambi i CD34 alta espressione o alta espressione Sca1. </li><li> cellule ordinarli in tubo FACS pre-etichettati. Nota: due popolazioni generali di cellule possono essere isolate; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - e α6 + / + β1 / Sca-1 + / CD34 -. Cellule separate devono essere tenuti in ghiaccio in ogni momento fino a quando non vengono utilizzate applicazioni a valle come la cultura cellulare o l&#39;isolamento di RNA </li></ol>

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The authors have nothing to declare

Il protocollo qui descritto è ben consolidata per isolare HFSCs dalla pelle dorsale di topi adulti, ma può essere ugualmente applicata per l&#39;isolamento di altre popolazioni all&#39;interno della struttura HF, basato sulla selezione dei marcatori 2,16,23,28,29. Questo metodo è notevolmente vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento cellulare, come la dissociazione dei tessuti, dal fatto che un tipo di cellula specifico può essere selezionato e raccolto da una miscela di popolazioni cellulari eterogenee. Inoltre, il metodo descritto qui è veloce ed affidabile e può essere utilizzata per isolare fino a quattro differenti popolazioni HFSC basati sui livelli di espressione differenziale dei marcatori utilizzati. Può essere utilizzato per l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di HFSCs per ulteriori analisi molecolari, come RNA-Seq o spettrometria di massa, ma anche per la successiva coltura cellulare ed espansione in innesto vivo. La preparazione di una elevata qualità, sospensione singola cellula è un componente essenziale di una sucmoni FACS 29. Efficienza di questo protocollo dipende anche dal materiale di partenza utilizzato per l&#39;isolamento HF. Per ridurre al minimo la quantità di tessuto non-epidermica nella cura materiale di partenza deve essere presa quando la rasatura e quando sezionare pelle dorsale. Questo migliora la purezza e la resa di cellule epidermiche. Per garantire una sospensione singola cella ottimale, HF dovrebbero essere raschiata in una testa verso la coda e in piccole quantità alla volta a garantire che tutte ciuffi di capelli sono rotti in pezzi più piccoli con un bisturi e che una sospensione singola HF si ottiene . Inoltre, le cellule devono essere maneggiare con cura in ogni momento e sospensioni devono essere tenuti in ghiaccio per garantire la vitalità cellulare. Infine, tecniche sterili sono fondamentali per minimizzare il rischio di contaminazione, soprattutto se le cellule devono essere utilizzati per colture cellulari. Nel protocollo qui descritto, isolamento delle diverse popolazioni di cellule è ottenuto utilizzando quattro marcatori di superficie cellulare. UNpasso cruciale per il successo l&#39;ordinamento delle cellule è le impostazioni iniziali appropriate del FACS, la compensazione adeguata utilizzando singoli controlli macchiati e la gerarchia dei parametri di gating. l&#39;ordinamento delle cellule di successo richiede anche l&#39;eliminazione di detriti ed efficace discriminare gli eventi di singoletto da doppietti / aggregati. Canotte si distinguevano da doppiette a base di FSC e parametri width e height SSC. I parametri per l&#39;ordinamento delle cellule devono essere regolati in base al tipo sorter ma anche al coniugato fluorocromo utilizzato. Qui, PE fluorescenza sono stati raccolti utilizzando un filtro 585/42, FITC e PE-Cy7 fluorescenza sono stati raccolti utilizzando rispettivamente 530/30 e 780/60 del filtro, e APC fluorescenza sono stati raccolti utilizzando un filtro di 780/60. Cellulare ordinamento viene eseguito inizialmente con gating per le cellule vive sulla base di bassa espressione DAPI e scatter in avanti. eventi di singoletto sono stati inizialmente selezionati regolando la porta dispersione e doppiette sono stati eliminati da un gating<html> gainst canottiere avanti seguito da canottiere scatter. Due anticorpi integrine, α6 e β1 sono stati usati per selezionare le cellule epidermiche per garantire un arricchimento per tutti i SC rigonfiamento. Blanpain et al., Ha mostrato la presenza di due popolazioni di HFSCs rigonfiamento che esprimono livelli sia alti o bassi di integrina α6 ma positivo per CD34 2. Di conseguenza, le cellule che esprimono sia β1 alto / basso α6 e β1 alta / alta α6 deve essere selezionato prima di gating per CD34. Due popolazioni sono stati poi selezionati in base alla espressione di un marcatore specifico a gonfiarsi SC, CD34, e un indicatore che seleziona cheratinociti epidermici, Sca-1 23. Sca-1 co-localizza con integrina-α6 nel infundibolo e l&#39;IFE, ma non si esprime nel rigonfiamento HF. Al contrario, HFSCs rigonfiamento esprimono CD34 e integrina-α6 23, che consente l&#39;isolamento differenziale delle due popolazioni distinte; HFSCs e cheratinociti epidermici. e_content &quot;&gt; Il metodo robusto qui descritto è stato utilizzato per un certo numero di applicazioni a valle, ad esempio, isolamento di HFSCs per colture cellulari 23,28, 23,24 innesto e analisi molecolare 17. Inoltre, la selezione di una combinazione di marcatori specifici o utilizzando diversi topi giornalista permette l&#39;isolamento di sottopopolazioni all&#39;interno della struttura HF, ad esempio, Lgr6 21, Lgr5 25, Lrig1 24 e permette il confronto diretto dei cambiamenti molecolari che si verificano in queste cellule. Inoltre, tra le altre applicazioni questo metodo può essere usato per confrontare cambiamenti nel numero HFSC nel wild-type contro gli animali knockout, esaminando i cambiamenti nelle popolazioni SC sulla ferita inflizione 28 ed è quindi uno strumento prezioso in SC e la pelle di ricerca.

Le cellule staminali adulte (SCS) sono essenziali per mantenere l&#39;omeostasi tissutale, sostituendo le cellule che muoiono e riparare tessuti danneggiati su lesioni. Questi SC sono definite dalla loro capacità di subire un continuo auto-rinnovamento e di differenziarsi in varie linee cellulari 1-3. I sistemi più studiati, che dipendono SCs adulti per il rifornimento, includono il sistema ematopoietico, l&#39;intestino ed il 1,2,4 pelle. Durante l&#39;embriogenesi, la pelle inizia come un singolo strato di cellule epidermiche. Morfogenesi del follicolo pilifero (HF) inizia quando le cellule mesenchimali popolano la pelle e formano un sottostante derma collagene 5. Specializzato cellule mesenchimali, che poi costituiscono la papilla dermica (DP), organizzano direttamente sotto lo strato epidermico e stimolano l&#39;epitelio di formare placodi capelli che iniziano a crescere verso il basso 6. Altamente cellule proliferanti della matrice, situato nella parte inferiore del HF,busta queste cellule mesenchimali e formare il bulbo pilifero, mentre lo strato interno comincia a differenziarsi in cilindri concentrici per formare il fusto del capello (HS) e nelle vicinanze della guaina interna della radice (IRS) 2,3. Nella vita postnatale l&#39;epidermide della pelle è composta da tre vani: l&#39;epidermide interfollicolare (IFE), la ghiandola sebacea (SG) e l&#39;HF. In contrasto con la IFE e SG che sono in un costante stato di omeostasi, l&#39;HF è un mini-organo dinamico che subisce continui cicli di crescita (anagen), la distruzione (catagen) e di riposo (telogen) 4,7. Le cellule staminali del follicolo pilifero (HFSCs) che il carburante questo ciclo perpetuo, risiedono in una nicchia specializzata all&#39;interno della HF conosciuto come il rigonfiamento 4. Durante anagen i HFSCs uscire dal rigonfiamento, a seguito di segnali di attivazione dal DP, iniziare proliferare e scendere verso il basso creando così una lunga scia lineare di cellule conosciute come la guaina esterna radice (ORS) 8-10. Le celle di matrice, checircondare il DP alla base della HF, rapidamente ciclo e migrare verso l&#39;alto subire differenziazione terminale generando l&#39;HS e l&#39;IRS 10 (Figura 1). La durata di anagen determina la lunghezza dei capelli e dipende dalla capacità proliferativa e la differenziazione delle cellule della matrice 6. Quando l&#39;HF entra catagen, le celle di matrice transito di amplificazione nel bulbo cessano di proliferare, apoptosi e regrediscono completamente tirando la DP verso l&#39;alto fino a raggiungere la parte non bicicletta della HF 8,11. Durante questa retrazione HF forma una struttura temporanea noto come il filamento epiteliale, che è caratteristica di catagen, e contiene molte cellule apoptotiche. Nei topi, catagen dura tra 3-4 giorni ed è altamente sincronizzato nel primo ciclo del capello. Quando la HF raggiunge telogen tutti HFSCs diventano quiescenti. Le fasi distinte del ciclo HF sono inoltre caratterizzati da cambiamenti nel colore della pelle del topo causa mla produzione elanin. I cambiamenti della pelle dal nero durante anagen al grigio scuro durante catagen al rosa durante telogen 6,7,12,13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Figura 1: Il ciclo dei capelli follicolo. Il HF è composto da una parte superiore permanente e una porzione ciclismo inferiore costantemente rimodellamento che subisce continui cicli di rapida crescita (anagen), la distruzione (catagen) e una fase di quiescenza parente o di riposo (telogen). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a> SCS mantenendo la HF sono stati inizialmente identificati utilizzando esperimenti Chase, con timidina triziata, che ha rivelato una popolazione di cellule di sostegno etichette ciclismo lento (LRC) che risiedevano nella regione permanente del HF appena sotto la SG 14. I progressi nella HFSCCaratterizzazione rivelato un piccolo numero di marcatori che possono essere utilizzati per identificare e isolare SCs specifici dalla nicchia HF 15. Forse il miglior marcatore per l&#39;arricchimento di HFSCs è CD34, un marker superficie cellulare anche identificato come un marcatore SC ematopoietiche negli esseri umani 16. All&#39;interno di questo CD34 + popolazioni due distinte popolazioni sono stati anche isolati sulla base di espressione α6 integrina 2. Un altro indicatore è la cheratina 15 (K15), che è altamente espresso nella regione bulge, co-localizza con espressione CD34 e un promotore K15 viene utilizzato per il targeting e isolare HFSCs in animali transgenici 15,17-19. Negli ultimi dieci anni sono stati segnalati anche diversi altri distinte popolazioni di HFSCs e cellule progenitrici di risiedere all&#39;interno del HF 17,20-27. Una caratteristica interessante aggiuntiva di HFSCs è il loro contributo alla riparazione della pelle. In condizioni normali HFSCs ricostituire l&#39;HF e non prendono parte a IFE omeostasi. However, in risposta a ferita, queste cellule uscire la loro nicchia SC e di aiuto nel ripopolare l&#39;IFE 9. Abbiamo recentemente dimostrato che i topi cancellati per il display gene Sept4 / ARTS pro-apoptotica un aumento del numero di CD34, K15 e Sox9 + HFSCs, che dimostrano una resistenza all&#39;apoptosi. HFSCs sono stati isolati da Sept4 / ARTS - / - pelli dorsali utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e c&#39;era più di due volte maggiore del numero di cellule CD34 + e K15 + HFSCs. Questi Sept4 / arte - / - HFSCs sono state espanse in vitro e non hanno dato luogo a solo più colonie, ma sono stati anche in grado di resistere a condizioni più severe rispetto ai controlli 28. Come risultato di avere un maggior numero di HFSCs, Sept4 / arte - / - mice guarite significativamente più veloce in risposta alle lesioni asportazione della pelle. Sorprendentemente, Sept4 / arte - / - mice displayeda gran numero di HF rigenerate dal letto della ferita, e cicatrici significativamente più piccoli. Inoltre, i topi cancellati per XIAP (inibitore della X-linked di apoptosi), il target biochimico di ARTI, hanno dimostrato ridotta guarigione 28. I nostri risultati e il lavoro svolto in altri laboratori hanno dimostrato che HFSCs servire come un modello ideale per lo studio della biologia e della funzione della SCS adulti. Qui, descriviamo la metodologia per l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di HFSCs e cheratinociti epidermici in base alla espressione di quattro marcatori: α6 integrina; β1 integrine; Sca-1 (un marker per cheratinociti epidermici) e CD34. Isolamento analogo di K15 + HFSCs può essere eseguita anche con il giornalista del mouse K15-GFP 19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Questo protocollo descrive in dettaglio l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di due tipi di popolazioni:. Rigonfiamento SC e cheratinociti epidermici Figura 2 illustra le principali fasi del protocollo. Utilizzando pelle rimossa dalla dorsale posteriore di 8 settimane di età topi, abbiamo arricchito SC rigonfiamento utilizzando il marcatore CD34, che si esprime solo in HFSCs; e Sca-1, che le etichette cheratinociti epidermici. La figura 3 mostra diversi modelli di CD34 e Sca-1 all&#39;interno del α6 + / + β1 popolazione di cellule epiteliali della pelle. Le cellule sono state prima gated secondo l&#39;espressione di integrina-α6 e integrina-β1, che è designato come P1 in figura 3. La popolazione di cellule con positive per α6 / β1expression stato poi gated secondo l&#39;espressione di CD34 e cellule Sca-1. Due distinte popolazioni di cellule sono visti nel CD34 vs Sca-1 trama. α6 + / β1 <sup&gt; + / CD34 + / Sca-1 - rappresenta le HFSCs (designato come P2 in figura 3) e α6 + / β1 + / Sca-1 + / CD34 - rappresenta cheratinociti epidermici (designato come P3 in figura 3). Circa 150-500 x 10 3 cellule per animale del α6 + β1 + piscina sono CD34 + HFSCs. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig2.jpg" /> Figura 2:. HFSC e la pelle cheratinociti isolamento dorsale è stato rimosso dai topi. Il grasso è stato raschiato e la pelle è stato incubato in tripsina. HF sono stati demoliti fuori dalla pelle e la sospensione è stata filtrata attraverso 70 micron e 40 micron filtri cellulari. A seguito di etichettatura con le cellule anticorpi di superficie sono stati allineati con citometria a flusso e due popolazioni di cellule sono stati raccolti sulla base di espressione relativa: CD34 + </sup&gt; / Sca-1 - e CD34 - / Sca-1 +. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig3.jpg" /> Figura 3: Profiling di cellule ordinati analisi FACS di pelli dorsali valutare la percentuale di HFSCs isolati da topi.. FACS-purificato α6 + β1 + cellule sono state ordinati per la CD34 + Sca-1 - (rosa, α6 + β1 + CD34 + Sca-1 -, blu, α6 + β1 + CD34 - Sca-1 +, arancione, α6 + β1 + CD34 - Sca-1 -). I dati indicati sono da quattro topi combinati e ordinati insieme. Nei topi wild-type circa il 4-6% del α6 + β1 + piscina (designato P1) sono CD34 + / Sca-1 -. HFSCs (P2) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53931/53931fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

isolating-hair-follicle-stem-cells-epidermal-keratinocytes-from

Nanyang Technological University

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Cell Biology

Developmental Biology

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Views.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Video: Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Biologia

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neuroscienze

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...