The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv. Protocolo 1. Ratos <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de tampão fosfato salino (PBS) 1x solução. Calcular 35 ml por animal. </li><li> Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)). </li></ol></li><li> Perfusão do Fígado e Recolha de MH-leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 50 ml contendo um isofluranopad -soaked em torno da cabeça do rato até que a abertura de sua caixa torácica. </li><li> Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração. Evitar o sangramento através deste processo. <ol><li> Especificamente, iniciar a incisão no ponto da linha média abdominal inferior, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior. </li></ol></li><li> Dentro de aproximadamente um minuto, recolher o máximo de sangue possível (~ 6 ml de um 250 g de animais) do ventrículo direito para uma seringa. </li><li> Prender a veia cava caudal com uma pinça hemostática tão próximo quanto possível do coração, para permitir a recolha do perfundido. </li><li> Retire os intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal. </li><li> Inserir um cateter IV 25 L, ligado a uma bomba peristáltica, na veia porta, como caudal quanto possível,mas rostral à veia do baço. </li><li> Inserir uma agulha G 25 borboleta, ligado a uma seringa de 5 ml, para a veia cava inferior, caudal para a pinça hemostática. </li><li> Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e recolhem suavemente os primeiros ml de perfusato que está contaminada com sangue para a seringa. Continue até que a cor do perfusato é ficar vermelho pálido (aproximadamente 3-5 ml). Note-se que a cor do fígado está mudando no sentido castanho claro. </li><li> Sem parar a bomba peristáltica, substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolha de pelo menos 20 ml de perfusato fígado empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorar continuamente o fluxo de perfusato para a seringa de coleta, e evitar vácuo que é muito forte (que podem entupir a agulha através colapso das paredes da veia cava). </li><li> Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol&gt; <li> Centrifuga-se o perfusato durante 10 minutos a 400 xg, 24 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante </li><li> Adicionar 10 ml de PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e o sobrenadante aspirado. Com base em metas de estudo, utilize preparação como está, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade). <ol><li> Especificamente, a camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora. </li><li> Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Rato Protocolo <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de fosfato salino (PBS) tamponada 1x solution. Calcular 20 ml por animal. </li><li> Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)). </li></ol></li><li> Perfusão do Fígado e Recolha de MH-Leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 15 ml contendo uma almofada encharcada de isoflurano em torno da cabeça do rato até a abertura de sua caixa torácica. </li><li> Corrigir os membros do mouse para uma cama. </li><li> Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração, mantendo o aspecto inferior do diafragma intacto (para criar uma cavidade torácica piscina drenagem). Evitar o sangramento através deste processo. <ol><li> Especificamente, iniciar a incisão na parte inferiorponto abdominal na linha média, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior. </li></ol></li><li> Arrancamento dos intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal. </li><li> Inserir uma agulha 30 g, ligada a uma bomba peristáltica para a veia porta rostral à veia esplénica. </li><li> Cortar a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e recolha do perfundido da cavidade torácica. </li><li> Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e suavemente recolher os primeiros 3 ml de perfusato que está contaminada com sangue a partir da piscina cavidade torácica. </li><li> Descarte este perfusato. Repita essa lavar novamente, se necessário, usando solução salina, e só então começar a recolher perfusato fígado. </li><li> Re-iniciar a perfusão a uma velocidade de até 4 ml / min, e recolher 10 ml de perfusato da cavidade torácica usandouma borboleta ligado a uma seringa. </li><li> Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol><li> Centrifugar o perfusado durante 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10 ml PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e aspirar o sobrenadante com base em metas de estudo, utilize preparação como é, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade). <ol><li> Especificamente, a cada camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora. </li><li> Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats:+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells.">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li><li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics.">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li><li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pit+cell:+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood.">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li><li>Vermijlen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+natural+killer+cells+exclusively+kill+splenic/blood+natural+killer-resistant+tumor+cells+by+the+perforin/granzyme+pathway.">Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway.</a> J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).</li><li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells:+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases.">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li><li>Kaneda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-associated+large+granular+lymphocytes:+morphological+and+functional+aspects.">Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects.</a> Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).</li><li>Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+of+perforin+in+cytolysis?.">A central role of perforin in cytolysis?.</a> Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).</li><li>Kamada, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carboxypeptidase+and+tryptic+esterase+activities+that+are+complexed+to+proteoglycans+in+the+secretory+granules+of+human+cloned+natural+killer+cells.">Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells.</a> J Immunol. 142, 609-615 (1989).</li><li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+function+of+pit+cells,+the+liver-specific+natural+killer+cells.">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li><li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+granular+lymphocytes+or+&amp;#34;pit+cells&amp;#34;+from+rat+liver:+isolation,+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity.">Large granular lymphocytes or &amp;#34;pit cells&amp;#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li><li>Vanderkerken, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+differentiation+of+hepatic+natural+killer+cells+(pit+cells).">Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells).</a> Hepatology. 18, 919-925 (1993).</li><li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+adhesion+molecules+in+the+recruitment+of+hepatic+natural+killer+cells+(pit+cells)+in+rat+liver.">The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver.</a> Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).</li><li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells.">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li><li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+(pit+cell)-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells.">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li><li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow.">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li><li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential.">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li><li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver.">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li><li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis.">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li><li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+phenotyping,+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver.">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li><li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+(pit+cells)+in+rat+liver+sinusoids.">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li><li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O método de perfusão do fígado aqui apresentada permite uma colheita selectiva e estudo da população única de marginating leucócitos hepáticas. Células hepáticas NK, também chamados de células pit 3, constituem uma população distinta de células NK que residem nos sinusóides hepáticos. Eles são encontrados em ratos, ratos 17 e em humanos 18,19. Em comparação com células NK periféricas isoladas, células pit demonstraram maior citotoxicidade contra YAC-1 e CC531s linhas celulares alvo 20, mostraram ter um maior número de pequenos grânulos citoplasmáticos 20, e uma maior expressão de antigénios de superfície, tais como LFA-1 12 . Além disso, ao contrário das células NK isoladas de sangue, as células pit podem lisar células P815-resistentes a NK. Semelhantes a células pit de rato, células NK hepáticos humanos têm uma maior citotoxicidade contra células alvo K562 NK-sensíveis em comparação com células NK 18,19 circulante, e foram exibidas para lisar células alvo resistentes a NK 18. Overall, como o fígado é especificamente e exclusivamente envolvido em várias doenças, a imunidade deve ser estudada dentro deste órgão, e as células do compartimento de MH deve ser distinguido do parênquima, de Kupffer e células estreladas. Como elaborada na introdução, a nossa abordagem de perfusão é vantajoso sobre os procedimentos de degradação comuns mecânicos trituração / biológicos na colheita seletiva leucócitos MH, e em melhor preservar a integridade, a atividade, e do meio fisiológico de leucócitos MH. Na verdade, avaliando NK citotoxicidade, leucócitos MH colhidas através de nossa abordagem exibiu uma acentuadamente maior citotoxicidade NK de leucócitos colhidos através do processo de trituração mecânica, apesar número semelhante de células NK. A técnica de perfusão hepática só funciona em estudos com animais. diferenças no entanto, percepções específicos obtidos a partir desta abordagem com relação marcadas entre os compartimentos imunes podem questionar a biológicaal e significado clínico de observações baseadas unicamente em leucócitos circulantes. Os estudos em animais que medem índices imunológicos em diferentes compartimentos do sistema imunológico pode sugerir o grau em que cada um dos índices imunológicos na prática não corresponde ou se correlaciona com os seus níveis no compartimento de MH. Uma observação interessante refere-se ao emprego desta técnica em ratinhos, em que as células NK-MH perfundidos apenas apresenta actividade citotóxica significativa contra células alvo na sequência de uma a priori a estimulação imunológica do animal 21. devem ser indicados alguns aspectos críticos da técnica. Em ambos os ratos e camundongos, a cavidade torácica deve ser aberto amplamente imediatamente após a cessação completa da respiração e, com sangramento mínimo. Em ratos, recomenda-se que a quantidade máxima de sangue cardíaco é retirada antes da perfusão. Em ratos, não é recomendado para o sangue retirado do coração, uma vez que reduz a pressão sanguínea na veia porta etorna mais difícil de inserir a agulha através dele para continuar o processo. Esta inserção da agulha deve ser feita adjacente mas rostral à veia esplénica, como se deseja assegurar que a distância a partir da inserção para a entrada da veia porta para o fígado é suficiente para que a agulha seja numa posição estável e permite que todo o lóbulos para se perfusão. A agulha deve ser inserida na veia portal, paralela à sua superfície, de modo que o risco de ruptura da parede do recipiente é minimizada. Em ratos, enquanto que a inserção de uma agulha para a veia cava caudal para a recolha do perfusado, é crucial manter o ponto de entrada tão estreita quanto possível para evitar uma potencial fuga de perfusado. Em ratinhos, é importante precocemente cortar a veia cava interior da cavidade torácica sem ruptura outros vasos sanguíneos ou os pulmões, a fim de evitar a contaminação do sangue desnecessária. A principal vantagem da utilização de uma bomba peristáltica é um controlo estável durante a taxa de perfusão, dentro e entreanimais. É importante manter um caudal baixo durante todo o procedimento, a fim de evitar a ruptura da veia porta. Como os primeiros ml de perfusato fígado estão contaminados com sangue, devem ser descartadas, conforme mostrado. Para alcançar a normalização entre os animais, o critério para começar a recolher o perfusato MH é baseada na transição de cor do marrom escuro ao castanho claro (em vez de coleção de um volume específico). Junto a realização do processo, pode ocorrer vários problemas de funcionamento, mas a maioria são reversíveis. Se a agulha através do qual o PBS é transfundido no fígado desliza para fora, recomenda-se para parar a bomba peristáltica, mergulhe a área circundante do intestino (para conseguir uma melhor visibilidade), re-inserir a agulha em uma posição ligeiramente mais rostral, e re-ligar a bomba. A técnica de perfusão do fígado aqui descrito permite uma colheita selectiva da população de leucócitos MH em um processo bastante simples. Dadoque esta população apresenta características distintivas em comparação com leucócitos de outros compartimentos do sistema imunológico, e pode ter importância biológica e clínica para o organismo, recomendamos o uso deste método quando viável, como leucócitos de outros compartimentos podem não refletir o perfil da população MH. Além disso, como esta técnica não é realizável em seres humanos, sugere-se adicionalmente que emprega-lo em animais para esclarecer biomarcadores específicos circulantes que se correlacionam com as características MH, em particular quando o estudo de processos e doenças relacionadas com a hepáticas.

Os sinusóides do fígado contêm numerosos subtipos de leucócitos de várias actividades imunes críticos para o organismo. Por exemplo, marginating hepática células natural killer (MH) (NK), também conhecidas como células pit, são caracterizados morfologicamente como grandes linfócitos granulares (LGLs) e funcionalmente como leucócitos com capacidade citotóxica espontânea, permitindo hepática resistência contra o estabelecimento de análises ao sangue metástases tumorais Borne. O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de leucócitos MH, a fim de estudar esta população de células importante e original (e compartimento imune), e para elucidar o impacto de várias manipulações (por exemplo, activação imune) sobre essas células específicas. Apesar do fracasso da imunidade para eliminar o desenvolvimento de um tumor primário, provas em pacientes com cancro e em modelos animais indicam que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula atraimunidade mediada por células GH (CMI). No entanto, existe uma aparente inconsistência entre estes em capacidades in vivo e in vitro em seres humanos e em animais, que demonstram que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade pela circulação de leucócitos ou esplénicas 1,2. Esta inconsistência pode ser atribuída, pelo menos em parte, à existência in vivo de uma subpopulação de leucócitos distintas, a saber, os sinusóides (leucócitos) marginating-hepático e a sua sub-população de células NK activadas, nomeadamente células pit 3. Com efeito, dados não publicados do nosso laboratório indicaram que em ratos F344 células tumorais singénicas (MADB106), as quais foram consideradas resistentes à circulação e esplénicos leucócitos, foram submetidas a lise por células NK MH-4. Assim, as células tumorais que são &quot;resistente NK-&quot; alegadamente para leucócitos circulantes podem ser controlados por células NK-MH. Notável, em ratos o aumento da atividade de MH-NK é evidente apenas seguir in vivo imunológicoestimulação (por exemplo, através da utilização de poli I: C ou CpG-C) 5. células NK específico do fígado (MH-NK) estão situados dentro do lúmen sinusoidais, aderir às células endoteliais e células de Kupffer. Células MH-NK são caracterizados exclusivamente por grânulos densos esféricas e vesículas com núcleo de haste 6, que contêm fosfatase ácida como enzimas lisossomais e perforina e granzimas como substâncias bioativas 7,8. Em comparação com células NK circulantes, células-NK MH exibem um maior número e tamanho dos grânulos e vesículas 9-11. Sob condições inflamatórias, células-NK foram MH mostrado exibir maior expressão de LFA-1 12, em comparação com células NK circulantes. Esta expressão aumentada pode constituir um mecanismo pelo qual as células NK-MH é mais citotóxico contra certas células tumorais do que as células NK circulantes 13,14. nterestingly, após incubação in vitro com a interleucina (IL) -2, células-NK MH tornou alargada, eo seu número e tamanho de grânulos de aumentar, os quais são consistentes com uma pro fi le de assassinas activadas por linfocina (LAK) células 15. leucócitos MH activas não podem ser obtidos exclusivamente através dos métodos de colheita de leucócitos no fígado padrão, os quais são baseados na moedura e degradação biológica do tecido. A nossa abordagem perfusão aqui descrito possui duas grandes vantagens em comparação com os métodos normais. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente leucócitos MH, evitando a contaminação por outros leucócitos de outros compartimentos do fígado. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade, a actividade, e o meio fisiológico de leucócitos MH, ao contrário do processamento de tecidos abordagens que danificam as células ou alteram a sua morfologia, e devido ao dano do tecido, induzir a libertação de vários factores que marcadamente modular imune atividade. O fígado é um dos principais alvos de metástase de câncer dend para várias infecções 16. Como as células MH apresentam características únicas que é importante estudar essa população específica sob várias condições no que diz respeito a estas patologias. Por exemplo, é digno de nota que a activação imunitária sistémica por vários BRMs (por exemplo, poli I: C ou CpG-C) têm mostrado activar MH-leucócitos mais do que 5 leucócitos circulantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autoclud Peristaltic pump</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Butterfly needle</td>
			<td style="width:103px;">OMG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Butterfly needle</td>
			<td style="width:103px;">OMG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>21G*3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Pic solution</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Pic solution</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Pic solution</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Pic solution</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Pic solution</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>25 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blunted-edged forceps</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">hemostat</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue forceps</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Em ratos F344 comparou-se a citotoxicidade de células NK-MH (recolhida das sinusóides do fígado por perfusão do fígado forçada) para citotoxicidade de toda a população de células de fígado após trituração mecânica do tecido do fígado, e para a citotoxicidade de leucócitos circulantes. Todas as preparações celulares foram lavadas, pelo menos, 3 vezes, como rotina em ensaios imunológicos, e como linhas de células alvo foi utilizado o alogénico de YAC-1 ou as linhas de células alvo singeneicas MADB106. Tal como indicado nas Figuras 1 - 4, enquanto que as células de MH-NK exibiu profunda citotoxicidade contra a MADB106 e as linhas de células YAC-1 alvo (~ 80% até 100%, respectivamente), quer a população de células de fígado inteira (Figura 1) e leucócitos circulantes (Figuras 2 e 3) apresentaram níveis inferiores de citotoxicidade profundamente, e quase não matar contra a linha celular alvo MADB106 singeneicos. O mesmo relative níveis mais baixos de citotoxicidade foram evidentes quando os fígados tratados mecanicamente também foram submetidos a lavagem e separação por gradiente de densidade (Figura 4), ​​os níveis que são típicas na literatura. Assim, as células NK-MH exibem unicamente níveis elevados de citotoxicidade em ratos F344. A análise FACS foi realizada e revelou diferenças profundas na composição dos seguintes sub-populações de células: monócitos (CD161dim), células NK (CD161 brilhantes), células T (CD3), células B (CD45), e as células NKT (CD161) e CD3. As principais diferenças no perfil de maturação (CD11b / CD27) também foram evidentes entre os diferentes compartimentos (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig1.jpg" /> Figura 1: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade da toda a população celular do fígado (YAC-1 linha celular alvo) MH células-NK (colhidas a partir do compartimento MH-atra.gh a abordagem descrita aqui) exibiu actividade citotóxica contra profundo da linha de células-alvo YAC-1, ao passo que a totalidade da população de células do fígado, colhidas por meio de tratamento mecânico do fígado, apresentado níveis mínimos (p &lt;0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53918/53918fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig2.jpg" /> Figura 2: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade de leucócitos circulantes (YAC-1 da linha celular-alvo). As células NK (MH-colhidas de MH-o compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a linha celular-alvo YAC-1, ao passo que leucócitos circulantes apresentado níveis mínimos de citotoxicidade(P &lt;0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53918/53918fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig3.jpg" /> Figura 3:. Uma comparação da citotoxicidade de células MH-NK, a citotoxicidade de leucócitos circulantes (linha celular MADB106 alvo) células MH-NK (colhida do HM-compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a MADB106 singeneicos linha celular alvo, ao passo que leucócitos circulantes apresentado níveis mínimos de citotoxicidade (p &lt;0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53918/53918fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui t</a>o visualizar uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig4.jpg" /> Figura 4: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade do fígado Linfócitos inteiro que foi lavado e enriquecida através da separação em gradiente de densidade (YAC-1 A linha de células alvo) MH células-NK (colhido do MH-. compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a linha celular-alvo YAC-1, ao passo que os linfócitos de fígado inteiras (seguintes processamento mecânico, o qual foi lavado e enriquecido através de separação em gradiente de densidade), exibiram níveis significativamente mais baixos de citotoxicidade (até 30%) (P &lt;0,05) que são típicas na literatura. eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53918/53918fig4large.jpg" target="_blank">Por favor</a>clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53918/53918fig5.jpg" /> Figura 5:. Uma comparação de subpopulações de células mononucleares e subconjuntos de células NK Do mononucleares circulantes, o MH-mononucleares, e toda a células do fígado mononucleares FACS análise mostra diferenças claras na composição das seguintes subpopulações de células: monócitos (CD161dim), células NK (CD161 brilhante), as células T (CD3), células B (CD45), e as células NKT (CD161 e CD3), bem como diferenças no perfil de maturação (CD11b / CD27) entre diferentes compartimentos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53918/53918fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes at JoVE.com

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.6K visualizações.  Tel-Aviv University. Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Vídeo: Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...