Os autores gostariam de agradecer a Javier E. Garcia e Lene Grønkjær de assistência técnica e Merete K. Raarup para discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado pelo Aarhus University Research Foundation eo Simon Spies Foundation.

O protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Aarhus County (M-20100032). 1. confocal microscópica Calibração do Ratiometric Dye <ol><li> Para aquisição de imagem, use um microscópio invertido confocal equipado com uma incubadora, uma objectiva de imersão em água abertura 63X / 1.2-numérico, uma linha de laser 543 nm e um detector de META. </li><li> Preparar tampão HEPES soluções de reserva (50 mM, ajustado a pH 4,5-8,5 em passos de 0,1 unidades de pH). Pipetar 100 l de cada solução nas cavidades de uma placa de 96 poços de fundo claro, por microscopia de fluorescência. </li><li> Usar luvas de borracha nitrílica ao manusear o corante ratiometric C-SNARF-4. Prepara-se uma solução de estoque 1 mM do corante em sulfóxido de dimetilo. Adicionar 5 uL da solução stock a cada poço com tampão HEPES. Colocar a placa de 96 poços sobre o microscópio. </li><li> Ligue o microscópio. Abra o software microscópio. Clique nos seguintes painéis: Adquirir → Laser; Adquirir → MICRO; Adquirir → Config; Adquirir → Digitalização; Adquirir → Stage. Aquece-se a incubadora a 37 ° C. </li><li> Ligue a linha de laser 543 nm, clicando sobre o laser 543 nm e o botão &quot;On&quot; na janela &quot;Controle Laser&quot;. Escolha a objetiva de imersão 63X / 1.2-numérico água abertura na janela &quot;Controle Microscópio&quot;. </li><li> Defina o detector META para monitorar simultaneamente a fluorescência dentro de 576- a 608 nm (verde) e 629- a 661 nm intervalos (vermelho) ( &quot;Controle de Configuração&quot; → &quot;ChS&quot;). Ajustar a potência do laser ( &quot;Controle de Configuração&quot; → &quot;Excitação&quot;). Defina o pinhole para produzir uma espessura de corte óptico de 1,6 mm ( &quot;Control Scan&quot; → &quot;Pinhole&quot;). </li><li> Adquirir uma imagem de cada solução tampão de HEPES, 5 mm acima do fundo de vidro da placa de 96 poços. Nota: Assim que o plano de focagem está situado por baixo do fundo de vidro, sem luz fluorescente pode ser vistona tela. Depois de cada terceira imagem, defina a potência do laser para zero e ter uma imagem para a subtração de fundo. </li><li> Realizar o experimento de calibração em triplicado (1,2-1,7). </li><li> Determinar a intensidade de fluorescência média e desvio padrão, em todas as imagens vermelhas e verdes. <ol><li> Calcula-se a relação R e erro padrão da média, S R, para cada imagem de acordo com as equações (1) e (2) (1) <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s g e s r são as médias e desvios-padrão nas respectivas imagens verde e vermelho. b g, b r, s bg e s l são os valores correspondentes para as imagens de fundo. n <em&gt; 2 é o número de pixels fotografada. </li><li> Traçar as razões calculadas para cada valor de pH a partir de três experiências de calibração replicar num diagrama e construir uma curva ajustada a partir desta série de pontos de dados (ou seja, utilizando o software SigmaPlot 13). Fazer uma função matemática da curva ajustada, que pode converter proporções em valores de pH 10. </li></ol></li></ol> 2. Recolha de In Situ Grown amostras Dental biofilme <ol><li> Selecione voluntários que preenchem os critérios de inclusão e exclusão relevantes para o estudo. Faça impressões de alginato de sua arcada dentária superior e inferior. Faça modelos de gesso de estas impressões e fabricar um splint de acrílico no maxilar inferior. Projetar a tala com flanges de acrílico bucais ligados por um fio ortodôntico lingual que permite que o voluntário a morder oclusão normal 12. </li><li> Recessões broca nos flanges vestibular do splint de acrílico (Figura 1 </strong&gt;) Com a ajuda de fresas acrílico dental para permitir a inserção de placas de vidro para recolha do biofilme. A profundidade das recessões deve ser de pelo menos 1,5 mm, enquanto a largura e o comprimento das recessões podem variar, dependendo do número de placas de vidro a serem inseridos. </li><li> Para a recolha de biofilme, utilizar placas feitos por medida não fluorescentes de vidro (4 x 4 x 1 mm3), com uma rugosidade da superfície de granalha de 1200, a fim de imitar o padrão de colonização em esmalte natural, 11. </li><li> Esterilizar os pavimentos de vidro por autoclavagem antes da montagem. Montar as placas de vidro com cera pegajoso nas depressões nos flanges bucais de cada lado ligeiramente recuadas para a superfície da superfície de acrílico de modo a proteger o biofilme de forças de cisalhamento exercidas pelo movimento dos mordentes 11. Nota: O número de placas de vidro colocadas numa recessão pode variar entre 3 e 14, dependendo do objectivo do estudo. </li><li> Insira o aparelho na boca do voluntário. Instrua o Volunteer para reter o dispositivo intra-oralmente durante todo o período experimental. Instruir o voluntário para guardar o aparelho em um recipiente retentor ortodôntico com um pedaço de lenço de papel molhado (para mantê-lo húmido) à temperatura ambiente durante a escovação dos dentes e da ingestão de alimentos e outros do que a água bebidas. Instrua o voluntário para não tocar nos flanges acrílico bucais com as placas de vidro enquanto colocar e retirar o aparelho. Nota: O período experimental podem variar dependendo do objectivo do estudo (um dia a várias semanas). </li><li> Cuidadosamente remover as placas de vidro a partir do aparelho no final do período experimental. Remover a cera pegajoso em torno das placas, com uma faca e transferi-los com um par de pinças para um recipiente fechado, o biofilme voltada para cima, até que a análise microscópica. Mantenha o recipiente úmido com lenço de papel molhado. Realizar imagem pH dentro de poucas horas após a coleta do biofilme. </li></ol> 3. biofilme pH de imagem <ol><li> Prepararsalivar solução por adição de ditiotreitol à saliva recolhida de acordo com o método de De Jong et ai. 13. Titula-se a solução para pH 7,0 salivar e adicionar glucose a uma concentração de 0,4% (peso / vol). Pipetar 100 ul por biofilmes ser analisadas numa placa de 96 poços com fundo de vidro para microscopia. Adicionam-se 5 ul de corante raciométrica por poço. </li><li> Colocar a placa de 96 poços na platina do microscópio. Ligue o microscópio e a linha de laser 543 nm. Aquece-se a incubadora a 37 ° C. Use as mesmas configurações microscópio como para a calibração do corante (veja as etapas 1,5-1,6). Esperar durante 30 min, até que a placa de 96 poços atingiu a temperatura de trabalho. </li><li> Pegar uma ou mais placas de vidro com um conjunto magro de pinças e colocá-los nos poços cheios de saliva, uma laje por poço, com os biofilmes viradas para baixo. </li><li> Adquirir imagens individuais ( &quot;Control Scan&quot; → &quot;single&quot;) ou Z-stacks ( &quot;Control Scan&quot; → &quot;Start&quot;) spanning a profundidade dos biofilmes em diferentes áreas. Para adquirir z-stacks escolher o número de fatias a ser trabalhada ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Definições Z&quot; → &quot;Num fatias&quot;) e marque o z-position para a primeira e a última fatia no software microscópio ( &quot;Controle de Digitalização &quot;→&quot; Configurações Z &quot;→&quot; Mark First &quot;;&quot; Mark Last &quot;). Nota: Z-pilhas com uma profundidade de até 75 fim pode ser adquirido com um bom contraste entre as áreas extracelulares e intracelulares. </li><li> Para acompanhar as mudanças de pH em um campo de vista microscópico ao longo do tempo, marcar o xy-posição no microscópio software ( &quot;Stage e Controle Focus&quot; → &quot;Mark Pos&quot;) e tomar imagens repetidas em momentos consecutivos ( &quot;Control Scan&quot; → &quot; Solteiro&quot;). tomar regularmente imagens com a potência do laser fixada em zero por subtração de fundo. </li></ol> 4. Análise de Imagem Digital <ol><li> para export as imagens microscópicas como arquivos TIF, use o lote exportação do arquivo do software microscópio ( &quot;Macro&quot; → &quot;Batch File Export&quot;). Marque os arquivos a serem exportados e salvar imagens dos canais vermelho e verde em pastas separadas como TIF-arquivos ( &quot;Start Batch Export&quot;). Renomear os arquivos em ambas as pastas, dando-lhes números sequenciais. </li><li> Importar a série de imagens vermelho e verde em um software como o daime (análise de imagem digital em ecologia microbiana) 14. Segmento as imagens dos canais verdes com limiares escolhidos individualmente brilho (segmento → segmentação → limiar automático personalizado). Escolha os limiares de brilho com cuidado (tipicamente entre 20 e 80), de modo a que todas as bactérias (mais brilhante do que a matriz extracelular), mas não a matriz será reconhecido como objectos durante segmentação. Verificar visualmente se as regiões reconhecidas como objectos correspondem bem ao biomassa bacteriana. </li><li> Transferir a camada de objeto do g segmentadaimagens reen canal para o canal vermelho imagens correspondentes (segmento → camada objecto de transferência). Use a função de editor de objetos para rejeitar e excluir todos os objetos nas imagens dos canais vermelho e verde. Agora, apenas a matriz extracelular é deixado nas imagens de biofilme. Exportar a série de imagens processadas como arquivos TIF. </li><li> Importar a série de imagem em ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinar a intensidade média de fluorescência nas imagens de fundo tomadas com o laser desligado (Analisar → Histograma). Subtrair o fundo adequado a partir das imagens vermelhas e verdes (Processo → Math → Subtrair). </li><li> Ainda em ImageJ, divida a série de imagens verde (G1) por si só (Processo → calculadora de Imagem). Em seguida, multiplique a série imagem resultante (G2) com a série de imagens verde (G1). Isto irá produzir uma série de imagens (G3), onde NaN é atribuído a todos os pixels pertencentes a áreas que foram reconhecidos como objetos em daime. Proceda tele mesmo modo com a série de imagens vermelho (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). Observação: Como a biomassa bacteriana foi removido a partir das imagens no passo 4.3, a intensidade fluorescente é 0 nestas áreas. Etapa 4.5 é necessário para converter o valor de 0 a NaN, o que permite o cálculo proporção no passo 4.6. </li><li> Aplique o filtro &#39;média&#39; (Processo → Filtros → Média; raio: 1 pixel) para compensar o ruído detector. Divida a série de imagens verde pela série imagem vermelha (Processo → calculadora de Imagem). Isto resulta numa proporção verde / vermelho para todos os pixels restantes no espaço extracelular das imagens. Use falsa coloração para representação gráfica das proporções nas imagens (Tabelas Imagem → Lookup). Calcular a relação média para cada imagem (Analisar → Histograma). </li><li> Converter os rácios de verde / vermelho para valores de pH de acordo com a função instalado sob 1.9.2). Nota: Um exemplo para dados de calibração e curva ajustada pode ser visto na Schlafer etal, 2015 11. </li></ol>

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H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. 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Os autores não têm nada a revelar.

Monitorização microscópica de pH biofilme proporciona várias vantagens, como comparado com eléctrodos ou microeléctrodos 4-6 medições. técnicas microscópicas permitir determinar pH com uma alta resolução espacial e permitir a captura gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes sem perturbar o biofilme mecanicamente. As tentativas anteriores de monitoramento do pH microscópico, no entanto, não conseguiram diferenciar entre pH extracelular e intracelular no biofilme 1,7,9. Devido a homeostase bacteriana, pH intracelular difere do pH extracelular, e os cálculos de pH não pode ser válido se os dois compartimentos intra- e extracelulares contribuir para a emissão fluorescente gravada. O uso de um segundo corante fluorescente, juntamente com o corante sensível ao pH para visualizar as células bacterianas é problemática, uma vez que mesmo uma pequena sobreposição entre o espectro de emissão dos corantes pode comprometer a quantificação da luz fluorescente. Por conseguinte, a técnica aqui apresentadabaseia-se em um gradiente de concentração do corante raciométrica entre compartimentos extra e intracelulares do biofilme para identificar e depois remover as células bacterianas a partir das imagens adquiridas de pH. Após a coloração com o corante fluorescente, as células bacterianas em biofilmes e internalizar-se-concentrar a molécula, mas apenas em condições ácidas. ratiometry pH com o corante é, portanto, limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0. A valores de pH acima de 7, o corante não protonada e, assim, carregada não penetram as células bacterianas bem o suficiente para os distinguir do fundo extracelular, e a valores de pH abaixo de 4,5 a maioria das moléculas de corante são protonados e não há mais alterações na emissão de fluorescência pode ser observado. A curva ajustada (pH vs. verde Rácio / vermelho) é mais íngreme em torno de pH 6 e nivela para fora para pH 4,5. Um exemplo é mostrado na Schlafer et al., 2015, Figura S2. 11 Actualmente, o uso do corante fluorescente para ratiometry pH é limitado amonitoramento de pH extracelular 1. Em princípio, o corante pode também ser utilizado para monitorizar variações de pH intracelulares bacterianas, mas, até agora, a calibragem não foi executada para utilização intracelular. Além disso, seria difícil distinguir com exactidão entre a emissão fluorescente intracelular e derivando luz fluorescente de moléculas de corante fixados no exterior da parede celular bacteriana. Além disso, como a coloração com o corante raciométrica é utilizado em combinação com a microscopia confocal, a aquisição de imagem em camadas de biofilme mais profundo do que 75 | iM a partir da interface da tampa de vidro / biofilme é comprometida. Diminuir o contraste entre as células bacterianas e da matriz extracelular torna a diferenciação entre intra e extracelulares áreas difícil. O corante raciométrica empregue foi mostrado para visualizar de forma fiável 15 espécies bacterianas associadas com biofilme, e que cora todas as células bacterianas nos biofilmes dentais cultivadas in situ 11. Embora seja provável que araciométrica corante é um corante universal de bactérias, isso ainda não foi provado e a mancha deve ser testado em biofilmes de outros habitats do que a cavidade oral. O método não permite produzir réplicas técnicas de um determinado medição de pH, como aquisição de imagem leva alguns segundos e biofilme pH muda dinamicamente. imagiologia repetido de soluções tampão livre de biofilme, no entanto, e de imagem repetida de biofilmes em tampão originou valores de pH estáveis ​​(dados não apresentados). Todos os passos do procedimento descrito acima para o processamento de imagens deve ser seguido exacta. imagens de biofilme deve ser adquirido com o laser suficiente poder / ganho para obter níveis adequados de sinal fluorescente na matriz extracelular, mas a exposição excessiva de células bacterianas devem ser evitados. Se as células bacterianas são sobrexposta (potência do laser de muito alta ou ganho) áreas maiores do que efectivamente coberta por bactérias são reconhecidos como objectos durante a segmentação da imagem e a parte do espaço extracelular é perdidapara o cálculo do pH (ver Figura 3B). Por outro lado, se as imagens são adquiridas com muito laser de baixa potência / ganho, intensidade de fluorescência no espaço extracelular pode não ser suficiente para o cálculo confiável de taxas de emissão verde / vermelho. Uma ferramenta Indicador Faixa no software do microscópio pode ser utilizado para ajustar as configurações de microscópio, de modo que as células bacterianas são capturados com intensidade máxima, mas sem exposição excessiva. segmentação de imagem automatizada deve ser controlada para todas as imagens de biofilme para assegurar que todas as infecções bacterianas e, se estiver presente, as células eucarióticas são reconhecidos como objectos pelo software. Após a segmentação, todas as imagens de biofilme deve ser comparadas uma por uma com as respectivas imagens não segmentados para verificar a congruência entre a biomassa bacteriana e a área reconhecida como objectos. Se áreas maiores do que as abrangidas por bactérias são reconhecidos como objetos do limiar de brilho é muito baixo para uma diferenciação precisa e segmentação deve ser realizado com um oilimiar de luminosidade gher. Se uma parte da biomassa bacteriana não está entre os objectos, o limiar de brilho deve ser reduzido para se obter uma diferenciação correcta entre o espaço extracelular e intracelular. Para a análise de grandes conjuntos de dados tem-se revelado vantajoso segmento de todas as imagens, com uma fileira de diferentes limiares de brilho e posteriormente para determinar o limiar ideal para cada imagem. Uma vez que uma distinção correcta entre as bactérias e a matriz extracelular é conseguido, não há mais problemas são de esperar durante o processamento de imagem. Pode, no entanto, haver algumas imagens com um biofilme muito densa, onde as bactérias cobrir todo o campo de vista microscópico. Nestas imagens, obviamente, o pH extracelular pode não ser determinada. Em alguns casos, o problema pode ser resolvido através da aquisição de imagens num plano z ligeiramente diferente, em que a biomassa bacteriana não cobre a totalidade do campo de visão. Outras aplicações de ratiometry pH extracelular pode ser estudarpaisagens de pH em outras comunidades microbianas do que biofilmes dental (ie. biofilmes Pseudomonas aeruginosa ou biofilme bacteriano atuais produtoras). O efeito de diferentes parâmetros ambientais, tais como a concentração de oxigénio, o fornecimento de hidratos de carbono ou aplicação de corrente eléctrica no pH do biofilme pode ser determinada. A influência da idade do biofilme, a espessura do biofilme e a actividade metabólica sobre o pH pode ser investigada, bem como o efeito de agentes de pH modulador sobre o biofilme bacteriano. Este último é particularmente relevante no contexto de biofilmes dental, onde os agentes tamponantes representam uma abordagem terapêutica promissora para controlar cárie dentária 15. Além disso, pesquisas futuras devem se concentrar em aplicar o método apresentado em condições de escoamento. Até à data pH extracelular ratiometry só foi utilizado para monitorizar o pH, em condições estáticas. fornecimento constante de meio oxigenado fresco é susceptível de ter um impacto considerável no desenvolvimento de microambientes pH e, emparticulares, gradientes de pH verticais dentro biofilmes finas. A depuração de ácidos pelo fluxo médio pode contribuir para o estabelecimento de gradientes verticais mesmo em biofilmes muito finas. imagem microscópica confocal raciométrica com o corante raciométrica C-SNARF-4 em combinação com pós-processamento preciso das imagens adquiridas autorizações digitais para calcular e visualizar pH biofilme na matriz extracelular, em tempo real, na gama de pH entre 4,5 e 7,0 e até uma espessura de 75 um biofilme.

O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm 1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas. PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente 2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial 3. Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos 4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados 1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato 10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição 11. Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

O pH em biofilmes bacterianas nos dentes é de importância central para a cárie dentária, uma doença com alta prevalência em todo o mundo. Nutrientes e metabólitos não são distribuídas uniformemente em biofilmes dentais. Uma interacção complexa de sorção de reacção e com a matéria orgânica no biofilme reduz os caminhos de difusão de solutos e cria gradientes íngremes de moléculas reactivas, incluindo os ácidos orgânicos, entre os biofilme. métodos microscópicos fluorescentes quantitativos, tais como a imagiologia de tempo de vida de fluorescência ou ratiometry pH, pode ser utilizado para visualizar o pH em diferentes microambientes de biofilmes dentais. pH ratiometry explora um deslocamento dependente do pH na emissão de fluorescência de corantes sensíveis ao pH. O cálculo da razão de emissão em dois comprimentos de onda diferentes permite a determinação do pH local em imagens microscópicas, independentemente da concentração do corante. Contrariamente ao microeléctrodos a técnica permite monitorar ambos os gradientes de pH verticais e horizontais em tempo real commecanicamente perturbar o biofilme. No entanto, é preciso ter cuidado para diferenciar com precisão entre os compartimentos extra e intracelulares do biofilme. Aqui, o corante raciométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) é empregue para monitorizar o pH extracelular in vivo em biofilmes dentais cultivadas espécies de composição desconhecida. Após a exposição a glicose do corante é up-concentrada dentro de todas as células bacterianas nos biofilmes; É, assim, usado tanto como uma mancha universal de bactérias e como um marcador do pH extracelular. Após a aquisição da imagem microscópica confocal, a biomassa bacteriana é removida de todas as fotos usando o software de análise de imagem digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH com o corante proporcional está bem adequado para o estudo do pH extracelular em biofilmes finos de até 75 um de espessura, mas está limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0.

O método apresentado permite a monitorização extracelular pH cai em diferentes microambientes de biofilmes dentais na gama de pH de 4,5 a 7, em tempo real. Se as condições experimentais são escolhidas como descrito acima, o pH começa a cair em todas as áreas dos biofilmes logo após a exposição à glicose. Quando o pH em um biofilme gotas, as células bacterianas se tornam visíveis dentro de pouco tempo (&lt;1 min), como o corante é raciométrica upconcentrated nas células (Figura 2A). No início, antes que a produção de ácido no biofilme começa, nenhuma diferença pode ser visto entre o fundo eo células. Imagens exportados para o daime software tem que ser segmentado, com limiares escolhidos individualmente de brilho, a fim de obter uma boa congruência entre a biomassa bacteriana nas imagens e os objectos reconhecidos pelo programa (Figura 2B). Se segmentado aprotamente, eliminação de objectos em Daime remove todos os sinais de fluorescência que derivam a partir de células bacterianas (Figura 2C). processamento de imagem subsequente no ImageJ resulta em índices de verde / vermelho para pixels no espaço extracelular das imagens. Com a ajuda da curva de calibração, estas relações podem ser convertidos para os valores de pH e visualizados com coloração por falsa representação gráfica (Figura 2D). A média do pH pode ser calculado para cada uma das imagens processados, e o desenvolvimento do pH pode ser seguido ao longo do tempo (Figura 2E). gotas de pH podem diferir entre diferentes campos de vista microscópico, e ambos os gradientes de pH horizontal e vertical pode ser monitorizada. No entanto, sob condições estáticas, dentro de biofilmes finos, apenas pequenos gradientes de pH verticais pode ser observada. Em alguns casos, todo o campo de vista microscópico pode ser coberta com células bacterianas que torna o cálculo de extracelularpH impossível (Figura 3A). O problema pode ser resolvido através da escolha de um plano de foco um pouco diferente. Deve ser tomado cuidado para não sobreexpor as imagens microscópicas, porque a biomassa bacteriana nas imagens, em seguida, cobre uma área maior do que, na realidade, (Figura 3B). Quando a segmentação da imagem em Daime é crucial para escolher limiares de brilho que reconheçam todas as células bacterianas e, se, células epiteliais humanas presentes (Figura 3C) como objectos. Se segmentação é realizada com limiares muito alto brilho, áreas intracelulares serão incluídos no cálculo de pH e levar a resultados errados (Figura 3D). Monitorização do pH extracelular com o corante proporcional está limitada pela utilização de microscopia confocal. Até uma profundidade de penetração de 75 mm, as áreas extra e intracelulares podem ser distinguidos de forma fiável (Figura 3E). Para medir gradientes de pH verticais em biofilmes mais espessos, microeléctrodos permanece o conheceuhod de escolha. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig1.jpg" /> Figura 1:.. Acrílico Tala para Intraoral biofilme Colecção A tala é projetada com flanges de acrílico bucais ligados por um fio ortodôntico lingual que permite que o voluntário a morder oclusão normal <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig2.jpg" /> Figura 2:. Processamento de Imagem para microscópica Medição da Extracelular biofilme pH (A) imagem microscópica confocal de um biofilme corado com o corante ratiometric, 9 min após a exposição à glicose. A biomassa bacteriana em que a imagem pode ser distinguida a partir do fundo extracelular. (B)<html> A mesma imagem após a segmentação no daime. A biomassa bacteriana inteiro no campo de microscópico de vista tem sido reconhecida como objectos durante segmentação, como indicado pelas linhas de laranja. (C) A mesma imagem após a remoção da biomassa bacteriana. Todos fluorescência derivar a partir de células bacterianas foi removido, e apenas a fluorescência resultante a partir da matriz extracelular é deixada na imagem. (D) a representação gráfica de pH extracelular no mesmo campo de vista microscópico. rácios de verde / vermelho foram calculados em ImageJ, e falsa coloração foi aplicado para a representação gráfica de pH extracelular. pH extracelular Média = 5,86. (AD) Escala = 20 um barras. (E) queda média do pH no mesmo campo de vista microscópico, monitorizados durante 15 min. A descida brusca de pH nesta área do biofilme é mais rápido no começo, logo após a exposição à glicose. Em seguida, ele fica mais lento, mas não atingir um patamar dentro do período de observação.https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig3.jpg" /> Figura 3:. Medição microscópica do Extracelular biofilme pH - possíveis problemas e erros (A) Confocal imagem microscópica de um biofilme densa expostos a glicose e corados com o corante ratiometric. Neste campo de vista microscópico, toda a imagem é coberta por células bacterianas, e a remoção das bactérias não vai deixar áreas extracelulares para o cálculo do pH. (B) Overexposed imagem microscópica confocal de um biofilme corado com o corante ratiometric. Durante a segmentação de imagens de imagens com exposição a áreas maiores do que efectivamente coberta por bactérias são reconhecidos como objectos e parte do espaço extracelular é perdido para o cálculo do pH. (C) BIOFimagem ILM com células epiteliais (setas). limiares de brilho para a segmentação da imagem tem de ser escolhida, de modo que as células epiteliais são reconhecidos como objectos e removidos a partir das imagens antes de cálculo de pH. (D) A mesma imagem biofilme como na Figura 1B, segmentado, com um nível de luminosidade errado. Parte da biomassa bacteriana não é reconhecido como objectos e não pode ser removido a partir da imagem. Isto leva a inclusão de domínios intracelulares no cálculo do pH e consequentemente resultados erróneos. (E) camada profunda de um biofilme corado com o corante ratiometric. A imagem foi obtida a partir de 90 um a interface biofilme-substrato. A diferenciação entre as áreas extra e intracelulares está comprometida. Barras de escala = 20 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário

Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K visualizações.  Aarhus University.  Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real. 

Vídeo: Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Síntese, Entrega Celular e<em&gt; In vivo</em&gt; Aplicação de sensores de pH à base de Dendrímero

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Química

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Imunologia e Infecção

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoramento in vitro do pH extracelular em tempo real

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Monitoramento do pH extracelular em tempo real

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

Bioquímica

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

Imagem Química de Alta Resolução Espacial de Infecções Associadas a Implantes com Luminescência Expedida por Raios-X Imagem Química Através do Tecido

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Monitoramento de pH extracelular em biofilmes transversais usando microscopia confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

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