Die Autoren möchten Javier E. Garcia und Lene Grønkjær für die technische Unterstützung und Merete K. Raarup für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde von Aarhus University Research Foundation finanziert und die Simon Spies-Stiftung.

Das experimentelle Protokoll wurde von der Ethikkommission der Aarhus County (M-20100032) überprüft und genehmigt. 1. Konfokalmikroskopische Kalibrierung des Ratiometrisch Dye <ol><li> Für die Bildaufnahme, ein umgekehrtes konfokalen Mikroskop mit einem Inkubator, eine 63X / 1.2-numerische Apertur Wassertauchziel, eine 543 nm Laserlinie und ein META-Detektor ausgestattet verwenden. </li><li> Bereiten Sie HEPES-Puffer-Stammlösungen (50 mM, eingestellt auf pH 4,5 bis 8,5 in Schritten von 0,1 pH-Einheiten). Je 100 &amp; mgr; l jeder Lösung in die Vertiefungen einer klaren Boden 96-Well-Platte für Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Tragen Sie Handschuhe aus Nitril, wenn die ratiometrisch Farbstoff Handhabung C-SNARF-4. Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung des Farbstoffs in Dimethylsulfoxid. In 5 ul der Stammlösung in jede Vertiefung mit HEPES-Puffer. Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Mikroskop. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop. Öffnen Sie die Mikroskop-Software. Klicken Sie auf die folgenden Panels: Erfassung → Laser; Erwerben → Micro; Erwerben → Config; Erwerben → Scannen; Erwerben → Bühne. Warm up den Inkubator auf 37 ° C. </li><li> Schalten Sie den 543-nm-Laserlinie durch Klicken auf die 543-nm-Laser und dem &quot;On&quot; Taste in der &quot;Laser Control&quot; Fenster. Wählen Sie das 63X / 1.2-numerische Apertur Wassertauchziel in der &quot;Microscope Control&quot; Fenster. </li><li> Stellen Sie den META-Detektor gleichzeitig überwachen Fluoreszenz innerhalb 576- bis 608-nm (grün) und 629- bis 661 nm (rot) Intervalle ( &quot;Configuration Control&quot; → &quot;ChS&quot;). Stellen Sie die Laserleistung ( &quot;Configuration Control&quot; → &quot;Anregung&quot;). Stellen Sie die Pinhole eine optische Schichtdicke von 1,6 um ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Pinhole&quot;) zu erhalten. </li><li> Erwerben Sie ein Bild jedes HEPES-Pufferlösung, 5 &amp; mgr; m über dem Glasboden der 96-Well-Platte. Hinweis: Sobald der Fokusebene unter dem Glasboden gelegen ist, kann kein Fluoreszenzlicht zu sehenauf dem Bildschirm. Nach jedem dritten Bild, stellen Sie die Laserleistung ein Bild für Untergrundsubtraktion auf Null und nehmen. </li><li> Führen Sie die Kalibrierung Experiment in dreifacher Ausfertigung (1,2-1,7). </li><li> Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität und Standardabweichung in allen roten und grünen Bilder. <ol><li> Berechnen des Verhältnisses R und Standardfehler des Mittelwerts, S R, für jedes Bild entsprechend den Gleichungen (1) und (2) (1) <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s und s g r sind die Mittelwerte und Standardabweichungen in den jeweiligen grünen und roten Bilder. b g, b r, s und s br bg die entsprechenden Werte für den Hintergrundbildern werden. n <em&gt; 2 ist die Anzahl der Bildpunkte abgebildet werden . </li><li> Plotten die berechneten Verhältnisse für jeden pH - Wert aus den drei Wiederholungskalibrierungsexperimente in einem Diagramm und bauen eine angepasste Kurve aus dieser Serie von Datenpunkten (dh unter Verwendung der Software SigmaPlot 13). Machen Sie eine mathematische Funktion aus der angepassten Kurve , die Verhältnisse in pH - Werten 10 umwandeln kann. </li></ol></li></ol> 2. Sammlung von In Situ Grown Dental Biofilm Proben <ol><li> Wählen Freiwilligen, die Ein- und Ausschlusskriterien für die Studie relevante erfüllen. Machen Sie Alginatabdrücke ihrer oberen und unteren Zahnbogen. Machen Sie Gussmodelle aus diesen Eindrücken und Produktion eines Acryl Schiene im Unterkiefer. Gestalten Sie die Schiene mit Wangen Acryl-Flansche durch eine linguale orthodontischen Draht verbunden , dass die Freiwilligen 12 beißen in die normale Okklusion ermöglicht. </li><li> Drill Rezessionen in den bukkalen Flansche der Acryl-Schiene (Abbildung 1 </strong&gt;) Mit Hilfe von Zahnbohrern Acryl Insertion von Glasplatten für Biofilm Sammlung zu ermöglichen. Die Tiefe der Vertiefungen sollte mindestens 1,5 mm betragen, während die Breite und Länge der Vertiefungen in Abhängigkeit von der Anzahl von Glasplatten variieren können eingesetzt werden. </li><li> Für Biofilm Sammlung verwenden maßgeschneiderte nicht fluoreszierenden Glasplatten (4 x 4 x 1 mm 3) mit einer Oberflächenrauheit von Körnung 1200 , um 11 , um die Kolonisierung Muster auf natürlichen Zahnschmelz zu imitieren. </li><li> Sterilisieren der Glasplatten durch Autoklavieren vor der Montage. Montieren Sie die Glasplatten mit Klebewachs in den Vertiefungen in den bukkalen Flansche jeder Seite leicht auf der Oberfläche der Acryloberfläche vertieft , um den Biofilm von Scherkräften durch die Bewegung der Wangen 11 ausgeübt zu schützen. Anmerkung: Die Zahl der Glasplatten in eine Rezession gestellt wird, kann zwischen 3 und 14, je nach dem Ziel der Studie variieren. </li><li> Stecken Sie das Gerät in den Mund des Freiwilligen. Weisen Sie den ehrenteer das Gerät intraoral über den Versuchszeitraum zu behalten. Weisen Sie den Freiwilligen das Gerät in einer orthodontischen Haltebehälter zu speichern, mit einem Stück feuchten Papiertuch (zu halten es feucht) bei Raumtemperatur während des Zähneputzens und Aufnahme von Nahrung und Getränken, ausgenommen Wasser. Weisen Sie den Freiwilligen nicht die Mund Acryl-Flansche mit den Glasplatten berühren beim Platzieren und das Gerät zu entfernen. Hinweis: Die Versuchsdauer kann je nach dem Ziel der Studie (ein Tag bis zu mehreren Wochen). </li><li> die Glasplatten aus dem Gerät am Ende des Versuchszeitraums sorgfältig entfernen. Entfernen Sie die Klebewachs um die Platten mit einem Messer und übertragen sie mit einer Pinzette in einen geschlossenen Behälter, der Biofilm nach oben zeigt, bis mikroskopische Analyse. Halten Sie den Behälter mit nassen Papiertuch feucht. Führen pH-Bildgebung innerhalb von wenigen Stunden nach der Biofilm-Sammlung. </li></ol> 3. Biofilm pH Imaging <ol><li> BereitenSpeichel Lösung von Dithiothreitol zu gesammelten Speichel nach der Methode von de Jong et al Zugabe. 13. Titrieren der Speichellösung auf pH 7,0 und Zugeben von Glukose zu einer Konzentration von 0,4% (wt / vol). Je 100 &amp; mgr; l pro Biofilm für die Mikroskopie in einem Glasboden-96-Well-Platte analysiert werden. In 5 ul des ratiometrischem Farbstoff pro Vertiefung. </li><li> Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Mikroskoptisch. Schalten Sie das Mikroskop und die 543-nm-Laserlinie. Warm up den Inkubator auf 37 ° C. Verwenden Sie die gleichen Mikroskopeinstellungen wie für die Kalibrierung des Farbstoffs (siehe Schritte 1,5-1,6). Warten für 30 Minuten, bis die 96-Well-Platte Arbeitstemperatur erreicht hat. </li><li> Pick-up eine oder mehrere Glasplatten mit einem dünnen Satz von Pinzette und legen Sie sie in den Speichel gefüllten Brunnen, eine Platte pro Vertiefung mit den Biofilmen nach unten zeigt. </li><li> Erwerben Sie einzelne Bilder ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Single&quot;) oder z-Stapel ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Start&quot;) spanning die Tiefe der Biofilme in verschiedenen Bereichen. z-Stapel wählen die Anzahl der Scheiben zu erwerben abgebildet werden soll ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Z Einstellungen&quot; → &quot;Num Slices&quot;) und markieren Sie die z-Position für die erste und die letzte Schicht in der Mikroskop-Software ( &quot;Scan Control &quot;→&quot; Z Einstellungen &quot;→&quot; Mark First &quot;,&quot; Mark Last &quot;). Anmerkung: Z-Stapel mit einer Tiefe von bis zu 75 &amp; mgr; m können mit gutem Kontrast zwischen extra- und intrazellulären Bereichen erworben werden. </li><li> Zur pH-Änderungen in einem mikroskopischen Sichtfeld im Laufe der Zeit, markieren Sie die xy-Position in der Mikroskop-Software ( &quot;Stage und Fokussteuerung&quot; → &quot;Mark Pos&quot;) und nehmen Sie wiederholt Bilder zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;folgen Single&quot;). nehmen Sie regelmäßig Bilder mit der Laserleistung auf Null für Untergrundsubtraktion gesetzt. </li></ol> 4. Digitale Bildanalyse <ol><li> Um export die mikroskopischen Bilder als TIF-Dateien, indem Sie die Datei Batch-Export des Mikroskop-Software ( &quot;Macro&quot; → &quot;Datei-Export&quot;). Markieren Sie die Dateien exportiert werden und speichern roten und grünen Kanal Bilder in separaten Ordnern als TIF-Dateien ( &quot;Start-Export&quot;). Benennen Sie die Dateien in beiden Ordnern ihnen fortlaufenden Nummern geben. </li><li> Importieren Sie die roten und grünen Bildserien in Software wie Daime (digitale Bildanalyse in der mikrobiellen Ökologie) 14. Segment die grünen Kanalbilder mit individuell ausgewählten Helligkeitsschwellen (Segment → Automatische Segmentierung → Benutzerdefinierte Schwelle). Wählen, um die Helligkeitsschwellen vorsichtig (in der Regel zwischen 20 und 80), so dass alle Bakterien (heller als die extrazelluläre Matrix), nicht aber die Matrix wird als Objekte bei der Segmentierung erkannt werden. Überprüfen Sie visuell, dass die Bereiche als Objekte erkannt entsprechen gut auf die bakterielle Biomasse. </li><li> Übertragen Sie die Objektschicht des segmentierten green Kanalbilder mit den entsprechenden roten Kanal Bilder (Segment → Übertragung Objektschicht). Verwenden Sie den Objekt-Editor-Funktion zu verwerfen und alle Objekte in den roten und grünen Kanal Bilder zu löschen. Jetzt nur die extrazelluläre Matrix wird in der Biofilm Bilder gelassen. Exportieren Sie die verarbeiteten Bildserie als TIF-Dateien. </li><li> Importieren Sie die Bilderserie in ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität in den Hintergrundbildern mit dem Laser genommen ausgeschaltet (Analyse → Histogramm). Ziehen Sie den entsprechenden Hintergrund von den roten und grünen Bilder (Process → Math → subtrahieren). </li><li> Noch in ImageJ, teilen Sie die grüne Bilderserie (G1) mit sich selbst (Bild Rechner Prozess →). Dann multiplizieren Sie das resultierende Bild-Serie (G2) mit dem grünen Bild-Serie (G1). Dies wird eine Bildserie (G3) ergeben, wobei NaN allen Pixeln zugewiesen gehört zu den Bereichen, die als Objekte in daime erkannt wurden. Gehen Sie in ter dieselbe Weise mit der roten Bildreihe (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). Hinweis: Da die bakterielle Biomasse aus den Bildern in Schritt 4.3, die Fluoreszenzintensität 0 ist in diesen Bereichen entfernt wurde. Schritt 4.5 ist notwendig, den Wert 0 bis NaN zu konvertieren, die in Schritt 4.6 für Verhältnisberechnung ermöglicht. </li><li> Übernehmen Sie die &#39;mean&#39; Filter (Process → Filter → Mittelwert; Radius: 1 Pixel) für Detektorrauschen zu kompensieren. Teilen Sie die grüne Bild Serie durch die rote Bildserien (Prozess → Bildrechner). Dies führt zu einer Grün / Rot-Verhältnis für jeden verbleibenden Pixel in den extrazellulären Raum der Bilder. Verwenden Sie falsche Farbgebung für die grafische Darstellung der Verhältnisse in den Bildern (Bild → Lookup-Tabellen). Berechnen Sie die mittlere Verhältnis für jedes Bild (Analyse → Histogramm). </li><li> Konvertieren Sie die grün / rot-Verhältnisse auf pH-Werte entsprechend der Funktion unter 1.9.2 eingebaut). Hinweis: Ein Beispiel für die Kalibrierungsdaten und angepassten Kurve in Schlafer et gesehen werdenal, 2015 11. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mikroskopischen Überwachung von Biofilm pH bietet mehrere Vorteile, wie 4-6 Elektrode oder Mikroelektroden - Messungen verglichen. Die mikroskopische Techniken erlauben pH-Wert mit einer hohen räumlichen Auflösung zu bestimmen und ermöglichen sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten in Biofilmen Erfassung ohne den Biofilm mechanisch zu stören. Frühere Versuche von mikroskopisch kleinen pH - Überwachung gelang es jedoch nicht , zwischen extra- und intrazellulären pH - Wert in den Biofilmen 1,7,9 zu unterscheiden. Durch bakterielle Homöostase unterscheidet intrazellulären pH von extrazellulären pH-Wert und pH-Berechnungen nicht gültig, wenn beide intra- und extrazellulären Kompartimenten zu der aufgezeichneten Fluoreszenzemission beitragen. Die Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoff zusammen mit dem pH-empfindlichen Farbstoff bakteriellen Zellen sichtbar zu machen, ist problematisch, da selbst eine kleine Überlappung zwischen den Emissionsspektren der Farbstoffe kann die Quantifizierung von Fluoreszenzlicht beeinträchtigen. Deshalb ist die Technik, die hier vorgestelltberuht auf einem Konzentrationsgradienten des Farbstoffs ratiometrisch zwischen extra- und intrazellulären Kompartimenten des Biofilms zu identifizieren und später Bakterienzellen aus den erfassten pH Bilder entfernen. Nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Bakterienzellen in Biofilmen internalisieren und auf konzentriert, um das Molekül, aber nur unter sauren Bedingungen. pH ratiometrischen mit dem Farbstoff wird daher der pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 begrenzt. Bei pH-Werten oberhalb von 7, die unprotonierte und somit geladene Farbstoff dringt nicht Bakterienzellen gut genug, um sie aus dem extrazellulären Hintergrund zu unterscheiden, und bei pH-Werten unterhalb von 4,5 die meisten der Farbstoffmoleküle sind protonierte und keine weiteren Veränderungen in der Fluoreszenzemission kann beobachtete. Die angepasste Kurve (pH vs. Verhältnis grün / rot) am steilsten ist um pH 6 und abflacht auf pH 4,5. Ein Beispiel ist in Schlafer et al., 2015 Abbildung S2. 11 Derzeit ist die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs für pH ratiometrischen ist begrenzt aufÜberwachung extrazellulären pH 1. Im Prinzip könnte der Farbstoff auch zur Überwachung intrazellulärer bakterieller pH-Änderungen verwendet werden, aber bisher wurde die Kalibrierung nicht für die intrazelluläre Anwendung durchgeführt wurde. Zusätzlich wäre es schwierig, genau zwischen den intrazellulären Fluoreszenzemission und Fluoreszenzlicht Herleiten von Farbstoffmolekülen an der Außenseite der bakteriellen Zellwand befestigt zu unterscheiden. Außerdem ist, wie Färbung mit dem ratiometrisches Farbstoff in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie verwendet wird, die Bildaufnahme in der Biofilmschichten tiefer als 75 &amp; mgr; m von der Abdeckung Glas / Biofilm-Schnittstelle beeinträchtigt wird. Eine Verringerung Kontrast zwischen Bakterienzellen und der extrazellulären Matrix macht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären Bereichen schwierig. Der verwendete Farbstoff ratiometrischem wurde zuverlässig 15 mit Zahn Biofilm assoziierten Bakterienarten gezeigt zu visualisieren, und es färbt alle Bakterienzellen in der dentalen Biofilm in situ gezüchtet 11. Während es wahrscheinlich ist, dass dasratiometrisch Farbstoff ist eine universelle bakterielle Flecken, hat dies noch nicht bewiesen worden, und der Fleck auf Biofilme von anderen Habitaten als der Mundhöhle getestet werden muss. Das Verfahren ermöglicht nicht technische Replikate eines bestimmten pH-Messung zu erzeugen, wie die Bildaufnahme einige Sekunden und Biofilm pH nimmt dynamisch ändert. Wiederholte Abbildung des Biofilms freien Pufferlösungen, jedoch und wiederholte Abbildung von Biofilmen in Puffer ergab stabile pH-Werte (Daten nicht gezeigt). Alle Schritte des oben beschriebenen Verfahrens zur Bildverarbeitung müssen genau eingehalten werden. Biofilm Bilder müssen mit ausreichender Laserleistung / Gewinn erworben werden, um ausreichende Mengen an Fluoreszenzsignal in der extrazellulären Matrix zu erhalten, aber eine Überbelichtung von Bakterienzellen zu vermeiden. Wenn Bakterienzellen überbelichtet (zu hohe Laserleistung oder Verstärkung) größere Flächen als tatsächlich von Bakterien bedeckt werden als Objekte während der Bildsegmentierung und ein Teil des extrazellulären Raum erkannt wird verlorenfür pH - Berechnung (siehe 3B). Auf der anderen Seite, wenn Bilder mit sehr niedrigen Laserleistung / Gewinn erworben werden, Fluoreszenzintensität in den extrazellulären Raum für eine zuverlässige Berechnung der grün / rot Emissionsverhältnisse möglicherweise nicht ausreichend sein. Ein Bereichsanzeige Werkzeug in der Mikroskop-Software kann verwendet werden, um die Einstellungen des Mikroskops zu justieren, so dass bakterielle Zellen mit maximaler Intensität erfasst werden, jedoch ohne Überbelichtungen. Automatische Bildsegmentierungs muss für alle Biofilm Bilder gesteuert werden, um sicherzustellen, dass alle Bakterien und, falls vorhanden, sind eukaryotische Zellen als Objekte von der Software erkannt. Nach der Segmentierung sollten alle Biofilm Bilder nacheinander auf die jeweiligen Bilder unsegmented Kongruenz zwischen der bakteriellen Biomasse und den Bereich als Objekte erkannt zu ermitteln verglichen werden. Wenn größere Flächen als die von Bakterien bedeckt diejenigen erkannt werden als Objekte der Helligkeitsschwelle für eine genaue Differenzierung zu gering ist, und die Segmentierung muss mit einem hallo durchgeführt werdengher Helligkeitsschwelle. Wenn ein Teil der bakteriellen Biomasse nicht unter den Objekten, muss die Helligkeitsschwelle gesenkt werden, um eine korrekte Differenzierung zwischen extra- und intrazellulären Raum zu erhalten. Für die Analyse von großen Datenmengen hat es alle Bilder mit einer Reihe von unterschiedlichen Helligkeitsschwellen als vorteilhaft erwiesen Segment und anschließend die ideale Schwelle für jedes Bild bestimmen. Sobald eine korrekte Unterscheidung zwischen Bakterien und extrazellulären Matrix erreicht ist, werden keine weiteren Probleme bei der Bildverarbeitung zu erwarten. Es kann jedoch sein, einige Bilder mit einem sehr dichten Biofilm, in dem Bakterien das gesamte mikroskopische Sichtfeld abdecken. In diesen Bildern Offensichtlich kann extrazelluläre pH-Wert nicht bestimmt werden. In manchen Fällen kann das Problem durch Erfassung von Bildern in einer etwas anderen z-Ebene aufgelöst werden, wobei die bakterielle Biomasse nicht das gesamte Sichtfeld abdeckt. Weitere Anwendungen von extrazellulären pH ratiometrischen könnte sein, zu studierenpH - Landschaften in anderen mikrobiellen Lebensgemeinschaften als dentaler Biofilme (dh. Pseudomonas aeruginosa Biofilme oder Strom produzierenden bakteriellen Biofilmen). Die Wirkung von verschiedenen ökologischen Parameter, wie Sauerstoffkonzentration, Kohlenhydratzufuhr oder Anwendung von elektrischem Strom auf Biofilm pH könnte bestimmt werden. Der Einfluss von Biofilm Alter, Biofilmdicke und Stoffwechselaktivität auf pH könnten, sowie die Wirkung von pH Modulationsmittel auf bakterielle Biofilme zu untersuchen. Letzteres ist besonders relevant im Zusammenhang mit Zahn Biofilmen, wobei Puffermittel einen vielversprechenden Therapieansatz dar 15 Karies zu steuern. Darüber hinaus sollten künftige Forschung darauf konzentrieren, die vorgestellte Methode unter Strömungsbedingungen Anwendung. Bis heute hat der extrazellulären pH-ratiometrischen nur verwendet worden, pH-Wert unter statischen Bedingungen zu überwachen. Konstante Versorgung mit frischem Sauerstoff angereichertes Medium ist wahrscheinlich erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung des pH-Mikroumgebungen und zu haben,Insbesondere vertikale pH-Gradienten innerhalb dünnen Biofilmen. Die Clearance von Säuren durch Mediumstrom könnte die Einrichtung von vertikalen Gradienten auch in sehr dünnen Biofilms beitragen. Ratiometrisch konfokale mikroskopische Bildgebung mit dem ratiometrisches Farbstoff C-SNARF-4 in Kombination mit präzisen Nachbearbeitung der aufgenommenen digitalen Bildern erlaubt Biofilm pH-Wert in der extrazellulären Matrix, in Echtzeit, im pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 und bis zu berechnen und zu visualisieren, zu eine Biofilm-Dicke von 75 &amp; mgr; m.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht im Bereich zwischen 4,5 und 7, mit der ratiometrisches Farbstoff in Kombination seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) in der dentalen Biofilm extrazellulären pH-Überwachung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie und Digitalbildanalyse. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist pH-empfindlich und zeigt eine Verschiebung in der Fluoreszenzemission über den Stand der Protonierung abhängig. Die Fluoreszenzemission der protonierten Molekül - Peaks bei 580 nm und die Emission des deprotonierten Moleküls bei 640 nm 1. Das Verhältnis der Fluoreszenzemissionsintensitäten in zwei Detektionsfenster aus den beiden Emissionsspitzen (576-608 nm und 629-661 nm) reflektiert somit pH in der flüssigen Phase, und zwar unabhängig von der Farbstoffkonzentration. Mit einem pK a von ~ 6,4 ist der Farbstoff geeignete pH in mäßig sauren Umgebungen zu visualisieren. PH in bakterielle Biofilme ist von zentraler Bedeutung für alle Stoffwechselprozesse.Im Falle von Zahn Biofilmen, pH in der extrazellulären Matrix ist der Schlüssel Virulenzfaktor für die Entwicklung von Zahnkaries. Verlängerte mit niedrigem pH - Wert an der Biofilm-Zahn - Schnittstelle führen zu verlangsamen Entmineralisierung des zugrunde liegenden Schmelz 2. Aufgrund der komplexen dreidimensionalen Architektur von Biofilmen, Metaboliten, einschließlich organische Säuren, sind nicht gleichmäßig über den Biofilm verteilt. Hoch und weniger acidogene Mikroumgebungen kann 3 in enger räumlicher Nähe zu finden. Seit Jahrzehnten vertikale pH - Gradienten in Biofilme wurden mit Hilfe von Mikroelektroden 4-6 aufgezeichnet. Während sie eine gute räumliche Auflösung aufgrund ihrer geringen Größe Spitze bieten, sind sie nicht gut geeignet horizontalen Gradienten zu überwachen. Außerdem Einführen der Elektrode stört die mechanisch Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopischer Techniken bieten den Vorteil der pH-Änderungen in verschiedenen Bereichen eines Biofilms Visualisierung ohne mechanische interferierennce. Verschiedene mikroskopische Sichtfelder können frei gewählt werden und immer wieder über längere Zeiträume 1,7-9 abgebildet. Wenn jedoch mikroskopische Biofilm Bilder interpretieren, ist es wichtig, zwischen Fluoreszenz zu unterscheiden von der mikrobiellen Biomasse und Fluoreszenz aus dem extrazellulären Raum Ableitung abzuleiten. Unter sauren Bedingungen, pH innerhalb Bakterienzellen unterscheidet sich von pH in der extrazellulären Matrix, wie die Bakterien aktiv 10 Protonen über die Zellmembran auf Kosten von Adenosintriphosphat transportieren. Im Zusammenhang mit der Zahnkaries, intrazelluläre bakterielle pH-Wert hat keinen direkten Einfluss auf die zugrunde liegenden Schmelz während niedrige extrazellulären pH-Wert auf Entmineralisierung führt. Averaging pH-Wert in mikroskopischen Bildern, die sowohl bakterienfreie Zonen und Bakterien enthalten führt zu falschen Ergebnissen. Die Verwendung anderer Flecken zusammen mit dem pH-empfindlichen Farbstoff, um die bakterielle Biomasse und differenzieren zwischen extra- und intrazellulären Bereiche bringt ab zu visualisierenaus dem Risiko einer fluoreszierenden Kontamination des extrazellulären Raum und falsche Messungen 11. Die vorliegende Manuskript beschreibt daher die Verwendung des ratiometrisches Farbstoff in einer Doppelfunktion; sowohl als pH-Marker und als universelle bakterielle Fleck. Da der Farbstoff up konzentrierter in Bakterienzellen ist, erlaubt die Kombination von konfokalen mikroskopischen Abbildungs ​​und ein genaues digitales Bildanalyseverfahren die Bestimmung der extrazellulären pH-Wert im Bereich zwischen 4,5 und 7,0 in dünnen dental Biofilmen.

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

Der pH-Wert in der bakteriellen Biofilmen auf den Zähnen ist von zentraler Bedeutung für die Zahnkaries, eine Krankheit mit einer hohen Prävalenz weltweit. Nährstoffe und Metaboliten sind nicht gleichmäßig in der dentalen Biofilm verteilt. Ein komplexes Zusammenspiel von Sorption und Reaktion mit organischen Stoffen im Biofilm reduziert die Diffusionswege von gelösten Stoffen und schafft Steigungen von reaktiven Molekülen, einschließlich organische Säuren, über den Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopische Methoden, wie Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebung oder pH ratiometrischen können pH in unterschiedlichen Mikroumgebungen von dentalen Biofilmen zu visualisieren eingesetzt werden. pH ratiometrischen nutzt eine pH-abhängige Verschiebung in der Fluoreszenzemission von pH-empfindlichen Farbstoffen. Berechnung des Emissionsverhältnis bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen erlaubt die Bestimmung lokaler pH in mikroskopischen Bildern, unabhängig von der Konzentration des Farbstoffes. Im Gegensatz zu der Technik Mikroelektroden erlaubt sowohl vertikale als auch horizontale pH-Gradienten in Echtzeit-Überwachung mitaus mechanisch stören den Biofilm. Allerdings muss darauf geachtet werden genau zwischen extra- und intrazellulären Kompartimenten des Biofilms zu unterscheiden genommen werden. Hier ist die ratiometrisches Farbstoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) verwendet wird , extrazellulären pH - Wert in in vivo gewachsen dentaler Biofilme unbekannter Artenzusammensetzung zu überwachen. Bei der Belichtung des Farbstoffes auf Glucose ist up-konzentriert innerhalb aller Bakterienzellen in den Biofilmen; Es ist somit sowohl als universelle bakterielle Flecken und als Marker des extrazellulären pH verwendet wird. Nach konfokalen mikroskopischen Bildaufnahme wird der Bakterienbiomasse aus allen Bildern mittels digitaler Bildanalyse-Software, entfernt, die extrazelluläre pH ausschließlich berechnen es erlaubt. pH ratiometrischen mit dem ratiometrisch Farbstoff ist gut geeignet extrazellulären pH in dünnen Biofilms von bis zu 75 &amp; mgr; m Dicke zu untersuchen, wird jedoch auf den pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 begrenzt.

Das vorgestellte Verfahren ermöglicht die Überwachung der extrazellulären pH-Wert fällt in unterschiedlichen Mikroumgebungen von dentalen Biofilmen im pH-Bereich von 4,5 bis 7 in real-time. Wenn die Versuchsbedingungen gewählt werden, wie oben beschrieben, beginnt pH kurz in allen Bereichen der Biofilme zu fallen nach Exposition gegenüber Glucose. Wenn der pH in einem Biofilm abfällt, werden Bakterienzellen sichtbar innerhalb kurzer Zeit (&lt;1 min), da die ratiometrisch Farbstoff in den Zellen (2A) upconcentrated wird. In der ersten Stunde, bevor die Säureproduktion in den Biofilm beginnt, kann kein Unterschied zwischen Hintergrund und Zellen erkennbar. Bilder in die Software daime exportiert haben mit individuell ausgewählten Helligkeitsschwellen, um eine gute Übereinstimmung zwischen der bakteriellen Biomasse in den Bildern und Objekten durch das Programm (2B) anerkannt zu erhalten segmentiert werden. Wenn segmentiert entsprezüglich entfernt Löschen von Objekten in daime alle Fluoreszenzsignale , die aus Bakterienzellen (Abbildung 2C) abzuleiten. Nachfolgende Bildverarbeitung in ImageJ ergibt Grün / Rot-Verhältnisse für die Pixel in den extrazellulären Raum der Bilder. Mit Hilfe der Eichkurve können diese Verhältnisse auf pH - Werte und visualisiert mit falschen Färbung zur grafischen Darstellung (2D) umgewandelt werden. Durchschnittliche pH - Wert kann für jedes der verarbeiteten Bilder berechnet werden, und die pH - Entwicklung über die Zeit (2E) folgen. pH-Tropfen können zwischen verschiedenen mikroskopischen Sichtfelder unterscheiden und sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten überwacht werden kann. Jedoch unter statischen Bedingungen, innerhalb dünnen Biofilmen, nur geringe vertikale pH-Gradienten beobachtet werden kann. In einigen Fällen kann die gesamte mikroskopische Sichtfeld mit Bakterienzellen abgedeckt werden, die Berechnung der extrazellulären rendertpH unmöglich (3A). Das Problem kann durch die Wahl einer etwas anderen Fokusebene gelöst werden. Es muss darauf geachtet werden , nicht die mikroskopischen Bilder zu überbelichten, weil die bakterielle Biomasse in den Bildern dann eine größere Fläche bedeckt als in der Realität (3B). Wenn das Bild in daime Segmentieren ist es entscheidend , Helligkeitsschwellen zu wählen , die alle Bakterienzellen und, falls vorhanden, humanen Epithelzellen (3C) als Objekte erkennen. Wenn Segmentierung wird mit einem zu hohen Helligkeitsschwellen durchgeführt wird , wird die intrazelluläre Bereiche im pH - Berechnung einbezogen werden und führen zu fehlerhaften Ergebnissen (3D). Überwachung der extrazellulären pH-Werts mit dem ratiometrisch Farbstoff wird durch die Verwendung der konfokalen Mikroskopie beschränkt. Bis zu einer Eindringtiefe von 75 um, extra- und intrazelluläre Bereiche zuverlässig (Figur 3E) zu unterscheiden. Zur Messung der vertikalen pH-Gradienten in dicker Biofilmen, bleiben die Mikroelektroden erfüllthod der Wahl. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Acryl Splint für intraorale Biofilm - Sammlung Die Schiene mit Wangen Acryl-Flanschen verbunden durch eine linguale orthodontischen Draht ausgelegt ist , dass die Freiwilligen in den normalen Okklusion zu beißen können <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig1large.jpg" target="_blank">Sie hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Bildverarbeitung für die mikroskopische Messung der extrazellulären Biofilm pH - Wert (A) Konfokalmikroskopische Bild eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt, 9 min nach der Exposition auf Glukose. Die bakterielle Biomasse im Bild kann aus dem extrazellulären Hintergrund zu unterscheiden. (B)<html> Das gleiche Bild nach der Segmentierung in daime. Das gesamte bakterielle Biomasse im mikroskopischen Sichtfeld wurde als Objekte während Segmentierungs erkannt, wie es durch die orange Linien angedeutet ist. (C) Das gleiche Bild nach dem Entfernen der bakteriellen Biomasse. Alle Fluoreszenz aus Bakterienzellen abgeleitet wurde entfernt, und nur die Fluoreszenz von der extrazellulären Matrix abgeleitet ist im Bild nach links. (D) Grafische Darstellung des extrazellulären pH in der gleichen mikroskopischen Gesichtsfeld. Grün / Rot-Verhältnisse wurden berechnet in ImageJ und falsche Färbung wurde für die grafische Darstellung von extrazellulären pH-Wert aufgetragen. Durchschnittliche extrazellulären pH-Wert = 5,86. (AD) Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. (E) Durchschnitts pH - Abfall in der gleichen mikroskopischen Sichtfeld für 15 min überwacht. Der pH-Abfall in diesem Bereich des Biofilms ist schnellste am Anfang, kurz nach der Einwirkung von Glucose. Dann bremst sie aber nicht ein Plateau innerhalb der Beobachtungszeit erreichen.https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53622/53622fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Mikroskopische Messung der extrazellulären Biofilm pH - Mögliche Probleme und Fehler (A) Konfokalmikroskopische Bild eines dichten Biofilm ausgesetzt mit dem ratiometrisches Farbstoff Glukose und gefärbt. In dieser mikroskopischen Gesichtsfeld, wird das gesamte Bild mit Bakterienzellen bedeckt, und Entfernen der Bakterien nicht extrazellulären Bereiche für pH Berechnung verlassen. (B) Überbelichtet konfokalmikroskopische Bild eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt. Während der Bildsegmentierung überbelichtet Bilder größere Flächen als tatsächlich von Bakterien bedeckt werden als Objekte und ein Teil des extrazellulären Raum ist für die pH-Berechnung verloren erkannt. (C) bioFilm Bild mit Epithelzellen (Pfeile). Helligkeitsschwellen zur Bildsegmentierung muss gewählt werden, so dass Epithelzellen als Objekte erkannt werden und von den Bildern vor der pH-Berechnung entfernt. (D) Das gleiche Biofilm Bild wie in 1B, mit einem falschen Helligkeitsschwelle segmentiert. Teil der bakteriellen Biomasse wird nicht als Objekte erkannt und kann nicht aus dem Bild entfernt werden. Dies führt zur Aufnahme von intrazellulären Bereiche im pH-Berechnung und damit zu fehlerhaften Ergebnissen. (E) tiefe Schicht eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt. Das Bild wurde 90 &amp; mgr; m aus dem Biofilm-Substrat-Schnittstelle erworben. Eine Differenzierung zwischen extra- und intrazellulären Bereichen gefährdet ist. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53622/53622fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

Ein pH-sensitive ratiometrisch Farbstoff wird in Kombination mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und digitale Bildanalyse zur Überwachung der extrazellulären pH in der dentalen Biofilme in Echtzeit verwendet.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  Aarhus University.  Ein pH-sensitive ratiometrisch Farbstoff wird in Kombination mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und digitale Bildanalyse zur Überwachung der extrazellulären pH in der dentalen Biofilme in Echtzeit verwendet. 

Serie: Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Synthesis, Cellular Lieferung und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Forschung

Chemie

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Immunologie und Infektion

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>In-vitro-Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

Biochemie

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

Chemische Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung von implantatassoziierten Infektionen mit röntgenangeregter Lumineszenz-chemischer Bildgebung durch Gewebe

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

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