O financiamento para este trabalho foi fornecida pela Fondation Bettencourt Schueller em apoio da equipe de Paris Bettencourt iGEM. Agradecemos a unidade INSERM pesquisa U1001 e Chantal Lotton para a assistência técnica e aconselhamento. Fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP foi fornecida por Monica Ortiz e Drew Endy de Stanford.

1. Projeto e Construção de fagemídeo vetores Tendo sRNA silenciamento Cassetes <ol><li> De Novo Projeto de Srna silenciadas Cassetes 8 <ol><li> Identificar a sequência completa do mRNA a ser silenciado utilizando uma base de dados de sequência de ADN. Para gerar a sequência alvo, observar as primeiras 24 pb da sequência de codificação, a partir da posição 1-24 começando com o codão de início (por exemplo, ATG). Nota: O silenciamento é menos eficiente quando outros sites ou segmentos do mRNA são direcionados 8. </li><li> Leve o complemento inverso da sequência alvo para produzir a sequência de guia para a cassete sRNA. Ver Tabela 1 para exemplos de sequências alvo e guia para cloranfenicol acetiltransferase (CAT). </li><li> Para projetar a cassete completa expressão sRNA 292 bp, organizar o promotor PR, sequência GUIA, domínio HFQ proteína de ligação e sequências de terminação da transcrição T1 / TE em série (Tabela 2). </li><li> Adicionar sítios de clonagem adicionais de escolha para facilitar a clonagem da cassete de sRNA no vector alvo. </li><li> Obter a cassete completa sRNA através de síntese de genes comercial ou um método semelhante e cloná-lo em qualquer vector fagemídeo com uma origem de replicação f1 funcional 11. Consulte Informações de Apoio para a sequência completa do vector fagemídeo final. </li></ol></li><li> Alterando a sequência alvo de uma cassete sRNA expressão existente usando o Site baseado em PCR Directed Mutagênese 12 <ol><li> Identificar a sequência GUIA 24 pb em uma cassete de expressão sRNA existente. Nota: O plasmídeo pAB.001 anotada, utilizada neste trabalho, está disponível como um arquivo sequência suplementar. </li><li> Projeto iniciadores com regiões curtas de homologia com a cassete sRNA existente ladeando a nova sequência GUIA 24 pb para a frente e para trás. Obter os iniciadores através de síntese de oligonucleótidos comercial. Nota: o desenho de primers para a mutagénese dirigida é depicted na Figura 2. sequências molde de primers Exact são fornecidos na Tabela 3. </li><li> Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando o molde fagemídeo sRNA expressão. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. </li><li> Extrair e purificar o modelo de expressão fagemídico do sRNA 5 ml de cultura bacteriana utilizando um kit de miniprep de ADN ou método semelhante 12. </li><li> Prepare a duas reacções de PCR utilizando o modelo de fagemídeo sRNA expressão e de alta fidelidade da polimerase, um a frente e com um iniciador inverso com a (Tabela 4). Use As condições de PCR, tal como recomendado pelo fornecedor da polimerase (Tabela 5). Aumentar a concentração de molde de 10-50x maior do que um padrão de reacção para dar conta do facto de a reacção com uma única escorva não produz a amplificação exponencial. </li><li> Combinam-se as duas reacções de PCR acima num tubo de microcentrífuga. AnneaL os produtos por aquecimento até 98 ° C num banho de água a ferver. Imediatamente após a colocação do tubo de microcentrífuga no banho de água, remove a fonte de calor e permitir que o banho de voltar lentamente para a temperatura ambiente ao longo de 1-2 h. </li><li> Para eliminar a expressão fagemídeo modelo sRNA não mutada, adicionar 1 ul. enzima de restrição Dpnl para a mistura e incubar a 37 ° C durante 1 hora, ou o tempo recomendado pelo fabricante para a digestão completa. Nota: DpnI digere locais-alvo única metilados, que estão presentes em fagemï¿½eos replicados por host, mas não produtos de PCR. </li><li> Transformada adquiridos ou preparados 13 quimicamente competente E. coli com 1-5 ul do produto de PCR recozido. Isolar colónias individuais da estirpe transformada por plaqueamento selectivo em placas de agar LB contendo antibióticos apropriados. </li><li> Para verificar a incorporação da sequência de orientação correcta, o ecrã de colónias resultantes por PCR de colónias. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, collect uma pequena quantidade de células de uma única colónia transformada. Mark e preservar a colônia original para uso a jusante após a verificação. </li><li> Adicionar as células recolhidas a 50 ul de água isenta de nuclease num tubo de microcentrífuga. Misturar por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Usando um termociclador de bancada ou num banho de água a ferver, a lise das células por meio de aquecimento a 95 ° C durante 2 min. </li><li> Amplificar por PCR a região fagemídeo usando 1 ml de células lisadas termicamente, tal como um molde de ADN. As condições de PCR e protocolos termociclador são fornecidos nas Tabelas 6 e 7. Consulte o arquivo sequência pAB.001 suplementar para sequências de verificação de primers. </li><li> Sequenciar o produto de PCR para verificar a incorporação da sequência GUIA correta. </li><li> Inocular uma cultura de 5 ml da E. clone coli carregando o fagemídeo expressão sRNA verificou-sequência. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB. </li><li> Prepare um estoque de gliceroldo clone verificou-sequência. Adicionar 750 ul da cultura durante a noite a 250 ul de 60% de glicerol num tubo de crio com tampa de rosca. </li><li> Armazenar o estoque de glicerol a -80 ° C por tempo indeterminado. O restante da cultura durante a noite pode ser utilizada como uma fonte para a expressão fagemídeo sRNA no passo 2. </li></ol></li></ol> 2. Produção e Colheita de Stocks fagemídeo M13-embalados <ol><li> Prepara-se uma cultura de 5 ml de E. coli transportando a expressão fagemídeo sRNA. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. Nota: A expressão fagemídeo sRNA podem ser obtidas por meio da clonagem de novo, conforme descrito no passo 1.1.5, ou modificada a partir de um fagomídeo existente e colhido no passo 1.2.16. </li><li> Do mesmo modo preparar uma cultura de 5 ml de E. coli portadora do plasmídeo ajudante M13KO7. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meios selectivos LB. </li><li> Extrair e purificar a expressio sRNAN fagemídeo e plasmídeo auxiliar utilizando um estojo de extracção de ADN ou método semelhante 12. </li><li> Cotransformar adquiridos ou preparados 13 de E. coli quimicamente competentes, com 1 ml de cada um dos sRNA fagemídeo expressão e plasmídeo ajudante. Selecionar para cotransformants por plaqueamento em agar LB com antibióticos seletivos para ambas as construções. </li><li> Prepara-se uma cultura de 10 ml de uma única colónia da estirpe de co-transformado em LB com os antibióticos selectivos. Incubar a 37 ° C com agitação durante 8-12 horas ou durante a noite. </li><li> Centrifugar a cultura a 3300 xg durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e filtra-se através de um filtro de 0,2 um. Cuidado: Em caso de derramamento de mídia, limpar a área com água sanitária diluída (0,5%) para destruir as partículas de fagos infecciosos. </li><li> Manter o filtrado fagemídeo embalados a 4 ° C. Nota: As amostras podem ser mantidas durante dias a semanas sem perda de actividade. </li></ol> 3. Preparação de células F + alvo para Silenciando <ol><li> Determinar se as células a serem direcionados para silenciar expressar a pilus F 14. Se o pilus F já está presente, vá para a etapa 4. Nota: cepas comuns laboratoriais de E. coli são anotados como F + ou M &#39;para indicar a presença do pilus F no seu genoma ou num plasmídeo. </li><li> Obter uma estirpe F + de E. coli, tais como TOP10F &#39;. Nota: Assegurar que a estirpe alvo transporta um marcador de resistência única, a fim de ser separado do doador de F-plasmídeo após conjugação. </li><li> Para introduzir F pilus por conjugação com uma estirpe F +, preparar 5 ml culturas de ambos a tensão alvo e doadores F-plasmídeo 14. Deixar crescer as células durante a noite a 37 ° C com agitação, em meio LB com antibióticos apropriados. </li><li> No dia seguinte, dilui-se ambas as estirpes 1: 100 em 5 ml de LB selectiva e continuar a cultura a 37 ° C com agitação. </li><li> Determinar a fase de crescimento das células medindo a optical densidade da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15. </li><li> Prepare reacções 3 Conjugação em tubos de microcentrífuga de: 0,5 ml de F-plasmídeo estirpe dadora + 0,5 ml de destino, 0,5 ml de F-plasmídeo dador + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo) e 0,5 ml de estirpe alvo + 0,5 ml de meio LB (controlo negativo). Permitir que a conjugação prosseguir durante 2 horas a 37 ° C com agitação. </li><li> Placa de 100 ul de cada reacção de conjugação em agar selectivo LB com antibióticos específicos para o F-plasmídico (tipicamente tetraciclina) e estirpe alvo. Placa das reacções de controlo negativo para confirmar que nenhum doador ou estirpe receptora expressar ambas as resistências a antibióticos. </li></ol> 4. A infecção com fagemídeos embalado para Silenciando <ol><li> Inocular uma colónia única de células alvo F + em uma cultura de 5 ml de LB Medium com os antibióticos apropriados. Incubar durante a noite a 37 ° C com agitação. </li><li> No dia seguinte, diluir as células alvo M + 1: 100 em 5 ml de meio selectivo LB e continuar a cultura a 37 ° C com agitação. </li><li> Determinar a fase de crescimento das células medindo a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro de bancada. Cultura das células durante cerca de 2 horas até um OD 600 de 0,3 é atingido, o que indica um crescimento de fase log 15. Nota: Expressão do pilus e infecção F eficiência é mais elevada na fase log. </li><li> Adicionar os fagemídeos M13-embalados (do passo 2.6) para as células alvo numa proporção em volume de 1: 100 para alcançar infecção quase 99% da população alvo. Permitir que a infecção prosseguir a 37 ° C com agitação durante 30-60 min. </li><li> Ensaio, o fenótipo sRNA silenciador de acordo com o método de escolha. Nota: Para uma proteína alvo fluorescente, o efeito de silenciamento pode ser quantificadadirectamente por fluorometria 10. Como alternativa, ensaios fenotípicos pode ser usado para observar as consequências fenotípicas de gene knockdown 8. </li><li> Prepare um estoque de glicerol para a sRNA expressando acolhimento fagemídeo seguindo os passos 1.2.14-1.2.16. Nota: o fagemídeo irá propagar na estirpe hospedeira indefinidamente e pode ser mantida com antibiótico semelhante a um plasmídeo convencional. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O presente método conseguido redução de 80% nos níveis de fluorescência mKate comparação com controles não direcionados. Isto está de acordo com outros métodos de knockdown de ARN, onde silencioso completo não é observada e eficiência 50-90% é típico 16,17. Ao nível fenotípica, knockdowns alvo-CAT foram capazes de atenuar significativamente a resistência ao cloranfenicol, e eliminá-lo sob algumas condições. O fenótipo knockdown foi detectável ao nível da população depois de apenas algumas horas após a infecção (Figura 3B). Isto ilustra uma característica importante de entrega à base de fagos: uma frequência alta knockdown pode ser obtida directamente na cultura em lotes, sem modificação genética antes. Ao contrário as modificações genéticas convencionais utilizando transformação ou plasmídeo de integração genómico, infecção fágica não exige que uma população ser re-cultivadas a partir de uma única colónia isolada. Isto permite que os efeitos da infecção por fagos para ser Explored em populações com dinâmicas espaciais complexos 11, com estruturas espaciais pré-existentes, como biofilmes 18, ou em populações naturais geneticamente mistos 19. Um passo crítico neste método é a produção de fagemídeo embalados em título elevado. A carga metabólica associada com a produção de partículas de fago pode conduzir a altas taxas de mutação ou perda do plasmídeo na estirpe de produção fagemídeo. Recomenda-se que a estirpe de produção fagemídeo ser cultivado directamente a partir de uma única colónia co-transformadas e não refrigerados, congelados ou sub-cultivadas antes da colheita de fagos. A baixa eficiência de co-transformação também pode ser observada quando se introduz o plasmídeo fagemídeo e ajudante para E. coli simultaneamente. Neste caso, as eficiências mais elevadas podem ser obtidos por transformação do plasmídeo auxiliar em primeiro lugar, em seguida, a preparação de células competentes que ostentam o plasmídeo ajudante para a subsequente transformação com o fagemídeo. Phainfecção gemid ou expressão sRNA também impõe uma carga metabólica detectável nas células alvo, e pode resultar em alguma perturbação fenotípica. Por exemplo, foi observada uma redução na fluorescência mKate2 mesmo quando as células foram infectadas com um fagemídeo segmentação CAT (Figura 3). A infecção com o M13 não é pensado para desencadear respostas de estresse sistêmico em E. coli 20, mas pode alterar os padrões de transcrição indiretamente. Alternativamente, os marcadores de resistência à ampicilina ou GFP incluídos no fagemídeo pode concorrer para recursos celulares, reduzindo a expressão e crescimento mKate2 9. Finalmente, a cassete de sRNA si pode alterar globalmente perfis de expressão de gene por titulação da proteína HFQ, ou por meio de silenciamento de ARNm para fora do alvo. Efeitos alvo Off são comuns em in vivo RNAi visando 21-23, mas eles ainda têm de ser sistematicamente investigada para este sistema. Uma limitação deste método é que a efi infecçãoeficiência é inferior a 100%, permitindo que algumas bactérias não infectadas para persistir na população. Os resultados deste trabalho e trabalho anterior 10 sugerem que as células não infectadas representam 1-10% da população final, e são responsáveis ​​pela maioria dos fenótipos nonsilenced observados. Uma variedade de rotas para a M13-resistência são conhecidos, com a perda mutacional sendo mais comum da expressão de pelos 24. À luz destas limitações, os controles devem ser utilizadas para confirmar a altas taxas de infecção e eficiência knockdown. Outra limitação potencial para algumas aplicações é a transferência ocasional de contaminação do fago auxiliar. Embora M13K07 contém um sinal de empacotamento mutado, pode ser empacotado em cápside do fago em baixa frequência e transferido para populações infectadas, o que resulta em células competentes para a produção de fagos e a propagação continuada de fago além do evento infecção inicial 25. Modificações para o fago auxiliar têm se mostrado eficazesa redução de embalagens não específica, embora às vezes com o custo de produção de fagos reduzida 26. Bacteriófago engenharia tornaram-se uma ferramenta indispensável para E. biologia sintética coli, permitindo a entrega rápida de novos genes de uma população crescente. Um trabalho recente produziu circuitos de comunicação intercelular 11 ou expressa fatores de transcrição para reprimir a resistência aos antibióticos vias 27. O protocolo aqui apresentado acrescenta a uma crescente coleção de ferramentas que permitem o controle da fisiologia bacteriana através de RNAs programados. Nucleases CRISPR-cas, quando sofre mutação para eliminar a actividade nuclease, foram mostrados para reprimir a transcrição de genes alvos guiados por RNA 17,28. Em contraste, sRNA silenciamento funciona ao nível da tradução e não requer a expressão de proteína exógena. biotecnologias da próxima geração podem se unir controle da transcrição e tradução, com entrega mediada por fago para programar pheno complexotipos em tempo real.

knockdowns de genes mediada por ARN de proceder em duas fases. Em primeiro lugar, uma molécula de RNA é introduzido a uma linha de célula ou organismo de estudo. Em segundo lugar, as proteínas de ligação a ARN endógenos facilitar o reconhecimento de ARN-alvo e produzir o efeito de silenciamento. Todas as tecnologias de ARN knockdown beneficiar da natureza personalizada de sRNAs sintéticas, que podem ser facilmente produzidos a corresponder a um alvo específico de interesse. No entanto, os detalhes moleculares de captação de ARN e silenciamento variam amplamente entre sistema modelo, restringindo onde e como knockdowns ARN pode ser aplicada. Em nemátodos, ARN de cadeia dupla moléculas (dsRNA) pode ser introduzido directamente nos meios de alimentação ou por os vermes com uma população de ARNcd-expressando E. células de E. coli 1,2. Em Drosophila, RNAi pode ser conseguida por microinjecção de embriões com três ARNcd, ou aplicada em linhas de células por simples adição de ARNdc para o meio de cultura quatro. Em linhas celulares de mamífero,sintéticos pequenos ARN interferentes (siRNAs) podem ser entregues a células vivas por electroporação 1,2,5, empacotado em lipossomas 3,6, ou expressas a partir de vectores de DNA do plasmídeo 4,7. Uma vez que as espécies de ARN atinge o citossol, a via de RNAi baseia-se no complexo RISC para processar ARNcd, anti-sentido de facilitar o reconhecimento do alvo, e catalisar a repressão de translação, a degradação de ARNm, ou a formação de heterocromatina, dependendo do hospedeiro. Devido a esses requisitos, clássica RNAi pode ser realizada apenas em organismos que ocupam RNA exógeno de forma eficiente e expressam RISC ou uma atividade RISC-like. Notavelmente, isto exclui o modelo bactéria E. coli, que não possui a via de RNAi. No entanto, os recentes avanços na biologia sintética fornecer as ferramentas para resolver tanto o problema da entrega eo problema silenciamento. Neste protocolo, as construções Srna estão expressos em E. coli a partir de um vector de ADN entregue a Living células utilizando o sistema de fagemídeo / ajudante M13. Um fagemideo é qualquer plasmídeo com uma origem F1 derivadas de fagos de replicação. Um plasmídeo auxiliar, neste caso M13KO, carrega toda a maquinaria necessária para a produção de partículas virais, mas não em si é competente para replicação e empacotamento. Quando um fagemídeo e o plasmídeo ajudante são co-transformada, o fagemídeo sozinho é replicada na origem f1, embalados e segregada. O fagemídeo vectorizado é então competente para infectar E. vivo coli através do pilus F. Neste sistema, o efeito silenciador é produzido por cassetes srna costume combinando uma sequência de suporte com uma sequência de ligação ao alvo. A sequência de ligação ao alvo é de 24 pares de bases anti-sentido a um ARNm alvo, normalmente no local de ligação ao ribossoma (RBS). A sequência de suporte, desenvolvido pela Na e colegas 8, contém um motivo de ligação HFQ extraído de MICC, um pequeno ARN de regulação endógeno para E. coli. A proteína HFQ estimula ARN-ARN binding e degradação do mRNA, que serve um papel neste sistema semelhante ao RISC em RNAi. A Figura 1 representa um esquema completo para knockdowns srna mediada por fago, incluindo a estrutura sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento. Como um método para modular a expressão do gene em E. coli, sRNA silenciamento é simples, rápida e versátil. A E. alvo coli não é sobrecarregado além de propagar o fagemídeo e expressando a sRNA. Isto pode ser relevante no contexto da biologia sintética ou pesquisa básica em que a expressão de construções heterólogas maiores podem forçar os recursos celulares 9. Os fagemídeos com novos alvos pode ser produzido com uma única PCR e colhido um dia depois da transformação fagemídeo. Finalmente, quase todo o mRNA podem ser alvo. A cassete de regulação sRNA (num plasmídeo padrão) foi mostrado para trabalhar sobre uma variedade de alvos no metabolismo com níveis de repressão típicos&gt; 90% 8. 10. Em primeiro lugar, um fagomídeo empacotado é introduzido a uma cultura em lotes de E. células de E. coli e utilizada para silenciar a expressão da proteína fluorescente mKate2. alterações de fluorescência subsequentes são monitorados em tempo real. Em segundo lugar, derrubar o gene CAT é mostrado para reduzir a resistência ao cloranfenicol fenotípica em placas de agar. Em ambos os casos, o próprio fagemídeo transporta um marcador GFP, permitindo que a taxa de infecção a ser medida independentemente da eficiência knockdown.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="637">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DpnI Enzyme</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq 2x Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0270L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOP10F&#39; Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C3030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3022-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9393-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60615-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

knockdowns mediada por RNA são amplamente utilizados para controlar a expressão do gene. Esta família de técnicas versátil faz uso de ARN curto (sRNA) que pode ser sintetizado com qualquer sequência e concebido para complementar a qualquer gene alvo para silenciamento. Porque sRNA construções podem ser introduzidas para muitos tipos de células, directa ou usando uma variedade de vectores, a expressão do gene pode ser reprimida nas células vivas sem modificação genética trabalhoso. O ARN mais comum tecnologia knockdown, a interferência de ARN (ARNi), faz uso da sequência de reconhecimento complexo de silenciamento (RISC) induzido por ARN para mediar endógena e a clivagem do ARNm alvo. Aplicações desta técnica são, por conseguinte, limitadas a organismos que expressam RISC, principalmente eucariotas. Recentemente, uma nova geração de ARN biotechnologists desenvolveram mecanismos alternativos para controlar a expressão do gene através de ARN, e assim tornada possível knockdowns de genes mediada por RNA de bactérias. Aqui nós descrevemos um método para silenciar genes expresSion em E. coli que funcionalmente se assemelha RNAi. Neste sistema, um fagomídeo sintético é desenhado para expressar sRNA, que podem concebidos para ter como alvo qualquer sequência. A construção de expressão é entregue a uma população de E. células de E. coli com o fago M13 não lítico, após o que é capaz de se replicar de forma estável como um plasmídeo. Reconhecimento de anti-sentido e silenciamento do ARNm alvo é mediada pela proteína HFQ, endógena para E. coli. Este protocolo inclui métodos para a concepção da sRNA anti-sentido, a construção do vector fagemídeo, o empacotamento do fagemídeo em bacteriófago M13, a preparação de uma população de células vivas para a infecção, e realizando a infecção em si. A proteína fluorescente mKate2 eo cloranfenicol acetiltransferase gene de resistência a antibiótico (CAT) são direcionados para gerar dados representativos e quantificar a eficácia knockdown.

Silenciamento de mKate2 fluorescência em meio líquido A Figura 1 representa o esquema para knockdowns sRNA mediadas descritos neste trabalho, incluindo a concepção sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento. Seguindo o protocolo 1.2, a cassete de silenciamento sRNA do plasmídeo pAB.001 foi alterada para segmentar mKate. A cassete sRNA foi sintetizado e clonado em fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP, um presente de Monica Ortiz e Drew Endy 11. Este fagemídeo transporta marcadores de expressão GFP e resistência à canamicina, permitindo que infecções de sucesso para ser rastreado. stocks fagemï¿½eos embalados foram preparados seguindo o protocolo 2. Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, marcador mKate2 cromossomicamente integrado foi preparado para a infecção do fago por conjugação<html> com uma estirpe de plasmídeo dador F seguinte protocolo de 3. As células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Após a infecção fagemídeo, 200 ul culturas foram transferidas para um leitor de fluorescência de placas e a fluorescência foi monitorizada continuamente durante 24 h. A Figura 3 mostra o efeito de silenciamento sRNA mediada por expressão em mKate2. A estirpe infectada com um fagemídeo anti-mKate2 não mostrou fluorescência mKate2 detectável sobre o fundo. Em contraste, esta estirpe expressaram o marcador GFP, indicando a absorção bem sucedida de fagemídeo. As células de controlo não infectadas produziu mKate2 fluorescência mas não GFP. Um controlo adicional, em que o domínio de direccionamento anti-mKate2 foi substituído com uma sequência de direccionamento CAT, não teve efeito sobre mKate2 fluorescência. Silenciamento de resistência ao cloranfenicol em placas de agar conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Seguindo o protocolo 1.1, uma cassete silenciar sRNA foi produzido para atingir CAT Um derivado de E. coli K12 MG1655 carregando uma constitutivamente expresso, cromossomicamente marcador CAT integrada estava preparado. infecção fágica por conjugação com uma estirpe dadora F-plasmídeo seguinte protocolo de 3. as células foram cultivadas até à fase logarítmica média e o fagemídeo introduzida seguindo o protocolo 4. Depois de 1 hora de incubação a 37 ° C, as células infectadas foram diluídas em série e plaqueadas a uma gama de concentrações de cloranfenicol. as placas foram incubadas durante a noite, e a proporção de células resistentes a cloranfenicol cada concentração foi determinada através da contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) no dia seguinte. A Figura 4 mostra o efeito de silenciamento mediado sRNA no fenótipo de resistência a cloranfenicol. As células não infectadas ou células infectadas com o fagemídeo de segmentação mKate2, eram resistentes acloranfenicol em todas as concentrações testadas. Em contraste, as células infectadas com o fagemídeo de segmentação CAT mostraram redução da sobrevivência em baixas concentrações de cloranfenicol, e cerca de 99% de morte em concentrações mais elevadas. A adição de ampicilina, para selecionar apenas as bactérias que levam o fagemídeo, reduziu a sobrevivência cloranfenicol a níveis indetectáveis. Isto é consistente com trabalhos anteriores mostrando que a fuga de infecção fágica é uma via comum para escapar silenciamento 10. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figura 1: silenciamento de genes em E. coli com sRNA cassetes de expressão entregue por fago M13 A cassete sRNA é composto por 4 módulos:. o promotor Pr (um promotor constitutivo obtido a partir do bacteriófago lambda), um domínio de direccionamento 24 pb, um domínio de ligação HFQ extraído de MICC e um terminador da transcrição de 8 </sup&gt;. A cassete é incorporado num fagemídeo tendo a origem de replicação e F1 de M13 empacotado no capsídeo M13 utilizando o fago auxiliar M13KO7. Fagomídeos acondicionados são capazes de infectar E. coli que expressam o pilus F, onde a expressão começa sRNA. O sRNA recruta então a proteína HFQ (representado em vermelho) e liga-se um alvo mRNA antisense perto do local de ligação ao ribossoma, resultando em repressão translacional e degradação do mRNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figura 2:. Desenho de primers e Site-Directed Mutagenesis da Site de destino sRNA Dois iniciadores foram concebidos com homologia parcial para uma cassete de sRNA existente. O iniciador directo contém 20 pb homólogo ao promotor do fotorreceptor na extremidade 5 &#39;, seguido pela24 pb representando a nova sequência de orientação, em seguida 18 pb homólogo ao domínio de ligação HFQ na extremidade 3 &#39;. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo, com as regiões de homologia com a cassete sRNA existente que flanqueia o complemento inverso da sequência de orientação novo. Sequências iniciadoras exactos são dadas na Tabela 3. Reacções separadas de PCR em uma única escorva com a frente e os iniciadores reversos produzir linear, ADN de cadeia simples com a sequência modificada desejada. Recozimento da frente e verso, produtos de reacção, após clean-up, conforme descrito no protocolo, resulta em DNA de cadeia dupla plasmídeo tendo a cassete sRNA modificado desejado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figura 3: Knockdown de um repórter integrado no cromossoma mKate2 fluorescente. E. coli MG1655 K12 expressar mKate2 foram ou não tratados (linhas vermelhas e bares) de esquerda, infectado com um fagemídeo anti-mKate2 (linhas verdes e bares), ou infectadas com um controle fagemídeo segmentação CAT (linhas azul e bares). (A) não tratada E. coli cresceu para densidades de saturação mais alta, indicando um custo metabólico à infecção fago. As linhas pontilhadas indicam os desvios-padrão de 3 repetições. (B) O sinal mKate2 foi reduzida para níveis próximos dos de fundo no anti-mKate2 tratada tensão, mas não em cepas de controle. Fluorescência (C) GFP, também transportado pelo fagemídeo, foi detectada apenas em controles de fagemídeo-tratada. (D, E) leituras de fluorescência final após 24 h de crescimento foram normalizados para OD. sinal de GFP, indicando infecção fagemídeo, estava ausente em controles não tratados, mas também substancialmente reduzida na sequência anti-CAT ptratamento hagemid. Isso pode indicar efeitos fora do alvo do fagemídeo. O sinal mKate2 foi reduzido por tratamento fagemídeo anti-mKate2 em comparação com controlos não tratados. O fagemídeo controle alvejado-CAT não mostrou nenhum efeito sobre mKate2 fluorescência. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown do CAT restaura a sensibilidade cloranfenicol a uma população geneticamente resistente E.. coli K12 MG1655 que expressa um gene de CAT integrado cromossomicamente foram deixados sem tratamento (barras vermelhas), tratou-se com um fagemídeo controlo segmentação mKate2 (barras verdes), ou tratados com um fagemídeo que expressa um anticorpo anti-CAT sRNA (barras azuis). Depois de 1 hr de infecção, a viabilidade na formiga indicadoibiotics foi avaliada por diluições em série e plaqueamento. Estirpes tratados com anti-CAT fagemídeo foram mortos de forma significativa (&gt; 90%) por cloranfenicol em concentrações mais elevadas, enquanto que os tratamentos de controlo não foram afectadas. A adição de ampicilina para as placas de cultura selecciona positivamente pela infecção fagemídeo e elimina as células não infectadas. Sob estas condições, não há colónias resistentes ao cloranfenicol foram observadas após o tratamento anti-CAT. Isto indica que a maioria dos sobreviventes representar uma falha de infecção, em vez de uma falha de silenciamento. As barras de erro representam o desvio padrão de 3 repetições. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sequência alvo CAT </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> sequência GUIA DE CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Um exemplo TARGET e GUIA Sequence para o CAT Gene Nota a relação complemento reverso. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> promotor pR </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> GUIA sequência </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> domínio de ligação HFQ </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / terminador TE </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tabela 2:. componentes de seqüência da cassete sRNA Cada sequência é escrito 5&#39;-3 &#39;. A cassete completa é a concatenação destes 4 elementos em ordem e compreende 292 pb. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adiante Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> Primer reverso </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Iniciador desenho nos elementos de guia existentes Alter O iniciador de sentido directo inclui as últimas 20 pb do promotor PR, a nova sequência de orientação, e os primeiros 18 pb do domínio de ligação ao HFQ.. A sequência alvo é o complemento inverso da sequência exacta do GUIA. O iniciador reverso é o complemento reverso exacto do iniciador de sentido directo. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> plasmídico molde </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 uM Primer </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> Polimerase de alta fidelidade (2 U / ul) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Tampão de PCR 5x </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> O volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Sugestão Condições de Single-Primer mutagênicos PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> A desnaturação inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 98 ° C </td><td> 10 seg </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 seg </td></tr><tr><td> extensão final </td><td> 72 ° C </td><td> 300 seg </td></tr><tr><td> Armazenamento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 5: Sugestão de Termociclador Protocolo para a Single-Primer mutagênicos PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> ADN molde </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 10 uM para a frente Primer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Iniciador inverso </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Taq Master Mix 2X </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> wate livre de nucleaser </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> O volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 6: Sugestão de condições para a sequência de Verificação PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> A desnaturação inicial </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> extensão final </td><td> 68 ° C </td><td> 300 seg </td></tr><tr><td> Armazenamento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 7: Sugestão de Termociclador Proprotocolo para a Sequência de Verificação PCR.

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K visualizações.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Vídeo: Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...