Os autores gostariam de agradecer a colaboração e as contribuições financeiras da seguinte agência de financiamento da investigação: Alberta gado e de carne Agency Ltd., CRC carne de porco, carne de porco Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Companhia e NSERC CRSNG.

De acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações e com a aprovação da Política animal Faculdade e Conselho de Acção Social - Pecuária da Universidade de Alberta, porcas prenhes foram sacrificados por funcionários treinados aproximadamente no dia 30 de gestação e os embriões foram coletados. Use luvas de exame em todos os momentos durante os procedimentos. 1. Colheita e armazenamento Amostra <ol><li> Eutanásia porca usando dardo cativo seguido de sangria. Usar luvas de exame para recolher os aparelhos reprodutivos e embriões de cada porca sacrificados. Nota: cobrança rápida de amostras e embriões de transferência para secar gelo ou azoto líquido resultará em tecidos de maior qualidade para outras obras molecular, tais como microarray e qPCR. </li><li> Dissecar o útero e delicadamente separar todos os embriões dentro de suas membranas da placenta extraembryonic da parede uterina subjacente 21. Certifique-se de que não há contaminação dos tecidos maternal. </li><li> Récomprimento do cabo e o peso de todos os embriões viáveis ​​antes da congelação. </li><li> Recolha cada um dos embriões e imediatamente envolvê-lo em uma folha de alumínio antes pressão congelamento com nitrogênio líquido. </li><li> Transferir os embriões congelados de nitrogênio líquido diretamente para a -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Os embriões Moagem <ol><li> Rotular todos os tubos de amostra (15 ml), com a identificação da amostra necessária para o número de amostras a serem analisadas. </li><li> Encha o recipiente térmico com gelo seco para metade e inserir o tubo de amostra pré-rotulado no gelo seco. </li><li> Usar luvas de inverno com um outro par de luvas de exame em cima para transferir os almofarizes e pilões pré-refrigerados de -80 ° C freezer para secar recipiente de gelo. </li><li> Coloque o embrião congelado dentro da argamassa sobre o gelo seco. </li><li> Pour azoto líquido adequado para cobrir o embrião e moê-lo com o pilão em um pó fino. </li><li> Transferir o pó embrião para um tubo de amostra pré-marcado com um microspatula (Figura 1) e colocar o tubo num congelador de -80 ° C. </li><li> Use uma argamassa pré-refrigerado limpa e pilão para cada embrião e alterar as luvas de exame após a moagem cada embrião para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. </li></ol> 3. ADN genómico de preparação utilizando modificação de sódio Hidróxido Método <ol><li> Etiqueta de todos os tubos de microcentrifugação (1,5 ml) necessárias para o número de amostras a serem analisadas. </li><li> Transferir os tubos de amostra contendo embrião em pó a partir do congelador -80 ° C para um recipiente com gelo seco antes de se iniciar. </li><li> Pipetar 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sódio) para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulados. </li><li> Ligar uma incubadora e de pré-aquecimento a 95 ° C. </li><li> Usar um palito para transferir a quantidade correcta de pó de embrião (cerca de 5-10 mg) (Figura 2) a partir do tubo de amostra para um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo a solução de NaOH 50 mM. </li><li> puxe up o mesmo palito lentamente para visualizar o lisado de ADN como um pegajoso, pegajosos, substância transparente semelhante branco (Figura 3). </li><li> Transferir os tubos de microcentrífuga com lisado de ADN para a incubadora pré-aquecido a 95 ° C durante cinco minutos. Transferir imediatamente o tubo a uma caixa de isopor cheia de gelo. </li><li> Adicionar 20 ul de Tris-HCl 1 directamente para dentro do tubo de microcentrífuga e misturá-lo batendo suavemente no tubo. Usar um papel de pH para assegurar que o pH é cerca de 8,0 (Figura 4) antes da centrifugação. Nota: Ao lidar com um grande número de preparações de amostra, é aceitável para escolher aleatoriamente algumas amostras para verificar o pH. </li><li> Centrifuga-se o tubo com o lisado de ADN a 2.000 xg numa microcentrífuga durante dois minutos à temperatura ambiente para remover os restos de tecido não dissolvido. </li><li> Transferir 150 ul do sobrenadante claro topo para um novo tubo ou placas de 96 poços. Nota: O lisado de ADN claro está pronto a ser usado como um modelo em computadorR reacção e é estável a 4 ° C durante duas semanas, ou pode ser mantida a -20 ° C durante um ano. </li></ol> Iniciadores de PCR específicos de sexo 4. Projeto <ol><li> Obter números de acesso para o sexo Porcina região determinante Y (SRY) (NM_214452.3) e e genes ligados ao X proteína dedo de zinco (ZFX) (XM_005673501.1) a partir do site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /. </li><li> Copiar e colar esses números de acesso NCBI para uma ferramenta de desenho de primers online. Nota: A melhor informação iniciadores incluindo o comprimento, Tm e% de GC, bem como o tamanho do produto de PCR (pb) será gerado no ecrã do computador (Figura 5). </li><li> Validar a especificidade destes iniciadores, utilizando o programa de nucleótidos BLAST (Blastn) contra a base de dados genómico porcino corrente 104 para garantir que estas sequências são apenas localizado no cromossoma X e Y para SRY e ZFX respectivamente (Figura 6). </li></ol> 5. Genomic DNA PCR Diretamente de DNA Lysates <ol><li> Usoapenas 1 ul de lisado de ADN como um molde para uma reacção de PCR de 15 uL. Nota: Um método de rastreio de alto rendimento para placas de 96 poços de PCR pode ser realizada de maneira semelhante, utilizando uma pipeta de canais múltiplos. </li><li> Faça o seguinte apenas para a primeira PCR: preparar um tubo de PCR para o controlo negativo sem modelo e dois tubos adicionais para os controlos positivos pela adição de 1 ul (0,5 ng) de ADN genómico porcino conhecida sexo obtidos comercialmente. Mais tarde, incluem uma amostra a partir da última análise sexagem sucesso como um controlo positivo e executado em conjunto com a nova reacção de PCR para a determinação do sexo. </li><li> Usar qualquer mistura pronta enzima PCR HotStart e preparar uma mistura principal por primers adição e nucleases água livre, dependendo do número total de reações de PCR. Adicionar 1 ml de lisado de ADN para um tubo de PCR pré-existente com 14 ul da mistura principal de PCR. Adicionar iniciadores de tal modo que a concentração final dos iniciadores de dois genes específicas do sexo é de 0,3 uM no total de 15 ul de PCR reaction. </li><li> Defina-se o seguinte programa de PCR num termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uma com um passo de 20 seg de fusão 98 ° C, seguido por um passo de emparelhamento de 15 segundos a 65 ° C, seguido por um passo de alongamento de 15 seg a 72 ° C. Num passo final, incubar as reacções durante 1 min a 72 ° C e continuar a incubar a 4 ° C até à retirada do tubo de PCR por electroforese em gel de verificação para determinar o sexo. Nota: As condições de PCR e de optimização são de acordo com o manual do kit de PCR mencionado na Tabela Materiais. </li><li> Adicionar a quantidade adequada de mancha de gel de DNA não-tóxico verde- SYBR fluorescente quando se prepara um 2% gel de agarose TBE. Nota: O brometo de etídio pode ser substituído por mancha fluorescente estufa, se ele não está disponível. </li><li> Adicionar 1,5 uL de corante de carga (10x) para o tubo de PCR e misturar bem por pipetagem do tampão de reacção de PCR para cima e para baixo. </li><li> Carga de 10 ul de amostra para o poço e run gel de agarose com ajustes de tensão adequadas (aparelho de gel pequena a 100 V, aparelho de gel de 96 poços a 150 V até que a banda de corante é executado a meio caminho através do gel). </li><li> Observar e ajustar as intensidades de bandas sob a configuração de luz fluorescente usando um scanner a laser e capturar uma imagem do gel. Nota: Imager gel comum pode ser substituído para o gel com brometo de etídio. </li><li> Determinar o sexo dos embriões de suíno através da identificação de embriões com uma banda como uma fêmea e duas bandas como um macho (Figura 7). </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+diet+and+other+factors+affecting+offspring+sex+ratio:+a+review.">Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review.</a> Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).</li><li>Gorecki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+ratio+in+litters+of+domestic+pigs+(Sus+scrofa+f.+domestica+Linnaeus,+1758).">Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758).</a> Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).</li><li>Chen, Z. Y., Dziuk, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29, 52-54 (2000).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+embryos.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 43, 610-614 (2007).</li><li>Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+different+dietary+energy+sources+during+folliculardevelopment+on+subsequent+fertility+of+cyclic+gilts.">Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts.</a> Animal. 8, 293-299 (2014).</li><li>Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+programming+of+postnatal+development+in+the+pig.">Prenatal programming of postnatal development in the pig.</a> Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A maioria dos protocolos existentes relacionadas com DNA embriões digitação sexo suína só são adequados para fase inicial estágio de pré-implantação 15,16. Nós temos desenvolvido com sucesso um protocolo adequado para triagem de embriões suínos durante o final de gestação. Baseado em estudos com estágios de desenvolvimento semelhantes de embriões provenientes de estudos anteriores 6,18, o presente protocolo é considerado mais seguro e de baixo custo. Este protocolo é também adequado para um grande número de amostras para tipagem sexo utilizando PCR, transferindo os lisados ​​de ADN em uma placa de 96 poços. O formato de placa permite rastreio de alto rendimento, permitindo que a transferência de 1 pi de lisado de ADN para a reacção de PCR, utilizando uma pipeta de canais múltiplos. No entanto, várias etapas envolvidas no procedimento deve ser feito com cuidado. A fim de realizar o método de lise de NaOH a 50 mM modificado de forma mais eficiente, o embrião individualmente congelado tem que ser aterrada em pó finousando um (-80 ° C) almofariz pré-arrefecido e um pilão. Evitar o derramamento de embrião em pó sobre o gelo seco, por raspagem suave e lentamente o pó para dentro do tubo de 15 ml, como mostrado na Figura 1. Alterando as luvas de exame depois de cada amostra é altamente recomendável para evitar pó sobre a luva de transferência para uma outra amostra do embrião. A quantidade adequada de pó do embrião a ser adicionado à solução de lise de NaOH a 50 mM modificado é mostrado na Figura 2B. Uma quantidade excessiva de pó embrião está apresentada na Figura 2A e deve ser evitado. Do mesmo modo, na Figura 2C, a quantidade de pó de embrião pode ser insuficiente para procedimentos jusante. Embora a pesagem do pó embrião para cada amostra é possível, não é prático quando a seleção do sexo do embrião em um estudo de larga escala envolvendo mais de cem embriões. A quantidade de DNA podem ser visivelmente verificada usando um palito para verificar o g pegajosaooey substância semelhante, como mostrado na Figura 3, se é duvidoso que a quantidade adequada de pó foi adicionado no passo anterior. Adicionando a quantidade certa de solução de neutralização é importante depois de lisar o pó embrião. A Figura 4 mostra a mudança de pH antes e após a adição de solução de neutralização. Esta etapa é importante ter a certeza de que o pH é ligeiramente alcalino (cerca de 8,0) e, por conseguinte, semelhante à maioria dos amortecedores de reacção de PCR. A especificidade dos iniciadores oligo é o elemento mais importante para a exactidão de sexagem do ADN durante a PCR. A especificidade dos iniciadores oligo pode ser confirmada através do programa Blastn do NCBI. Um único local irá ser detectado no cromossoma X, na região não codificante a 3 &#39;do gene ZFX para cada sequência iniciadora (Figura 6A) para o sexo feminino. Uma situação semelhante é detectado apenas no cromossoma Y na região de codificação do gene SRY (Figura 6B </forte&gt;) para os machos. Taxa de erro, devido à não identificação do sexo poderia ser muito baixa (&lt;1%), como mostrado na Tabela 1, quando todos os passos proceder com cuidado e correctamente. No entanto, em alguns casos raros, a contaminação cruzada entre os lisados ​​de ADN de duas amostras diferentes é possível e pode ser detectada por PCR, conforme indicado com uma estrela vermelha no gel (Figura 7). Este tipo de padrão de bandas na fêmea pode ser interpretado como a contaminação cruzada com uma amostra do sexo masculino. É improvável que o aparecimento de uma banda mais baixa é muito fraco devido a competição do iniciador para reagentes de PCR. Neste caso, o fragmento amplificado menor (400 pb) em relação ao gene SRY irá gerar mais produto de PCR mais rápido do que a banda mais alta correspondente ao gene ZFX. Neste protocolo, uma desvantagem é a determinação de contaminação cruzada de uma amostra com um macho fêmea. Pois nosso objetivo principal não é a quantificação do número de cópias de cada gene alvo, uma pequenaquantidade de pó a partir da amostra fêmea não seria fácil de visualizar no gel. O protocolo DNA sexagem apresentado aqui é o método mais rentável para identificar o sexo do embrião durante a gestação tardia e pode ser aplicada a outros grandes animais de pecuária como bovinos, caprinos e ovinos. Além disso, o método de sexagem de ADN semelhante foi aplicada em suínos relacionadas com a condição metabólica porcas 18. Outra investigação de pesquisa usando a sexagem de DNA poderia ser aplicado para estudar o mecanismo de imprinting genômico durante a programação pré-natal de desenvolvimento pós-natal no porco 22. Uma ampla gama de aplicações na pecuária usando sexagem de DNA PCR é possível, como programas de seleção de reprodução pré-sexo, e efeitos epigenéticos de nutrição e doenças infecciosas.

O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce 2. Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos 3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna 4, capacidade uterina 5, e estado metabólico da porca 6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui. Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa 7 ou as intensa fluorescência 8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão. O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos 10, e mais tarde nos ratos 11, 12 bovinos, búfalos, ovelhas 13 14 embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica 15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino 16 e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco. O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K 16 ou por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões 15 e usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio 6 ou kits baseados coluna caro 18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato 19 e 20 de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados ​​celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1184">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:203px;">KAPABiosystems</td>
			<td style="width:189px;">KR0370</td>
			<td style="width:463px;">other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:189px;">S33102</td>
			<td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Pig female and male genomic DNA</td>
			<td style="width:203px;">Zyagen</td>
			<td style="width:189px;">GP-160-F1 &#38; GP-160-M5</td>
			<td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Typhoon FLA 9500 laser scanner</td>
			<td style="width:203px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:189px;">28-9969-43</td>
			<td>other imaging system can be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Free Soft Nitrile Examination Gloves</td>
			<td style="width:203px;">WWR</td>
			<td>89038-270</td>
			<td>any other examination glove can be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Sodium hydroxide, solid&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher</td>
			<td style="width:189px;">BP 359 -212</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">0030 108.051</td>
			<td>heat resistant</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">ThermoStat plus</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">22670204</td>
			<td>Use as a incubator for 95C, don&#39;t need to use the heater</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Toothpick</td>
			<td>Bunzl Plc</td>
			<td style="width:189px;">75200815</td>
			<td style="width:463px;">Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Microcentrifuge 5417R/5417C</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">22621807</td>
			<td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microspatula</td>
			<td style="width:203px;">Fisher</td>
			<td style="width:189px;">SDI28540115</td>
			<td>Autoclaved before use each time.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

A investigação sobre a programação pré-natal no porco mostrou que o sexo do embrião ou feto em desenvolvimento pode influenciar o resultado do desenvolvimento. Portanto, a capacidade de determinar o sexo de um embrião é necessário em muitas experiências particularmente em relação ao desenvolvimento precoce. O presente protocolo demonstra uma preparação de baixo custo, rápida e não-tóxico de ADN genómico de porco para uso com a PCR. Dia 30 embriões devem ser humanamente recolhido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de animal Institucional e Comissões de bem-estar para o presente protocolo. A preparação de todo o embrião para esta técnica sexagem baseado na PCR envolve simplesmente moer o embrião congelado até um pó fino usando um almofariz pré-arrefecido e um pilão. ADN por PCR qualidade é libertado a partir de uma pequena quantidade de pó de embriões através da aplicação de uma incubação a quente em um reagente de lise alcalina. Em seguida, a solução de ADN é misturado com tampão de neutralização e utilizado directamente para PCR. Dois pares de iniciadores são gerados para detecdeterminado sexo t determinação região do cromossoma Y (SRY) e região ZFX do cromossoma X com alta precisão e especificidade. O mesmo protocolo pode ser aplicado a outros embriões alongados (dia 10 ao dia 14) anteriores ao Dia 30. Além disso, este protocolo pode ser realizada com placas 96-brotaram quando o rastreio de um grande número de embriões, tornando viável para automatização e de alta digitação sexo rendimento.

Um resultado representativo de determinação do sexo de 345 lisados ​​de ADN de rastreio por PCR é mostrado na Figura 7 e sumariados na Tabela 1. Como pode ser visto na Figura 7, a temperatura de iniciadores de recozimento a 65 ° C representa a condição óptima neste protocolo de PCR gerando intensidade semelhante e tamanhos amplicon predicado (Figura 5) entre as amostras diferentes. Dois produtos amplificados de SRY (400 pb) e ZFX (506 pb) são mostrados na imagem em gel (Figura 7). embriões do sexo masculino apresentaram dois fragmentos de ADN com o tamanho correcto da parte superior (400 pb) e (506 pb) bandas mais baixas. A intensidade destas duas bandas foi mostrada para ser igual na maioria dos indivíduos do sexo masculino. Todos os embriões fêmea mostrou apenas um único fragmento de ADN correspondente ao gene localizado no ZFXX-cromossoma. Os lisados ​​de ADN obtidas a partir da NaOH a 50 mM modificado pode ser utilizado directamente para PCR com uma elevada taxa de sucesso e precisão. lisados ​​de ADN não mostrou qualquer inibição reação de PCR após o rastreio 345 embriões. Apenas três indivíduos não foram sexados e a percentagem de embriões do sexo feminino foi ligeiramente maior do que os homens (Tabela 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig1.jpg" /> Figura 1:. Transferência de Embriões Pó transferência de embriões em pó para um tubo de 15 ml. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig2.jpg" /> Figura 2: Coleta e Transferência de Embriões em pó com um palito (A) Uma quantidade excessiva de aderência de pó embrião para o palito.. (B) quantidade correta deembrião pó aderindo ao palito para ser transferido para a solução de reagente de lise alcalina. (C) Uma quantidade insuficiente de pó embrião aderindo ao palito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig3.jpg" /> Figura 3:. Técnica ADN visualização Lentamente puxar para cima o palito, depois de adicionar o pó de embriões, para determinar se o DNA foi dissolvido embrião como uma substância branca pegajosa pegajosa transparente semelhante. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig4.jpg" /> Figura 4:. Confirmação de pH (A) pH da solução de hidróxido de sódio (reagente de lise alcalina) é 12,0. (B) Depois de adição de tampão de neutralização para o tampão de lise, indicação de cor de papel de pH é verde e o pH deve ser de cerca de 8,0. Figura 5:.. Nomes específicos de Sex Informação Primer sequências, as sequências e o comprimento amplicon obtidos a partir da ferramenta de desenho de primers <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53301/53301fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig6.jpg" /> Figura 6: Mapeamento de Suínos primers específicos de sexo no cromossomo X e Y. (A) Localização da frente e invertidos primers específicos no gene ZFX. (B) Localização da frente e invertidos primers específicos sobre o gene SRY. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53301/53301fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53301/53301fig7.jpg" /> Figura 7:. Amplificação por PCR de Suínos Genes sexo-específicos a partir do dia 30 embriões 2% gel TBE agarose corado com corante gel DNA SYBR com os controlos positivos conhecidos são indicados com símbolos masculinos e femininos. Duas bandas indicadas como machos e uma única banda como fêmeas. estrela vermelho indicou a possível contaminação da amostra no poço com o aparecimento de uma banda muito ténue menor (400 pb) em comparação com banda superior (506 pb) do produto de PCR causada por iniciadores específicos SRY-Y. Seta vermelha indica a nenhum modelo de controle PCR negativo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53301/53301fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> sexagem PCR </td><td> Contagem de embrião </td><td><strong&gt;% </td></tr><tr><td> ♀ </td><td> 185 </td><td> 53,60% </td></tr><tr><td> ♂ </td><td> 157 </td><td> 45.50% </td></tr><tr><td> Desconhecido </td><td> 3 </td><td> 0,90% </td></tr><tr><td> Total </td><td> 345 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Percentagem de Mulher, Homem e Desconhecido após PCR Sexagem entre 345 Dia 30 embriões.

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K visualizações.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

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Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Biologia do Desenvolvimento

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored until recently. In this article, we illustrate the method for preparing a methyl green aqueous stock solution, that when diluted can be used as a very convenient fluorescent nuclear label for fixed cells and tissues. Easy procedures to label whole zebrafish and chick embryos are detailed, and examples of images obtained shown. Methyl green is maximally excited by red light, at 633 nm, and emits with a relatively sharp spectrum that peaks at 677 nm. It is very inexpensive, non-toxic, highly stable in solution and very resistant to photobleaching when bound to DNA. Its red emission allows for unaltered high resolution scanning confocal imaging of nuclei in thick specimens. Finally, this methyl green staining protocol is compatible with other cell staining procedures, such as antibody labeling, or actin filaments labeling with fluorophore-conjugated phalloidin.

A method for fluorescent staining of fixed biological material with the specific DNA label methyl green is described. Methyl green is used in a diluted aqueous solution and is very resistant to photobleaching. Its far-red emission allows for deep specimen imaging, making it particularly adequate for whole embryos.

Aplicação do DNA-metil específico Stain Verde no Labeling fluorescentes de Embriões

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...