Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções EY019312 e EY021126 (VJK), EY002687 ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais na Universidade de Washington, e pela Research para prevenir a cegueira.

Todos os protocolos experimentais foram de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Estudos de Animais institucional na Universidade de Washington. 1. Preparação de perfusão e Porta-amostra <ol><li> Preparar a solução de perfusão para a retina fresco no dia da experiência. Use água destilada e deionizada. Use um dos três seguintes soluções. <ol><li> Prepara-bicarbonato contendo &#39;solução (1 L): 1 garrafa de Ames Ames meios e 1,9 g de NaHCO 3, </li><li> Preparar a solução de Locke (em mM): 112,5 de NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 de CaCl2, 10,0 de HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 de EDTA e 10,0 de glucose, 0,1% de vitaminas MEM e amino ácidos </li><li> Preparar solução de Ringer tamponada com HEPES (em mM): 133,3 de NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl2, 1,0 de CaCl2, 10,0 de glucose, 0,01 de EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado para 7,5 com ~ 5,8 mL de NaOH 1 M, adicionar 0,72 g / L de meio de cultura de Leibovitz L-15. Use 20 - 50 pM de DL-AP4 e 50 - 100? M BaCl2 para isolar a resposta de fotorreceptores com qualquer meio de perfusão. </li></ol></li><li> Preparar a solução de eléctrodos de 28 (em mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl2 2,4, CaCl2 1,2, HEPES 3, 0,01 de EDTA e ajustar o pH a 7,4-7,5 com NaOH. Eléctrodo solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante vários meses. </li><li> Preparar e testar o suporte da amostra. <ol><li> Cole papel de filtro preto / cinza em cima das cúpulas da parte inferior do suporte da amostra (ver Figura 1A). Espalhe de dois componentes de cola epóxi 5 min cuidadosamente em torno dos bordos das partes superiores planas das cúpulas. Se necessário, faça-o sob dissecção microscópio. </li><li> Aguarde até que a cola estiver quase seco (cerca de 4 min) e pressione o filtro de papel nas cúpulas usando um item de plano. Papel de filtro de cola, pelo menos, um dia antes da experiência. Opapel de filtro pode ser utilizada várias vezes, mas deve ser substituído após um mês de gravações. Use etanol a 70% para limpar cuidadosamente cúpulas de qualquer resíduo de cola antes de instalar o papel de substituição. </li><li> Preencha os canais de eletrodos com uma solução de eletrodo tentando evitar as bolhas de ar e parafuso eletrodos de pelotização fechados com um adaptador de rosca para os canais de eletrodo (ver figuras 1A e B). Ligar as peças superior e inferior do suporte da amostra com quatro parafusos e encher as linhas de perfusão com solução de eléctrodo. </li><li> Medir a resistência e tensão entre os condutores de cada par de eléctrodos usando um multímetro (Figura 1B). A resistência deve ser inferior a 100 Ωk ea tensão abaixo de 10 mV se os canais estão sem bolhas e os eletrodos estão em boas condições. </li></ol></li><li> Pour 400-700 ml de meio de perfusão no frasco de vidro. Separadas mais 300 ml para ser utilizada na dissecção das retinas e srasgou-o em uma geladeira. Definir a tubagem de perfusão no bloco permutador de calor e colocar o bloco de pré-aquecido sobre a placa de aquecimento (ver Figura 1D). </li><li> Coloque o frasco com uma tampa que tem ligações para o CO 2 / O 2 gás (se Ames ou Locke é usado) e para a tubagem de perfusão (ver Figura 1D). Pré-aqueça o frasco com a mídia para 37 ° C e coloque-o sobre a placa de aquecimento ou na parte superior da unidade de estímulo de luz no banho-maria regulado para 37-39 o C 17. <ol><li> Primeiro as linhas de perfusão, preenchendo-as com meios de perfusão para iniciar o fluxo orientado a gravidade. <ol><li> No sistema LKC, colocar a garrafa no topo da unidade estimulador 17 para proporcionar um escoamento gravitacional significativa que é, então, ajustado por reguladores de caudal sem ser influenciado pelo nível de redução da solução de perfusão na garrafa durante a experiência. </li><li> No sistema Ocuscience, coloque o perfusion garrafa no interior da gaiola de Faraday, de modo a minimizar o ruído e colocar linhas de saída longo de perfusão de suporte da amostra (ver passo 2.8) bem abaixo do nível do suporte da amostra (e do frasco de perfusão) para aumentar a movimentação gravitacional da solução. Proteger essas linhas de saída e ligue a blindagem à terra do amplificador para impedir o acoplamento do ruído eletromagnético ao sinal ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Ajustar a perfusão de 3-5 ml / min usando reguladores de caudal. Conecte-se 5% de CO2 / 95% de O 2 de gás de um cilindro com regulador apropriado e ajustar a taxa de fluxo para garantir borbulhamento constante da mídia na garrafa através de uma pedra de ar. </li></ol> Preparação 2. Amostra <ol><li> Montar instrumentos de dissecção limpas e nítidas incluindo microtesoura reta de lâmina, um ou dois 45 o pinças, lâmina de barbear e um pedaço retangular de papel de filtro. </li><li> Despeje cerca de 200 ml de perfu friosion solução numa placa de Petri grande, de modo que toda a parte inferior do suporte de amostra (incluindo as cúpulas) pode ser imersa na solução. Este passo torna-se importante ao montar as retinas sobre as cúpulas (veja o passo 2.6). Embora algumas soluções foram desenvolvidas para ser saturada com carbogéneo (5% de CO2 / 95% de O 2), isto não é essencial para os fins de dissecação e não foi feito nas experiências descritas aqui. </li><li> Para uma experiência típica, manter os animais em 12/12 horas escuro ciclo de luz / escuridão e-adaptá-los para 6-12 horas antes das gravações. Eutanásia do animal por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical sob luz vermelha ofuscante e fazer todas as seguintes operações sob luz vermelha ou IR dim (usar por exemplo, filtro vermelho na frente da fonte de luz do microscópio). <ol><li> Puxe os olhos para fora usando uma pinça e colocá-los na mídia. Coloque um olho de cada vez em um pequeno pedaço de papel (por exemplo, alguns papel de filtro regular) e fazer comoiluminado é aproximadamente o nível de ora serrata, mantendo o olho com uma pinça (isto é feito fora da solução aqui). </li></ol></li><li> O corte ao longo da ora serrata (ou mais perto do equador do olho) com microtesouras e remover a córnea e da lente. Coloque o copo olho na mídia frio na grande placa de Petri e repita o mesmo procedimento com o outro olho. </li><li> Corte de uma pequena incisão da parte superior da taça dos olhos no sentido do nervo óptico, mantendo a tesoura entre a retina e esclera, a fim de manter a retina como intacta quanto possível. Aderência da esclerótica de ambos os lados da incisão usando duas pinças e puxar as pinças longe um do outro para separar a retina. <ol><li> Cortar o nervo óptico e tentar isolar a retina com uma quantidade mínima de contacto físico com a superfície distai. RPE, na sua maioria separar automaticamente a partir da retina durante o processo de dissecção. É mais importante para evitar a perturbação mecânica da retina do que para realizar odissecção rapidamente, em geral, as retinas podem ser incubadas pelo menos 30 minutos na solução, sem efeitos significativos sobre as propriedades de resposta. </li></ol></li><li> Monte as retinas sobre as cúpulas de suporte para amostra (Figura 1C). Mergulhe a parte inferior do suporte da amostra na placa de Petri com as retinas dissecadas. Deslize da retina, fotorreceptores lado (a superfície convexa da retina isolado) para cima, por cima da cúpula e levantar o suporte da amostra, de modo que a retina atribui no papel de filtro. Repetir o procedimento para o outro retina. </li><li> Secar a placa suporte com cuidado para evitar interferência elétrica entre as retinas, bem como o ruído eo sinal de manobra. O suporte de amostras tem anéis de vedação em torno das cúpulas parte do fundo para impedir que a solução derrame entre a parte inferior e superior das peças do suporte, bem como para ajudar o isolamento eléctrico dos fotorreceptores e células ganglionares lados das retinas individuais. Fixe a parte superior do suporte com os quatro parafusos (ver Figura 1B) e encher os canais de perfusão com solução de perfusão utilizando uma seringa e uma agulha. </li><li> Transferir o porta-espécime ao lado do bloco do permutador de calor e conectar as linhas de entrada e saída de perfusão para o suporte da amostra (Figura 1D). Ligar os eléctrodos ao amplificador ERG (top eletrodos ligar para o chão / menos pino no amplificador) e anexar a unidade estimulador / controle sobre o suporte da amostra usando um adaptador ou deslizar a almofada de aquecimento na unidade estimulador dependendo de qual in vivo ERG sistema é utilizado. </li></ol> 3. Gravações <ol><li> Configurar as definições do amplificador e de estímulo usando o software do sistema in vivo. Defina a freqüência de aquisição a um valor entre 1 e 10 kHz e filtragem passa-baixo a 300 Hz. Não usar a filtragem passa-alta. Use 60 Hz (ou 50 Hz na Europa) entalhe filtro, se necessário. </li><li> Ficha de linha de base sem estimulação luminosa e sagacidadeh estimulação dim (eg., luz verde de -35 dB ou 0,3 mCd sm-2) para testar a boa conexão elétrica entre os eletrodos e amostra retina. Espera 10-20 min antes de iniciar a recolha de dados de modo a que a temperatura e a função da retina alcançar um estado estável. <ol><li> Escolha parâmetros de estímulo de acordo com qualquer experiência específica e comece a coleta de dados. Por exemplo, usar a luz verde de -40 até 0 dB ou de 0,1 até 1000 mCd sm -2 para uma família de resposta escotópica. Use cerca de 2 a 3 unidades de log mais brilhante flashes em gravações fotópicas onde hastes têm de ser suprimida pela luz de fundo (3-30 Cdm -2) ou um flash sonda (sm cerca de 1,3 -2 Cd = 1 dB, veja a Figura 3). </li><li> No entanto, lembre-se que os valores exatos de intensidade de luz pode ser um pouco dependente de sua calibração do sistema e as condições experimentais. Como uma regra geral, as intensidades da escala para baixo por 5-10 vezes, em comparação com in vivo </em&gt; gravações ao usar luz verde 17. Uma tampa preta com aberturas acima retinas (incluído no sistema adaptador comercial) pode ser usada para reduzir a dispersão de luz no suporte de amostras e facilitar estimulação homogénea e igual de ambas as retinas pela esfera Ganzfeld da comercial em sistemas in vivo. NOTA: Para gravações de retina de adaptação ao escuro, as intensidades de flashes de teste utilizadas numa experiência de branqueamento típico apenas uma fracção insignificante do pigmento, de modo que a falta de regeneração orientada para o EPR não é um problema. Além disso, foi anteriormente demonstrado que a regeneração cone de pigmento podem ainda ter lugar na retina isolada através do ciclo visual célula Müller 20. </li></ol></li><li> Como experiências durar tipicamente de 30 minutos até várias horas, monitorizar a deriva da linha de base, o nível de ruído e estabilidade de resposta durante a experiência como alterações na estes podem indicar problemas técnicos. NOTA: Aumento ou diminuição de ruídoamplitudes de resposta d pode indicar bolhas de ar nos canais de perfusão ou eletrodos, muito baixa ou alta temperatura, a solução de vazamento / derramamento ou deslocamento da retina. </li></ol> 4. Limpeza <ol><li> Retire o suporte da amostra a partir das linhas de perfusão, abra-o e lave as retinas do papel de filtro. Retirar os eléctrodos e lavá-los com água destilada (não use etanol). Limpar o suporte de amostras (incluindo os canais de perfusão) com etanol e / ou água destilada. Tubo de perfusão Lave cuidadosamente com etanol&gt; 70%. </li><li> Lavar o frasco de perfusão com água destilada (não use detergentes). O etanol pode também ser usado para limpar o frasco. </li></ol>

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

Universidade de Washington em St. Louis tem um acordo de licença com Xenotec, Inc. e pode receber royalties da venda do adaptador ex vivo.

<html> Nós demonstramos aqui os passos críticos para a obtenção de alta qualidade ex gravações vivo ERG simultaneamente a partir de duas rato retinas isoladas usando componentes in vivo do sistema ERG juntamente com um adaptador vivo ex ERG. Neste estudo, ambas as retinas perfundidos a partir do animal com a mesma solução (ou Ames, Locke ou riscas) mas também é possível perfundir cada retina com uma solução diferente, por exemplo, para fins de teste de drogas. Os passos mais importantes para a obtenção de dados de alta qualidade são blindagem de ruído electromagnético, dissecção cuidadosa da retina, estável e relativamente rápido fluxo de perfusão, utilizando um suporte avançado custom-built espécime, e realizando todos os procedimentos de preparação da amostra em vermelho dim (ou IR) claro. O método descrito aqui permite o uso imediato de ambas as retinas e dupla utilização de uma configuração in vivo ERG para executar in vivo e ex vivo gravações ERG. _content &quot;&gt; O ex vivo suporte de amostra ERG custom-built projetado recentemente por nós 17, e já está disponível comercialmente, melhora o SNR por isolamento elétrico eficiente do proximal e distal partes da retina e otimiza o fluxo de perfusão acima da (elevada taxa de câmbio solução retina .) Ausência dos componentes de ruído de frequência lentas no sinal ex vivo ERG permite a análise quantitativa do mesmo muito pequenas respostas No entanto, descobrimos que a ex vivo de gravação é mais propenso a interferência de ruído na linha de alimentação CA (60 Hz em os EUA;. 50 Hz na Europa) de experiências in vivo. Este ruído acoplado ao sinal principalmente através da linha de perfusão, e pode ser na maior parte removida a blindagem (e de ligação à terra) todos os componentes de perfusão (frasco, tubo) que residem fora da gaiola de Faraday esfera ou Ganzfeld . Além disso, por vezes, 60 Hz ruído acoplado ao sinal de ex vivo ERG através do permutador de calor e este ruído podem também ser removidos por ligação à terra. &lt;/ P&gt; Demonstramos como para remover os componentes de sinal específicas ERG adicionando bloqueadores farmacológicos na perfusão durante a experiência permitindo dissecção da função de diferentes tipos de células no mesmo retina / experiência com três diferentes meios de perfusão fisiológica (Figura 2). Um estudo recente mostrou que a escolha da mídia de perfusão afeta a fisiologia de fotorreceptores em gravações de células individuais 32. Aqui usamos Ames, Locke e &#39;media HEPES-campainha&#39; para registrar as respostas em flash adaptados à escuridão, na ausência e presença de reagentes farmacológicos destinadas a isolar o componente de fotorreceptores do sinal ERG (Figura 2). Soluções tampão bicarbonato deu maiores amplitudes a- e b-ondas, até 1 mV. Fotorreceptoras dim respostas de flash sob forma de Locke com bloqueadores continham onda recuperação complicada (ver inserção da Figura 2D) que não foi visto com AmesR17; ou perfusão Ringer. Quando a utilização ex vivo de ERG torna-se mais adaptado por laboratórios seria útil usar os mesmos meios de perfusão e métodos convencionais para isolar os diferentes componentes de sinal. Neste ponto parece que a opção mais versátil é o meio Ames &#39;porque dá a- e b-onda amplitudes estáveis ​​e grandes. Além disso, a resposta de fotoreceptor, isolado farmacologicamente nesta solução, parece ter uma forma de onda simples reminiscente do registado a partir de fotorreceptores individuais (Figura 2E). No entanto, algumas questões em aberto permanecem sobre a existência de outros componentes de sinal ERG observados em condições in vivo. Por exemplo, em nossos ex vivo condições de gravação, não ver proeminentes potenciais oscilatórios, 100 - 150 Hz ondas oscilantes que são normalmente observados na fase de subida da onda-b de uma resposta in vivo ERG. Assim, é possível que a função da retina interna em nosso ex vivo </em&gt; condições estava comprometida embora ex vivo b-ondas grandes implicado viável ON função da célula bipolar. Estudos futuros deverão resolver se modificações nos protocolos experimentais mostrados aqui (dissecção, perfusão etc.) nos permite registrar potenciais oscilatórios ex vivo sob condições. Cone função é vital para a nossa visão. No entanto, a investigação de cones é dificultada por seu pequeno tamanho e escassez especialmente na retina do rato 33. Isolamento de função cone é ainda mais complicada no rato gravações ERG porque seus M-cones e bastonetes têm sensibilidades espectrais quase idênticos 30. Os protocolos padrão tirar proveito da diferença vários log-unidade entre bastonetes e cones sensibilidades usando-supressora haste fundo claro. No entanto, a luz de fundo constante é conhecido para dessensibilizar hastes 34,35 e afetar a função cone possivelmente através da modulação de junções de hiato acoplamento entre cones e bastonetes &lt;sup&gt; 36,37. Assim, é difícil encontrar um fundo de intensidade de luz que é brilhante o suficiente para manter as hastes saturadas sem afetar cones. Aqui demonstramos um método duplo flash alternativa que aproveita tanto a menor sensibilidade e cinética de recuperação mais rápidos de cones 19,29,30. Desta forma, é mais fácil de isolar as respostas mediadas pelo cone verdadeiramente adaptados ao escuro. Percebemos que em Ames &#39;ou soluções de Locke sem quaisquer bloqueadores, os detalhes da forma de onda de recuperação foram pouco afetados durante o curso do experimento com o uso de sonda brilhantes e teste flashes. Esta complicada a análise de subtracção para isolar as respostas cone. No entanto, a remoção do componente glial por bário ajudou a estabilizar a cauda das respostas indicam que a variabilidade era devido ao componente celular Müller. Desta forma foi possível obter respostas de adaptação ao escuro conduzido de cone em ratinhos WT (Figura 3). As respostas de cones isolados por duplo flashtécnica de WT camundongos pareciam menores em comparação com os registados a partir de camundongos WT usando luz de fundo para suprimir a atividade rod 17,37. Esta diferença pode ser explicada por um efeito bem caracterizado de fundo claro que lentamente (menos de 10 min) aumenta a amplitude de resposta do cone provavelmente devido à remoção da supressão mediada por respostas haste de cone 37-39. Em resumo, o método demonstrado aqui torna possível ex vivo registos electrofisiolicos para estudar a função da retina. No futuro, esperamos que muitas mais laboratórios irá adaptar este método poderoso para estudar a fisiologia e patologia da retina humana e animal e para fazer avançar nossa compreensão da função da retina e desenvolver melhores terapias para doenças ofuscante.

Electrorretinograma (ERG) é uma técnica bem estabelecida que pode ser utilizado para registar a actividade eléctrica da retina desencadeadas pela luz. O sinal é gerado principalmente ERG por mudanças de tensão provocadas por correntes radiais (ao longo do eixo dos fotorreceptores e células bipolares) que flui no espaço extracelular resistiva da retina. O primeiro sinal ERG foi gravado em 1865 por Holmgren a partir da superfície de um olho de peixe 1. Einthoven e Jolly 1908 2 dividido a resposta do ERG ao aparecimento de luz em três ondas diferentes, denominado A, B, e C-ondas, que são agora conhecidos, principalmente, para reflectir a actividade de fotorreceptores, em células bipolares, e epitélio pigmentado células, respectivamente 3-8. ERG pode ser gravado a partir dos olhos de animais anestesiados ou humanos (in vivo), de olho preparação isolada 9, em frente isolado retina intacta (ex vivo) ou através 3,10-15 camadas da retina específicas com microeletrodos (localERG) 4,16. Destes, in vivo ERG é atualmente o método mais utilizado para avaliar a função da retina. É uma técnica não invasiva que pode ser utilizada para fins de diagnóstico ou para seguir a progressão das doenças da retina em animais ou pacientes. No entanto, in vivo registos de ERG produzir um sinal complexo com vários componentes sobrepostos, muitas vezes contaminados por ruído extraocular fisiológico (por exemplo, a respiração e da actividade cardíaca). ERG local pode ser utilizado para gravar o sinal através de camadas específicas da retina, mas é mais invasiva e tem uma menor relação de sinal-para-ruído (SNR) em relação a outras configurações de gravação ERG. ERG local também é tecnicamente exigente e requer equipamento caro (por exemplo, microscópio e micromanipuladores). Transretinal ERG do intacta, isolado retina (ex vivo ERG) oferece um compromisso entre os métodos in vivo e ERG locais permitindo estável e higgravações h SNR de retinas intactas de animais ou seres humanos 17. Recentemente, este método tem sido utilizado com êxito para estudar a função de fotorreceptores cone e da haste em mamíferos, primatas e humanos retinas 18-20. Além disso, devido à ausência de epitélio pigmentar da retina ex vivo, o componente do sinal de ERG c-onda positiva é removida e um componente lento PIII negativos proeminentes é revelado nas gravações ex vivo. O componente PIII lenta tem sido demonstrado que se originam a partir da actividade de células da glia de Müller na retina 21-23. Assim, método ex vivo ERG também poderia ser usado para estudar as células Müller na retina intacta. Vários estudos também demonstraram que os registos de ERG ex vivo pode ser usada para medir a concentração de agentes farmacológicos em torno da retina 24 e testar a segurança e eficácia de drogas 25-27. Comercial múltipla em sistemas in vivo estão disponíveis eusado em muitos laboratórios que não têm necessariamente extensa experiência eletrofisiologia. Em contraste, ex vivo dispositivos não estavam disponíveis até recentemente 17 e, como resultado muito poucos laboratórios estão actualmente a tirar partido desta poderosa técnica. Seria benéfico para fazer gravações ex vivo ERG disponível para mais laboratórios, a fim de aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiologia da retina e patologia, e para desenvolver novas terapias para doenças ofuscante. Nós demonstramos aqui um dispositivo simples e acessíveis ex vivo ERG 17 e mostram como ele pode ser utilizado em combinação com vários sistemas in vivo ERG disponíveis comercialmente para gravar e sinalização mediada rod- de cone (a- e b-ondas) e a função de células de Müller (retardar PIII) de íntegras do tipo selvagem do rato retinas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>HMsERG</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>LKC Technologies</td>
			<td>UTAS-E 3000</td>
			<td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex vivo adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>Ex VIVO ERG adapter</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>North Central Instruments</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR emitter</td>
			<td>Opto Diode Corp.</td>
			<td>OD-50L</td>
			<td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prowler Night Vision Scopes</td>
			<td>B.E. Meyers Electro Optics</td>
			<td>D4300-I</td>
			<td>Military grade product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Rosco Laboratories</td>
			<td>Roscolux #27 Medium Red</td>
			<td>May be used instead of IR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red head light</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>ERGX011</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>500086</td>
			<td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers #5</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Metler Toledo</td>
			<td>AB54-S/FACT</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter and electrode</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>pHI 350</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60129</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63020</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>101</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>224731</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2834</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz culture medium L-15</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN3156</td>
			<td>5% CO2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Foram registrados respostas de flash a partir do tipo selvagem de adaptação ao escuro (WT) C57BL / 6 de rato retinas seguindo os protocolos experimentais descritos acima e ilustrados na Figura 1, usando diferentes soluções para perfusão padrão (Figura 2). As formas de onda de resposta e cinética, bem como sensibilidade dos bastonetes apareceu semelhante em Ames e mídia de Locke (Figura 2A e B). Por outro lado, sob a solução de Ringer tamponada com HEPES (sem bicarbonato ou 5% de CO2 / 95% de O 2) as amplitudes de resposta foram significativamente menores. Nós também descobrimos que, nestas condições, a estabilidade da onda-b foi comprometida. Adicionando 40 mM APB (DL-AP4) removeu-ondas b positivo de forma eficiente em todos os três meios (Figuras 2D-F). Remoção da onda b revelou uma grande onda negativa lento (Figura 2D) que tem sido atribuída à actividade de células Müller 21. Adicionando 100 &amp;# 956; M de bário aboliu este componente, revelando a resposta de fotorreceptores do sinal de ex vivo ERG (Figuras 2D-F). Poderíamos gravar até 1 respostas fotorreceptoras mV saturadas em Ames &#39;e Locke enquanto respostas máximas eram tipicamente cerca de 200 mV sob perfusão Ringer. Respostas fotorreceptoras Cone foram isoladas anteriormente pela chamada técnica de flash duplo, onde um flash brilhante sonda saturando as hastes é seguido por um flash de teste em um momento em cones ter restaurado seu estado de adaptação ao escuro mas varas permanecem saturado 19,29. Aqui nós isolado respostas mediada ERG de cone (contendo tanto a- e b-ondas) em meios de Ames suplementadas com 100 M de bário, mas não DL-AP4 usando a técnica de flash duplo (Figura 3). Bário foi usado para remover o componente lento da glia que apareceu para fazer a parte final das respostas mais variável especialmente durante o uso repetitivo de bright pisca. Nós usamos um flash sonda constante para saturar as hastes e os flashes de teste variável de 300 ms após o flash sonda para obter respostas de cone. Uma família de resposta cone obtido por subtracção de resposta de flash sonda a partir dos &#39;+ sonda de teste de flash &quot;respostas é mostrado na Figura 3B. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> Figura 1. Utilização do suporte de amostra ex vivo ERG. (A) Preenchimento de canais de eletrodos e montagem dos eletrodos. (B) O teste do suporte de amostra montado antes de dissecção medindo a resistência e tensão entre os pares de eletrodos. (C) Montagem da retina no papel de filtro no suporte da amostra. (D) O suporte de amostra ligado às linhas de perfusão e amplificador ERG no sy ERG comercialhaste. O caminho do fluxo de perfusão é indicado por setas azuis. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> Figura 2. famílias de resposta em Flash gravados a partir de retinas de adaptação ao escuro WT rato perfundidos com Locke (A), Ames &#39;(B), e HEPES Ringer (C) médio. Os flashes entregues 3, 40, 130, 390 e 1400 mm -2 fótons (de -36 para -9 dB ou -3,6 para -0,9 log (sm Cd -2) Luz verde (530 nm)). Traços negros em (DF) mostram respostas registradas a partir de retinas em (AC), após adição de 40 mM APB e 100 M de bário. Traços vermelhos em (D) mostram respostas gravadas da retina em (A)<html> perfundidos com de Locke suplementado com 40 uM APB mas não de bário. A inserção mostra as respostas aos três flashes mais escuras em meios de Locke contendo APB e bário. Os flashes variou de 7 a 14 mil fótons mm -2 (de -32 a 1 luz verde dB) em (D), de 3 a 1.400 fótons mm -2 (de -36 para -9 dB luz verde) em (E), e de 7 a 1.400 fótons mm -2 (de -32 a -9 dB luz verde) em (F). Veja Vinberg et al. 2014 17 e Lyubarsky et al., 1999 30 e 2004 31 para obter detalhes sobre a conversão de energia luminosa photopic dada em Cd sm -2 a fótons ^ m -2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> carga / 52.855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Isolamento de respostas cone com método duplo flash em WT mouse. (A) Uma resposta para sondar rápida (14.000 mm -2 fótons ou 1 dB luz verde, preto) e uma resposta para sondar de flash seguido de um flash de teste (81.000 fótons mm -2 ou 9 dB luz verde, vermelho). (B) as respostas de flash Cone para testar flashes que variam de 360 a 81.000 mm -2 fótons (-14 a 10 dB luz verde) isolados subtraindo a resposta do flash da sonda &quot; + sonda de teste do flash &quot;resposta. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K visualizações.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Vídeo: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...