Name: silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. Prepare soluções siRNA <ol><li> Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul. </li><li> Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização. NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes. </li></ol> 2. Sementeira de linhas celulares epiteliais humanas <ol><li> Remover o meio de crescimento de linhas celulares epiteliais humanas que crescem como monocamadas celulares em placas de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células na placa uma vez com PBS temperatura ambiente (10 ml de PBS para uma placa de 100 mm). </li><li> Para retirar as células a partir da placa,adicionar 2 ml de tripsina a 0,25% / solução de 0,53 mM de EDTA e incubar 3-5 minutos, dependendo do tipo de célula. </li><li> Antes de recolher as células destacadas, neutralizar a tripsina por adição de 2 ml de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino. </li><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar as células a 320-330 x g durante 3 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante. </li><li> Ressuspender as peletes de células em 5 ml de meio livre de antibióticos. </li><li> Contar as células ao microscópio numa câmara de Burker, quer utilizando um sistema automatizado de contagem de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Semente as células em placas de 6 poços para ser cerca de 80% confluente após 24 horas (0,5-1 x 10 6 células em 2 ml de meio para cada poço). O número de células óptimas a serem semeadas podem variar dependendo das linhas de células específicas e a taxa de crescimento. NOTA: Não adicionar antibióticos a médio neste momento porque os antibióticos irá interferir negativamente com a eficiência de transfection. É muito importante que as células estão na cultura de passagens baixas (&lt;10) para atingir uma elevada eficiência de transfecção siRNA BRCA2. </li></ol> 3. Células de transfecção com siRNA <ol><li> Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células, prosseguir com a primeira rodada de transfecção. <ol><li> Dilui-se 6 ul de 10 siRNA reagente de transfecção à base de lípidos específicos, em 130 ul de meio de soro reduzido. </li><li> Dilui-se 3 ul de siRNA 10 uM (30 pmol) em 130 ul de meio de soro reduzido. </li><li> Combinar o siARN diluiu-se com o reagente de transfecção diluído e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação, remover o meio das células e adicionar 2 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 ° C (sem antibióticos). </li><li> Adicionar 250 ul de complexos de siRNA-reagentes de transfecção para as células (este valor é para um único poço de uma placa de 6 poços). </li><li> Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 3776; C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Após 24 horas, prosseguir com a segunda rodada de transfecção por passos 3.1.1-3.1.5 repetindo com a seguinte modificação para a etapa 3.1.2: diluir 5 ul de 10 mM siRNA (50 pmol) em 130 mL de meio de soro reduzido. <ol><li> Incubam-se as células durante 1-2 dias a 37 ° C antes da análise. NOTA: Duas rodadas de transfecções e uso de uma relação de reagente alta siRNA / transfecção na segunda rodada são essenciais para obter alta eficiência do BRCA2 silenciamento. </li></ol></li></ol> 4. Lisar as células para análise de imunotransferência <ol><li> Preparar tampão de lise fresco com PBS (pH 7,4) contendo 1% do não iónico, não-detergente desnaturante octilfenoxipolietoxietanol, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 ug / ml de leupeptina, 10 ug / ml de aprotinina. Mantê-lo em gelo. </li><li> Remover o meio das células e wash-los uma vez com PBS frio (2 ml / poço) na placa. Para evitar qualquer transição PBS, removê-la completamente a partir da placa. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de lise a cada poço. NOTA: Se as células têm de ser usado também para outros ensaios, trypsinize as células tal como descrito no passo 2,1-2,6 e ressuspender as células em tampão / meio apropriado de acordo com a aplicação a ser utilizada. </li><li> Rodar suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incubar durante 15 min a 4 ° C num rotor. </li><li> Recolhe-se o lisado celular num tubo de microcentrífuga em gelo usando um raspador de células. </li><li> Centrifugar a 17.900 xg durante 25 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num novo tubo. </li><li> Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> Análise immunoblotting 5. BRCA2 <ol><li> Preparar o tampão de corrida, diluindo 50 ml de 20x de Tris-Acetato de SDS execução bpode ser prejudicado (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% de SDS, pH 8,24) com 950 ml de água destilada. </li><li> Preparar a amostra como se segue: adicionar 15? G de lisado celular total, 5 uL de tampão de amostra 4x contendo sulfato de dodecilo de lítio, a pH 8,4, 2 mL de amostra de 10x agente redutor (DTT 0,5 M) e tampão de lise para um volume final de 20 ul. NOTA: Este protocolo permite a detecção de BRCA2 em linhas de células normais, também quando se utiliza uma menor quantidade de proteínas totais (inferior a 5 ug). </li><li> Desnaturar amostras a 55 ° C durante 10 min. NOTA: É fundamental usar 55 ° C. Desde que a proteína BRCA2 é termossensível 11, as temperaturas de desnaturação mais elevadas resultam em perda consistente dos intacto de comprimento completo (390 kDa) da proteína BRCA2. </li><li> Defina-se a câmara de electroforese de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Coloque as amostras e 10 ul de alto peso molecular pré-corados padrão de proteína em um gel precasted (Tris-Acetato de 3-8%) e executado em 120 V para aba 2 horas 12. Parar a corrida eletroforética antes do 55 kDa marcador azul deixa o gel precasted. </li><li> Preparar o tampão de transferência com 50 ml de tampão de transferência 20x, 100 ml de metanol a 100% e 850 ml de água. </li><li> Activar a membrana de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) por imersão em 100% de metanol durante 5 minutos, enxaguar com água destilada e equilibrar em tampão de transferência, pelo menos, durante 5 min. Soak as esponjas do aparelho de transferência com tampão de transferência a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Quando a corrida eletroforética é longo, montar o sanduíche na pilha de transferência na seguinte ordem (bottom-up): três esponjas saturadas em tampão de transferência, uma folha de papel 3MM grau saturado em tampão de transferência, o gel, membrana PVDF ativado, um 3MM folha de papel grau saturado em tampão de transferência, três esponjas saturado em tampão de transferência 13,14. Colocar a pilha no aparelho e as proteínas de transferência em 350 mA durante 4 horas a 4 ° C ou a 180 mA durante a noite a 4 ° C. NOTA: Ser BRCA2 uma proteína muito grande, é crucial para estender o tempo de transferência de 1 hora (tal como sugerido pelo fabricante, e a maioria dos protocolos de transferência) a 4 horas ou durante a noite para assegurar a transferência completa de proteínas de alto peso molecular. Além disso, devido ao longo tempo de transferência, que é essencial para realizar o blotting numa sala fria a 4 ° C para minimizar o sobreaquecimento e facilitar a desmontagem sanduíche. Sistemas de transferência semi-secas não são bons para a transferência de grandes proteínas. </li><li> Após a transferência, lavar a membrana com TBS, bloqueá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente em TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contendo 5% de leite seco sem gordura e a sonda durante a noite a 4 ° C com 30 ul de anti-anticorpo policlonal de coelho BRCA2 ( 200 ug / ml), diluído em 9 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro [1: 300 (v / v)] de diluição. </li><li> Lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T, em seguida, o filtro incubar durante 1 hora com 1 ml de peroxidase de rábano conjugado com anti-anticorpo secundário de coelho diluído em 10 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro. Em seguida, lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T. </li><li> Realizar imunodetecção por ECL para revelar proteína BRCA2 usando quimioluminescência aumentada (ECL) de Reagente de Detecção de Western Blotting, seguindo as instruções do fabricante. Visualize bandas imunoquimioluminométricos sobre filmes de alta resolução ECL. </li><li> Realizar imunodetecção com um anticorpo para um gene de manutenção, como β-tubulina (55 kDa), no mesmo filtro como controlo de carga, utilizando um anticorpo monoclonal para β-tubulina diluído a 1: 1000 (10 ul de anticorpo anti-tubulina em 10 ml de TBS-T + 5% de leite seco não gordo) durante 1 h à TA. Lavar e incubar o anticorpo secundário como descrito para BRCA2 (5,10-5,11), excepto na utilização de peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. </li><li> Adquirir uma imagem digital dos filmes impressionados com bandas imunoquimioluminométricos e analisar a intensidade da banda por imagem dedicada software de análise (por exemplo,., ImageJ). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma 3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui para silenciar e analisando a expressão da proteína BRCA2 proporciona uma ferramenta eficiente para investigar as funções do gene supressor de tumor BRCA2 em um amplo espectro de ensaios biológicos. O protocolo de silenciamento é baseado em procedimentos de transfecção padrão siRNA ainda contém várias modificações cruciais, bem como dicas para knockdown bem sucedida e consistente de BRCA2. O protocolo de transfecção siRNA é seguro, rápido e eficiente e, ao contrário dos shRNA, que normalmente faz uso do lenvetores tiviral, não precisa de procedimentos de biossegurança específicas e pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório equipado com uma instalação de cultura de células. Da mesma forma, o protocolo de imunotransferência foi optimizado para a detecção eficiente de uma grande proteína, como BRCA2. O protocolo de imunotransferência foi também validado para a detecção de proteína BRCA2 humano recombinante expresso de forma heteróloga em células de levedura 9. Vários fatores importantes para a prestação eficiente de siRNA são relatados aqui. Eles incluem dois ciclos de transf ecções e uma elevada proporção de siRNA para o reagente de transfecção, especialmente no segundo ciclo. Ausência de antibióticos antes e durante o procedimento de transfecção é outro fator crítico. No entanto, este processo expõe as células em cultura a um maior risco de contaminação bacteriana; portanto, devem ser tomadas precauções extras para garantir um alto padrão de esterilidade em todas as etapas. Deve notar-se que, dependendo do tipo de célula, knockdo gene eficientewn requererá tipicamente 24-48 horas após o segundo ciclo. O actual método tem a vantagem de manter silenciamento de genes completamente estável pelo menos até sete dias após o segundo ciclo de transfecção. Isto permite o estudo dos efeitos de BRCA2 knockdown em uma variedade de ensaios biológicos, incluindo a resposta celular a fármacos quimioterapêuticos diferentes. No entanto, uma limitação da presente técnica é representada pelo facto de que as moléculas de siRNA exógenos não se integram no genoma, knockdown assim estável de expressão do gene não pode ser alcançado. Alternativamente, para obter knockdown estável, infecção lentiviral shRNA pode ser realizada, desde que o laboratório está preparado para exigências de biosegurança adicionais (BSL-2 normas de acordo com as directrizes de NIH). Além disso, quando a transfecção não é uma abordagem aplicável para estudar a função de genes em células de um tipo específico (por exemplo., Linfócitos T), a utilização de ratinhos knockout condicional Brca2 específicos de células permanece a única alternAtive 19. Este método relatórios também várias dicas para detecção bem-sucedida de uma proteína de alto peso molecular por immunoblotting e é conveniente para ambas as proteínas de alta e baixa abundância. Em particular, devido à termossensibilidade a proteína BRCA2, uma temperatura mais baixa de desnaturação é crítico para a sua detecção óptima, de acordo com um estudo anterior 11. Este &quot;truque&quot; técnico pode também ser útil para outras proteínas para as quais a detecção por protocolos padrão immunoblotting foi provado sem êxito. Prevemos que este método contém dicas de validade geral e, portanto, pode facilitar o silenciamento e detecção de muitas outras proteínas desafiadoras.

O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro 3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de desenvolvimento de cancro, BRCA2 que suprimem ou reduzem a função BRCA2 pode tornar as células de cancro mais vulnerável a agentes quimioterapêuticos que provocam danos no DNA 5-7. Cânceres esporádicos apresentam uma baixa taxa de mutações BRCA2 (&lt;3%) que os níveis reduzidos de proteína BRCA2 foram detectados em alguns tipos de câncer, o que sugere que a proteína BRCA2podem ser perdidos durante a tumorigênese em cânceres esporádicos através de mecanismos não-mutacional-dependentes 7,8. Assim, é importante compreender as funções BRCA2 no contexto da biologia do cancro, bem como em outras configurações biológicos. Uma poderosa ferramenta utilizada para identificar novos funções de um gene em células de mamífero é silenciar a sua expressão. Como um exemplo, o silenciamento BRCA2 expressão numa variedade de células epiteliais normais levou recentemente à identificação de uma nova função de BRCA2 como regulador de resistência anoikis, um passo importante durante a aquisição de célula de cancro invasivo e metastático capacidade 9. Gene silenciamento pode ser alcançado através da introdução nas células ou de interferência (Si) ou ARN pequeno gancho de cabelo curto (sh) moléculas de RNA alvo do gene específico. A alta potência de siRNA e sua facilidade de uso tornam a ferramenta preferencial para silenciar experiências destinadas a ganhar novos insights sobre processos biológicos críticos umnd para identificar novos alvos terapêuticos. No entanto, knockdown eficiente da expressão do gene pode não ser facilmente possível para todos os genes e pode ser altamente variável dependendo do tipo de célula. Porque a diminuição dos níveis de proteína intracelular é o fenótipo mais relevante sob investigação, que é fundamental para quantificar o silenciamento do gene por análise de imunotransf erência do produto do gene. Com este respeito, a proteína BRCA2 apresenta um desafio adicional: sendo uma proteína grande (cerca de 390 kDa), dificuldades técnicas existem para análise bioquímica convencional, incluindo a imunotransferência. Nós relatamos aqui um protocolo otimizado para silenciamento eficiente do BRCA2 em linhas de células epiteliais humanas e para a detecção rápida e bem sucedida de proteína BRCA2 knockdown por immunoblotting análise.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados ​​celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas &quot;grandes&quot; como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.

Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização de apenas uma rodada de siRNA transfecção ou usando uma siRNA inferior à relação de transfecção na segunda rodada (25 pmol de siRNA e 6 ul de reagente de transfecção) resultaria em menor eficiência knockdown (Figura 1B). O segundo passo é avaliar o tempo mínimo óptimo para conseguir o mais alto nível de silenciamento do gene. Dependendo do tipo de célula, esta pode variar entre 24 e 48 horas após a segunda ronda de siRNA transfecção. Por exemplo, 24 horas são suficientes para células da tireóide Nthy mas até 48h são necessários para knockdown eficiente BRCA2 em células da próstata PNT1A (Figura 2A). BRCA2 silenciamento é bastante estável até ao dia 7 após o segundo ciclo de transfecção (Figura 2B). De nota, desnaturar os lisados ​​de células a uma temperatura acima de 55 ° C (100 ° C durante 5 min), os resultados em até 50% de perda de proteína BRCA2 (Figura 2C), devido à termossensibilidade BRCA2 11. Uma vez que esteja estabelecido o tempo silenciamento óptima, os efeitos da perda de proteína BRCA2 pode ser explorado em diversos ensaios. Uma vez que mutações in vivo que causam a perda de função de BRCA2 promover o aumento de sensibilidade a inibidores de PARP, bem como para outros fármacos quimioterapêuticos que provocam danos no DNA 15-18, um ensaio comum para determinar se a sensibilidade das células -silenced BRCA2 para o inibidor de PARP rucaparib ou oloparib. Na experiência relatada na Figura 3, as células PNT1A esgotado of proteína BRCA2 através de siRNA foram tratadas com 10? M rucaparib durante 24 horas, após o que a proliferação celular foi avaliada por um ensaio de proliferação celular baseado em MTT. Depleção de proteína resulta em BRCA2 uma diminuição dependente do tempo na proliferação de células após o tratamento rucaparib (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig1.jpg" /> Figura 1. Duas rondas de transfecção e alta siARN a proporção de reagente de transfecção melhorar BRCA2 silenciamento. (A) Especificidade do BRCA2 silenciamento foi confirmada em células Nthy análise por immunoblotting 24 horas após a segunda rodada de transfecção, usando siRNA mexidos (Ctrl) como controle para comparação dos níveis de proteína BRCA2. Marcadores de peso molecular são apresentados à esquerda. (B) células PNT1A foram submetidos a um ou dois ciclos de BRCA2 sRNAi transfecção como descrito no protocolo [Ciclos (#) 1 e 2], e a proteína BRCA2 depleção foi quantificada por imunoblotting. Dois ciclos de transfecção com siRNA mexidos foram utilizados como controle (Ctrl). Em 2b, células PNT1A foram sujeitos a dois ciclos de transf ecção usando um BRCA2 siRNA siRNA inferior à relação de reagente de transfecção, no segundo ciclo, de uma modificação (25 pmol siRNA / 6 ul de reagente de transfecção). Em todos os casos, os níveis de proteína BRCA2 foram analisadas 48 h após o segundo ciclo. No fundo, a quantificação dos níveis de proteína BRCA2 é relatado como proporção BRCA2 / Tubulin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52849/52849fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig2.jpg" /> Figura 2. Otimização do BRCA2 knockdown. (A) Optimai BRCA2 knockdown pode levar entre 24 a 48 h após o segundo ciclo de siRNA transfecção. Duas linhas de células diferentes (PNT1A Nthy) e foram avaliados para BRCA2 knockdown 24 h e 48 h após o segundo ciclo de siRNA transfecção por análise de imunotransferência. Na parte inferior, os níveis de proteína BRCA2 são apresentados como percentagem dos níveis no tempo 0 h, fixado em 100. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. (B) knockdown BRCA2 é estável durante 7 dias. PNT1A células foram avaliadas para BRCA2 knockdown até 196 horas após o segundo ciclo de transfecção siRNA por imunotransferência. A proporção de sinal para BRCA2 tubulina é relatado na parte inferior. (C) proteína BRCA2 é termossensível. PNT1A células não transfectadas foram colhidas 24 h após o plaqueamento (cerca de 70% de confluência) e lisadas de acordo com o protocolo. Duas aliquotas do mesmo ligado de células (15 ^ g de proteínas totais) foram desnaturadas, quer a 55 ° C durante 10 minutos ou a 100 &amp; #176; C durante 5 min e os níveis de proteína BRCA2 foram avaliadas por imunotransferência. Na parte inferior, a proporção de sinal para BRCA2 tubulina é relatado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52849/52849fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig3.jpg" /> Figura 3. BRCA2 silenciamento aumenta a sensibilidade celular para a rucaparib inibidor de PARP. As células PNT1A ou transfectadas com controlo (Ctrl) ou BRCA2 siRNA foram colhidas 48 h após a transfecção e semeadas em placa de 96 poços (2000 células / poço). Após 24 h, 10 | iM rucaparib foi adicionado às células durante 24 horas, após o que as células foram mantidas na ausência da droga até 96 horas. A proliferação celular foi avaliada no momento indicado, utilizando o ensaio de MTT através da medição da absorvância a 550-690 nm. Eacalínea h tempo representa a média ± DP de três poços de uma experiência representativa. Ctrl siRNA, linha azul; BRCA2 siRNA, linha vermelha. No topo, perfil de proteínas em células BRCA2 BRCA2 siRNA transfectadas é relatado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52849/52849fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silenciamento de<em&gt; BRCA2</em&gt; Identificar funções biológicas regulada-BRCA2 romance em células humanas de cultura

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K visualizações.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Vídeo: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Pesquisa do câncer

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicina

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Biologia

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengenharia

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Silenciamento de

Resumo

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