A imunofluorescência indireta permite detectar proteínas de reparação de DNA, fotos de recrutamento espacial e temporal e ajuda a interrogar interações proteicas no local do dano ao DNA. Após danos no DNA, as proteínas de reparação de DNA são recrutadas para o insulto do DNA, enquanto sua concentração aumenta localmente, e formam grupos chamados focos que podem ser visualizados por imunofluorescência indireta em amostras fixas. Esta técnica pode ser usada para detectar focos proteicos, bem como para quantificar a colocalização do presente nas células.
Isso pode ajudar a explicar a sequência de eventos necessários para formação complexa e para reparação de DNA. interações proteinas particulares podem ser implicadas a partir de tais experimentos. Demonstrando o procedimento estará Barbara De La Pena, uma foto pós-doutora muito talentosa do meu laboratório Comece cultivando 40.000 células HeLa em cada poço acima de 12 placas de bem com uma tampa de vidro redondo de 18 milímetros para 80% de confluência.
Depois de expor as células a quatro irradiações gama cinza, lave-as duas vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, remova completamente o PBS e adicione 200 microliters de NDB a cada poço. Incubar as células por dois minutos à temperatura ambiente e remover o NDB.
Tenha em mente que o tempo de incubação pode variar dependendo da linha celular, mas geralmente não deve exceder dois minutos. Lave as células com um mililitro de PBS. Em seguida, remova completamente o PBS e adicione 200 microliters de 4%PFA a cada poço para fixação celular.
Incubar as células por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o PFA e adicione um mililitro de PBS a cada poço. Remova completamente o PBS e adicione 200 microliters de solução de bloqueio a cada poço e incuba as células por duas horas à temperatura ambiente ou de 16 a 18 horas a quatro graus Celsius.
diluir o anticorpo primário e tampão de diluição e vórtice até bem misturado em uma caixa de umidade e aqui um pedaço de parafilm e adicionar 10 microliters de anticorpo primário em uma única gota. Alinhe uma borda da tampa do poço com a gota e abaixe-a lentamente para o parafilme espalhando o líquido. incubar o deslizamento de tampas por duas horas em temperatura ambiente.
Após a lavagem da incubação, a tampa desliza três vezes em PBS por um minuto por lavagem. diluir o anticorpo secundário e tampão de diluição e vórtice até que bem misturado aplique 10 microliters de anticorpo secundário em cada fenda como descrito anteriormente e incuba-lo por duas horas à temperatura ambiente protegido da luz. Lave os deslizamentos de tampa três vezes com PBS e uma com água por um minuto por lavagem.
Em seguida, monte-os em lâminas de vidro com uma mídia de montagem baseada em glicerol contendo deslizamentos de cobertura de vedação DAPI com esmalte transparente e deixe-os secar por 20 minutos. Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de 60 x e use o DAPI para localizar os núcleos através da ocular para aquisição de imagens XYZ, abra o software de aquisição e defina o tipo de scanner como galvano do tipo scanner como ida e volta e 512 por 512 tamanho de imagem. No modo de conjunto do painel PMT para VBM médio para enquadrar e sequencial varredura para linha.
Em seguida, os detectores de corante e calor definem o canal um para DAPI e SD um, canal dois para alexafluor 488 e HSD três, e canal três para alexafluor em 647 e HSD quatro se selecionem para Z.To ajustar a imagem ao vivo, pressionar o botão ao vivo na janela ao vivo e ajustar o foco. Em seguida, use a janela da ferramenta PMT para definir a sensibilidade à intensidade do laser, ganho e deslocamento Para pilhas z, selecione o início ao fim e 15 fatias. Selecione a pasta para salvar imagens e pressione o botão LSM Iniciar para começar a adquirir.
Quando terminar, pressione o botão feito pela série para concluir a aquisição da imagem. Abra o software de análise e pressione a janela da ferramenta em lote e selecione as imagens para analisar. Vá para a janela da ferramenta de análise e selecione a projeção, que exibirá a projeção de intensidade máxima de 15 fatias.
Na configuração de saída de entrada, selecione a pasta de lote e saída criada. Pressione o processo para que as imagens sejam processadas e exporte as imagens como arquivos TIFF. Realize a quantificação nuclear com o perfil celular de acordo com as instruções do manuscrito.
As células não tratadas com a radiação exibem pouma H2AX sinal de exposição. Na ausência de proteínas essenciais de reparação de DNA, o acúmulo de H2AX gama pode ser observado em quebras de DNA. O acúmulo de quebras não reparadas pode levar as células a se tornarem pré-hipotônicas indicadas por núcleos gamma sólidos H2AX.
Após a irradiação, os núcleos exibem um grande número de quebras duplas encalhadas para as quais a localização de Gama H2AX é extremamente rápida. Embora poucos se algum foco for observado na ausência de uma radiação, o número de focos foi quantificado em um dois quatro e 16 horas após uma radiação e para o controle de radiação NOA. Dependendo da questão biológica levantada e do tipo de dados necessários, diferentes opções de plotagem devem ser consideradas A colocalização pode ser investigada por multiplexar anticorpos primários criados em diferentes espécies animais e usando anticorpos secundários, são rotulados com fluoroforos distintos.
Superposição de verde e vermelho, dá origem a hotspots amarelos, as duas proteínas de interesse estão presentes nos mesmos pixels. A análise quantitativa da colocalização pode ser alcançada por uma abordagem baseada em objeto ou por uma abordagem estatística que realiza análises baseadas em coeficiente de correlação de intensidade. Uma combinação de anticorpos primários criados em diferentes espécies animais, pode ser usada neste protocolo.
Certifique-se de que os anticorpos são compatíveis e não interferirão uns com os outros. Você precisa definir adequadamente o anticorpo secundário para ser usado contra cada um dos anticorpos primários e considerar uma sobreposição espectral específica ao selecionar a menor força a ser usada. Colocalização ou proteínas indicam possíveis interações diretas.
Isso pode ser verificado por precipitação granular nas células, ou por acoto de proteínas purificadas in vitro.
