This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. íon-seletivo de auto-referência microeletrodos Preparação <ol><li> Preparação de microeléctrodos selectivo de iões <ol><li> Calor puxar finas capilares de borosilicato murados sem filamentos (diâmetro externo 1,5 milímetros, 1,12 mm de diâmetro interno), utilizando um extrator de microeletrodos. Nota: Isto dá dicas de 3-4 m de diâmetro. Dicas menores têm maior resistência que torna mais microeléctrodos sensíveis ao ruído electrónico e também está associada com uma resposta mais lenta para uma alteração na concentração de iões. Informações úteis pode ser encontrado no artigo publicado por Smith et ai. 26. </li><li> Silanizar os eletrodos para tornar o hidrofóbico superfície interna para auxiliar a retenção do cocktail ionóforo lipofílico. Colocar os microeléctrodos em uma cremalheira e do calor do metal O / N num forno a&gt; 100 ° C para secá-las. O rack é uma placa de metal com buracos de 2 mm de diâmetro perfurados parte do caminho. Coloque os eletrodos nos buracos ponta para cima com uma 250 ml gproveta moça sobre eles. </li><li> Na parte da manhã, desligar o forno e, enquanto vestindo luvas isolantes, retire cuidadosamente a prateleira de metal com os eletrodos e copo no lugar. Fechar a porta do forno para reter o calor. </li><li> Usar luvas de látex ou borracha nitrílica, jaleco e óculos de protecção. Com uma pipeta de Pasteur de plástico, colocar uma gota da solução de silanização I na base de cada um dos eléctrodos (manter o copo no lugar; utilizar o lábio de vazamento para o acesso de pipeta). A solução de silanização é vaporizado por a placa de aquecimento e silanizes o interior dos eléctrodos. Use um exaustor de fumos químicos para esta fase. Coloque o rack / copo / eletrodos de volta no forno quente por algumas horas para permitir que qualquer solução de silanização restante evaporar. Nota: Por razões de segurança, não ligue o forno novamente. Coloque uma etiqueta no forno indicando que não tem de estar ligado, pois pode conter vapor nocivo e inflamável. </li><li> Após arrefecimento, armazenar as microeletrodos em um frasco insi armazenamento de microeletrodosDe a dessecador de vidro com 400 g de dessecante. Microeletrodos pode ser armazenado assim durante muitas semanas. Nota: Um método alternativo de silanização é descrito em Smith et ai 26. </li><li> Voltar-encher o microeléctrodo com 50 a 100 mL (um comprimento de cerca de 1 cm) de uma solução contendo 100 mM de ião a ser medido (ver Quadro 1 e Figura 1B). Use uma pipeta de plástico descartável Pasteur calor puxado em um bico de Bunsen a uma multa de filamentos. Enxaguar a pipeta em dH2O depois para impedir o bloqueio. Nota: Em alternativa, ajustar a concentração de iões da solução de aterro para coincidir com a concentração de ião na solução externa 27. </li><li> Observar o microeléctrodo sob um microscópio de dissecação para assegurar a ausência de bolhas de ar. <ol><li> Se as bolhas estão presentes torneira de microeléctrodos o levemente com uma unha, mantendo o eletrodo vertical (ponta para baixo) e / ou empurrar a bolhaé a ponta através da aplicação de contra-pressão, utilizando uma seringa modificado com um tubo de silicone de trocar a agulha. </li></ol></li><li> Tip-encher o microeléctrodo com 15 a 20 nl (um comprimento de 30-50 um) de ionóforo cocktail-ião específico (ver Tabela 1). Coloque uma pequena gota de ionóforo cocktail na borda curta de uma lâmina de microscópio. Observe a ponta de microeletrodos sob um microscópio de dissecação e movê-lo em direção a lâmina de microscópio até que a ponta de microeletrodos toca o cocktail ionóforo para apenas cerca de meio segundo. Desenhe o cocktail ionóforo na microeletrodos pela pressão capilar. Nota: Evite uma longa coluna de ionóforo cocktail pois isso aumenta a resistência elétrica da sonda, que pode torná-lo suscetível a interferência eletrônica (ruído) e também diminui o tempo de resposta. </li><li> Montar o microeléctrodo em um suporte de microeléctrodos linear com um conector macho de ouro de 1 mm e de AgCl (Ag +) fio (Figura 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Montar o suporte do microeléctrodo para a fase cabeça montada sobre um microposicionador controlado por computador tridimensional electrónica (Figura 1A). </li><li> Colocar a ponta microeléctrodo em solução adequada para a medição da amostra a ser medida (solução fisiológica salina, meio de cultura, etc.) para permitir que o microeléctrodo para estabilizar durante uma hora ou duas, ou mesmo durante a noite. </li></ol></li><li> Preparação do eléctrodo de referência <ol><li> Eléctrodos de referência (Figura 1C) são as mesmas como acima capilares. Corte o capilar com um lápis de diamante em 5 cm de comprimento e fogo-polido em cada extremidade para 1-2 sec em uma chama de Bunsen. </li><li> Encha estes eléctrodos com ~ 200 mL de uma solução de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potássio) ou de KCl com 2% de agarose. Escolha da solução, dependendo do ião a ser medido (o eléctrodo de referência não devem conter o ião a ser medido, ver Tabela 1). Misturara agarose e a solução e aquece-se quase a ferver em um forno de microondas. Mexa para dissolver a agarose (a solução passa claro). </li><li> Conecte o eletrodo de referência a um Pasteur pipeta de plástico e chamar a solução quente no capilar. </li><li> Gota o eléctrodo em 3 M de NaCl fria, CH 3 CO 2 K ou solução de KCl e armazenar nesta solução 3 M em tubos selados antes da sua utilização. Descarte qualquer eletrodos de referência com bolhas de ar. </li><li> Monte o eletrodo de referência em um suporte de microeletrodos em linha reta (pré-preenchido com solução 3 M) com um AgCl (Ag +) pelota dentro e um ouro 2 milímetros conector macho (Figura 1C) e anexar o eléctrodo e titular em um micro-posicionador manual do montado em um suporte magnético. </li></ol></li></ol> 2. íon-seletivo de auto-referência Calibração microeletrodos <ol><li> Preparar soluções de calibração contendo o ião de interesse como na solução de referência; ver Tabela 1 </strong&gt;. Suporte a concentração que se encontra na solução da amostra estará em (por exemplo, meios de cultura, soro fisiológico). Isto é, uma solução de calibração deve conter uma concentração mais baixa do ião do que na solução de medição, e uma mais elevada. <ol><li> Por exemplo, utilizar soro fisiológico que contém 1 mM de K +. Para esta concentração entre parênteses, dissolver KCl pó em água desionizada a uma concentração de 10, 1 e 0,1 mM em diluições em série. Use essas soluções de calibração. Em alternativa, utilizar, pelo menos, duas destas soluções. </li></ol></li><li> Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência em cada uma das soluções de calibração e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado (ver Tabela 1). </li><li> Como o software salva os dados de saída (amplificador) como um arquivo txt, copiar os dados para um arquivo de planilha. Traçar a saída de microeletrodos (mV) contra o logaritmoa concentração de ião molar (Figura 2A). </li><li> Aplicar uma regressão linear e calcular a inclinação de Nernst, interceptar e R valor 2. Aceite o microeletrodos se a inclinação é de 58 Nernst ± 11 mV / década para íons monovalentes e 29 ± 11 mV / década para íons bivalentes (para cátions, a inclinação de Nernst é positivo, para ânions é negativo). Além disso, deve ter boas microeléctrodos uma correlação linear forte (R2&gt; 0,9; Figura 2B). Nota: A saída de mV do amplificador usado aqui dá a leitura mV com um ganho dez vezes. Os valores têm de ser divididos por um factor de dez. </li><li> Utilizar a fórmula de regressão linear para converter a saída em mV em bruto do microeléctrodo em concentração de ião real (Figura 2B). </li></ol> 3. Validação da técnica de microeletrodos íon-seletivo <ol><li> Preparar uma fonte artificial <ol><li> Capilares fonte artificial são os mesmos como capilaresacima. Calor puxe o capilar usando um extrator de microeletrodos como no passo 1.1.1. </li><li> Backfill estes capilares com 200 ul de uma solução de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H2O ou tampão de pH 4. Escolha da solução fonte artificial de acordo com o ião a ser medido (veja Tabela 1). Nota: Como alternativa, puxe eletrodos com maior diâmetro da ponta (~ 20 mm) e ponta-preencher com as mesmas soluções mas contendo 0,5-1% de agarose (agarose vai impedir que qualquer fluxo de grandes quantidades de solução). </li><li> Montar o capilar fonte artificial de um micromanipulador e mergulhá-lo na solução usada para medir o fluxo do ião nas amostras. Deixar a fonte artificial na solução durante 30 min a 1 h para permitir a estabilização do gradiente. </li></ol></li><li> Validação do microeletrodos íon-seletivo <ol><li> Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões cerca de um centímetro de distância da fonte artificial capilar na solução usada para measure o fluxo de ião nas amostras e fechar o circuito com o eléctrodo de referência, tal como antes. Que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde ao valor de tampão (também referida na literatura como referência, o fundo ou valor em branco). </li><li> Mover o microeléctrodo selectivo de iões a cerca de 5 mm a partir da origem artificial e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes da gravação da tensão correspondente, utilizando o software de 1 a 2 min. </li><li> Repetir o procedimento acima, colocando o microeléctrodo selectivo de iões 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 uM de distância do capilar fonte artificial. </li><li> Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha. </li></ol></li><li> Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor. NãoTE: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B). Se a fonte artificial contém mais iões da espécie medida que a solução, a concentração deve ser maior próximo da fonte de longe, validando a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar correctamente a direcção de um fluxo de iões (neste caso efluxo; para uma pia artificial, com concentração de iões específica menor do que meio de medição, deve ser influxo). <ol><li> Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de difusão de Fick: J = c μ (dc / dx) em que c é a concentração de iões na solução (mol cm -3), μ é a mobilidade de iões (mol cm N -1 seg -1) e dc é a diferença de concentração ao longo distância dx (cm) (Figura 2C). Dados de fluxo de iões são geralmente apresentados em pmol cm -2 s-1 Ou -2 cm nmol seg -1. Nota:.. Um método alternativo para o cálculo de fluxo de iões descrito por Smith et al 26 pode ser usado. As principais diferenças incluem o uso do coeficiente de difusão em vez de a mobilidade iónica e a subtracção do fluxo de iões fundo (também tensão deriva ou factor de correcção), calculado a partir de medições de fluxo de iões na solução salina sem amostra. </li><li> Traça-se a média dos fluxos de iões de cada etapa contra a distância a partir da fonte (Figura 2D). Afastando-se da fonte, observar um decréscimo exponencial do valor do fluxo validar a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar diferentes magnitudes de fluxos de iões. </li><li> Fazer a validação fonte artificial uma vez para cada íon específico destinado a ser gravadas, a fim de validar as suas medições de direção e magnitude corretas com um grande sinal-nrácio Oise. Nota: Medição de fluxo de iões do tampão sem amostras indica o nível de fundo ou ruído. Normalmente, a medição tampão não apresenta qualquer flutuação clara da concentração de íons levando a muito pequeno de fluxo que exibe direcção variável. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de medição Câmara Nota: antes de experiências, considere a amostra a ser medida e como a amostra é para ser montado e imobilizado para medições de microeléctrodos. <ol><li> Para Xenopus laevis medições de ovócitos corte de 1 cm quadrado de uma malha de 800 mm de nylon (malha Nitex) e colá-lo em uma placa de Petri de plástico (Figura 1E). </li></ol> 5. Ion Flux Medição <ol><li> Medir a concentração de iões presentes no tampão usado para realizar as medições na amostra da mesma maneira que para a solução de calibração. X. oócitos laevis exigem modificação da campainha de Mark (MMR). Dissolve de NaCl, KCl, CaCl, e MgCl HEPES em água desionizada de modo a atingir uma concentração final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 e 5 HEPES. Ajustar o pH do tampão a 7,5 usando NaOH. </li><li> Colocar a amostra na câmara de medição e trazer o microeléctrodo selectivo de iões perto da amostra (cerca de 10 um de distância) usando o microposicionador para definir a posição perto do microeléctrodo (Figura 3A). </li><li> Iniciar a excursão de baixa frequência (0,3 Hz) (100 uM) do microeléctrodo entre a posição próxima e uma posição de distância a partir da amostra (distância) usando o software dedicado. Certifique-se de que o movimento do microeléctrodo é perpendicular à superfície da amostra. Nota: A excursão do microeletrodos podem ser definidas no software. Excursão grande aumenta o gradiente de ler permitindo uma mais fácil detecção de pequenos fluxos durante a medição enquanto prolonga o intervalo de amostragem e diminui a resolução temporal. Vejo <strong&gt; Figura 3A para um exemplo. </li><li> Inicie a gravação usando o software. O microeléctrodo pausa em cada posição e o potencial eléctrico em mV é registada no computador. Obter medições durante pelo menos 2 minutos, permitindo que a estabilização do sinal. Para experiências de lapso de tempo curtos, as variações potenciais recorde na posição de interesse para todo o curso do tempo. </li><li> Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha. </li><li> Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor. Nota: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B). </li><li> Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de Fick da difusão, como anteriormente (passo 3.3.1). </li><li> Repita a medição tampão antes de medir uma nova amostra e repita o procedimento de medição e cálculo de fluxo para cada novoamostra. </li></ol> 6. Análise Estatística e Dados Apresentação <ol><li> Testar os efeitos independentes da posição e / ou do tempo nos fluxos iônicos sob a condição de controle usando um modelo de ANCOVA com efeitos mistos 28. Nota: Análise de covariância (ANCOVA) é um modelo linear geral que mistura ANOVA regular e regressão, permitindo que tanto as medidas categóricas e contínuos para serem utilizadas como variáveis ​​independentes. Além disso, na presença de erros correlacionados induzidas por medidas repetidas por efeitos aninhados individuais e eventuais, modelos de efeitos mistos são utilizados para modelar estimativas precisas de ambos os efeitos fixos e aleatórios. </li><li> Calcule comparações de pares usando teste t Student entre os níveis de grupo com correção de Bonferroni para múltiplos testes 28. </li><li> Gerar boxplots para resumir medições de fluxo de iões de acordo com a posição ea hora. Incluem os valores de p do t de Student pares descritoacima (Figura 3D) e indicam níveis de significância de p valores como se segue: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0,001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Os passos mais críticos para a medição de fluxos de iões bem sucedida extracelulares in vivo são os seguintes: a redução do ruído, o fabrico correcto do micro-eléctrodos selectivos de iões e do eléctrodo de referência, e o posicionamento da amostra e ambos os eléctrodos. A fim de minimizar o ruído, o sistema de gravação deve estar em uma ligação à terra (aterrada) gaiola de Faraday de preferência com um (isolamento de vibração) mesa com tampo de metal que também está ligado à terra. Além disso, o chassis de microscópio também deve ser ligada à terra. As fontes de ruído eléctrico incluem a fonte de luz. Uma fonte de luz &#39;sem ventoinha &quot;de fibra óptica faz com que o ruído elétrico mínima. Finalmente, manter o fio de prata e o sedimento em microeléctrodo detentores clorada também minimiza o ruído (imersão em hipoclorito de sódio e lixívia enxaguar em dH2O) .A presença de bolhas de ar no microeléctrodo ião-selectivo ou no eléctrodo de referência irá resultar na medição fracasso como ocondutividade da microeletrodos será nula ou comprometida. Assim, é crucial para verificar os eléctrodos sob o microscópio antes de montá-los nos suportes. Veja o protocolo para procedimento detalhado para remover bolhas de ar. O posicionamento correcto, tanto da amostra e os microeléctrodos são necessários a fim de garantir resultados fiáveis ​​e reprodutíveis. A medição do fluxo de iões é dependente da excursão do microeléctrodo e a sua posição em relação à amostra. É importante identificar precisamente a zona de interesse que irá ser medido na amostra e posicionar o microeléctrodo para ter um movimento perpendicular a partir da amostra. Qualquer excursão dos microeléctrodos de uma forma que não é perpendicular à amostra irá resultar em medir o fluxo de iões alterada e maior variabilidade entre as amostras. Cocktails ionóforos dedicadas a medir iões específicos, por exemplo de potássio, também podem detectar a presença de outros iões, tais como sódio.No caso em que a solução de medição contém uma elevada quantidade de um ião concorrente para o cocktail de ionóforo, é importante para determinar a selectividade do coquetel ionóforo usando o experimento fonte artificial. Aqui, a solução utilizada para a cultura X. oócitos laevis (MMR) contém uma elevada concentração de sódio. Assim, é importante avaliar se o cocktail ionóforo de potássio utilizada também detecta sódio. Ao utilizar o microeléctrodo ionóforo de potássio cocktail cheio, podemos tentar medir um fluxo de sódio utilizando uma fonte artificial que contém elevada concentração de sódio (1 M NaCl; ver Tabela 1) mantendo a mesma solução de medição. O gradiente químico favorece o efluxo de sódio, mas de preferência sem fluxo de sódio deve ser detectado pelo ionóforo cocktail específicos de potássio. Se um fluxo significativo é medido, a condição experimental deve ser optimizado. Por exemplo, a concentração do ião concorrente pode ser reduzido até ao ponto de a microelectrode não sentir mais isso, enquanto isso pode afetar o fluxo de sódio através da membrana plasmática que leva a potenciais interferências durante as medições de fluxo de potássio. Idealmente, um factor de correcção calculado a partir do experimento de origem artificial pode ser aplicada aos dados, ou outro cocktail ionóforo pode ser testado. Ion fluxo medições usando os microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo permitir a medição de fluxos de iões ocorrendo em células e tecidos em solução aquosa. As medições de fluxos de iões em células ou tecidos que estão normalmente em contacto com um ambiente de ar exige a presença de uma solução que não está naturalmente presente no seu ambiente e que podem alterar o fluxo de iões e de troca que ocorre em condições normais. Atenção especial tem de ser feita para definir o conteúdo de tal solução e minimizar o desvio do ambiente original, fisiológica. O espectro de iões que pode ser medido pelas microele auto-referenciar selectivos de iõesctrode técnica depende da disponibilidade e existência de cocktails ionóforos específicas seletivo para o íon de interesse. As medições de fluxo de iões realizadas com o auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões são feitas em solução, geralmente próximo da superfície de células ou tecidos, permitindo a medição não invasiva de fluxos de iões extracelulares. Este método não permite a medição de fluxos de iões dentro de tecidos, células e entre o espaço intercelular. A auto-referência de microeletrodos íon-seletivo não é o único método que permite a medição de fluxos de iões in vivo. Um novo método alternativo usa repórteres bioeletricidade fluorescentes 41, que permite a medição de fluxos de iões que não são possíveis usando microeletrodos. Estes corantes permitem medições de fluxos de iões dentro de tecidos e células e pode conseguir a localização subcelular. Esta técnica pode adquirir informação espacial do fluxo de iões dentro de tecidos e células, mas não de iões exalterar entre o tecido e o espaço extracelular. Além disso, os repórteres bioeletricidade fluorescentes normalmente geram dados semi-quantitativos. O uso de tecnologia baseada em microeletrodos para medir fluxos de iões ainda é válida e necessária e traz informações adicionais para o uso da bioeletricidade repórteres fluorescentes, tornando-os mais complementares do que concorrentes técnicas. Além disso, os desenvolvimentos recentes interessantes incluem detectores de auto-referência amperométricos de oxigênio, óxido nítrico e neurotransmissores dopamina e glutamato 42,43. Detecção amperométrica baseia-se numa reacção química na ponta do sensor. Novos microeléctrodos de fibra óptica (&quot;optrodes&quot;) têm sido desenvolvidos para medir de forma não invasiva fluxo de oxigênio metabólica 34,35 e pH 44 com alta seletividade e sensibilidade 45,46. Há agora também uma sonda revestidos por nanopartículas à base de enzimas sensíveis à glicose 47. Vimos que the íon-seletivo de auto-referência de microeletrodos permite medições de fluxos de iões extracelulares in vivo. Íons não são apenas trocadas entre as células / tecidos e espaço extracelular, mas também entre as células e tecidos dentro de organismos vivos. É importante combinar esta técnica com outros, tais como repórteres fluorescentes bioeletricidade, a fim de apreciar a resolução espacial dos fluxos de iões dentro de tecidos para além das medições reais dos fluxos de iões próximos à sua superfície. Além disso, os fluxos de iões representam uma parte importante do estado bioeléctrico que define as células e os tecidos em conjunto com o potencial de membrana celular, o potencial trans-epitélios ou correntes eléctricas extracelulares. É importante, para além da medição de fluxos de iões, para medir, em combinação, membrana celular e potencial trans-epitélios bem como extracelulares correntes eléctricas 24.

<html> Todas as células animais estão rodeados por uma membrana de bicamada lipídica que separa o citoplasma a partir do ambiente exterior. A célula mantém um potencial de membrana elétrica, negativa no interior, por transporte ativo de íons um. O potencial de membrana é uma fonte de energia que a célula pode utilizar para operar vários dispositivos moleculares na membrana 2. Neurônios e outras células excitáveis ​​têm grandes potenciais de membrana. Rápida abertura dos canais de sódio recolhe o potencial de membrana (despolarização) e produz o potencial de acção que é transportado ao longo do comprimento do neurónio 2. Aparte destas alterações eléctricos rápidos, muitos tecidos e órgãos gerar e manter potenciais eléctricos significativos a longo prazo. Por exemplo, a pele e os epitélios da córnea gerar e manter potenciais trans-epiteliais e correntes eléctricas extracelulares por bombagem de iões direccional (principalmente cloreto de sódio e) 3. tenda &quot;&gt; Enquanto as medições de corrente eléctrica extracelular endógena utilizando a sonda de vibração 4-6 e medições de membrana ou trans-epitelial potenciais utilizando o sistema de microeléctrodos 7-10 permitem a medição dos parâmetros eléctricos de membranas celulares e camadas de células epiteliais, eles não dão indicação da espécie iónicos envolvidos. Microeletrodos com ionóforo seletivo pode medir a concentração de íon específico em solução. Gradientes de iões ou de fluxo podia ser medido com dois ou mais eléctrodos em diferentes posições. No entanto, o desvio de tensão intrínseco de cada sonda seria diferente, fazendo medições imprecisas ou mesmo a detecção de um gradiente que não estava presente. Um único eletrodo usado em modo &quot;auto-referência&quot;, pelo qual ele se move em baixa frequência entre dois pontos resolve este problema. Agora o fluxo de iões pode ser visto no contexto de um relativamente lento e estável desvio de sinal (veja a Figura 3B). </p&gt; O sistema de medição sensível-ion utiliza microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo para detectar pequenos fluxos extracelulares de íons perto de tecidos ou células individuais. O sistema é composto por um amplificador que processa o sinal a partir do microeléctrodos e um motor passo a passo e micro controlador para controlar o movimento do microeléctrodo. O microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência que fecha o circuito está ligado ao amplificador de andar de entrada por meio de um pré-amplificador (Figura 1A). O software de computador determina os parâmetros do movimento de microeléctrodos (frequência, distância) e também regista a saída do amplificador. O motor de passo controla o movimento através de um microeléctrodo microposicionador tridimensional. A baixa freqüência de vibração de microeletrodos íon-seletivo foi desenvolvido pela primeira vez em 1990 para medir o fluxo de cálcio específica 11. Bem como cálcio, cocktails ionóforos comercialmente acessíveis estão agora disponíveis para fazer microelectrodes sensíveis ao sódio, cloreto, potássio, hidrogénio, magnésio, nitrato, amónio, fluoreto, lítio ou mercúrio. Basicamente, o ião-selectivo técnica de microeléctrodo auto-referenciar converte a actividade de um ião específico dissolvido numa solução para um potencial eléctrico, que pode ser medida por um voltímetro. O coquetel de ionóforo é um líquido imiscível (lipofílico orgânico,) fase com propriedades de permuta iónica. O ionóforo de complexos (se liga selectivamente iões específicos reversivelmente) e transfere-os entre a solução aquosa contida no microeléctrodo (electrólito) e a solução aquosa em que o microeléctrodo é imerso (Figura 1D). Esta transferência de iões leva a um equilíbrio electroquímica e uma variação do potencial eléctrico entre os microeléctrodos e o eléctrodo de referência é medido pelo voltímetro. A tensão é proporcional ao logaritmo da actividade específica de iões de acordo com a Nernst equation permitindo o cálculo da concentração de iões (Figura 2A e B). Actualmente, vários sistemas de permitir a medição do fluxo de iões utilizando um conceito ou princípio semelhante. Por exemplo, a técnica do eletrodo íon-seletivo Scanning (SIET) 12,13 ou o microeletrodos Ion Flux Estimação (MIFE) técnica desenvolvida por Newman e Shabala 14-16 estão comercialmente disponíveis e amplamente utilizado pela comunidade de investigação a fim de determinar íon específico fundentes ocorrendo a membrana da célula e do tecido através de uma variedade de animais, plantas e modelos de células de estar solteiro. Microeletrodos íon-seletivo têm sido usados ​​para medir hidrogênio, potássio e fluxo de cálcio através de raízes de plantas 17, cloreto de fluxo em artérias cerebrais de ratos 18 e em tubos polínicos 19, fluxo de hidrogênio em células da retina de skate 20, o fluxo de cálcio no osso do rato 21, vário íon fluxos em 22 de hifas fúngicas e no ra córnea 23, e, finalmente, o fluxo de cálcio durante a cura da ferida célula única 12,24. Veja também a seguinte análise para obter informações detalhadas sobre auto-referência microeletrodos íon-seletivo 25. O artigo a seguir descreve em detalhes como preparar e realizar a medição de fluxos de iões extracelulares endógenos utilizando a auto-referência técnica microeletrodos íon-seletivo no nível da célula única.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

As células de animais, plantas e células individuais são envolvidas por uma barreira chamada a membrana celular que separa o citoplasma a partir do exterior. Camadas de células, tais como os epitélios também formam uma barreira que separa o interior a partir do exterior ou diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Uma característica chave destas barreiras é a distribuição diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas de células. Duas propriedades permitem que esta distribuição: 1) membranas e epitélios exibir permeabilidade seletiva de íons específicos; 2) são transportados através de bombas de iões através das membranas celulares e camadas de células. Estas propriedades desempenham um papel crucial na manutenção da fisiologia do tecido e agir como sinalização sinais de avaria, durante o reparo, ou sob condição patológica. A auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões permite medições de fluxos de iões específicos, tais como cálcio, potássio ou sódio em níveis de células e tecidos individuais. O microeléctrodo contém um ionóforo que é cocktailselectivamente permeável a um ião específico. A solução de enchimento interno contém um conjunto de concentração do íon de interesse. O potencial eléctrico do microeléctrodo é determinada pela concentração do ião exterior. À medida que a concentração de ião varia, o potencial do microeléctrodo muda como uma função do log da actividade de iões. Quando mudou-se para trás e perto de uma fonte ou sumidouro de íon (ou seja, em um gradiente de concentração devido ao fluxo de iões) o potencial flutua microeletrodos a uma amplitude proporcional ao fluxo de iões / gradiente. O amplificador amplifica o sinal de microeléctrodos e a produção é registada no computador. O fluxo de iões pode então ser calculado pela lei de Fick da difusão utilizando a flutuação potencial de eléctrodo, a excursão de microeléctrodo, e outros parâmetros, tais como a mobilidade de iões específica. Neste artigo, descreve em detalhes a metodologia para medir fluxos de iões extracelulares utilizando a auto-referência de microeletrodos um íon-seletivod apresentar alguns resultados representativos.

Temos anteriormente demonstrado que o influxo de cálcio aparece depois de uma única célula ferindo 24. Nós, portanto, perguntado se outros fluxos de iões ocorrer após ferimento única célula. Utilizou-se o X. laevis oócito, um modelo bem estabelecido para única célula a cicatrização de feridas 30-34 e gravação eletrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, íons de potássio são mais concentrados dentro X. oócitos laevis (cerca de 110 mM) de 40 na solução extracelular utilizado (em MMR 1x: 1 mM), sugerindo um efluxo de potássio em cima do ferimento. A fim de confirmar a hipótese de que, medida que o fluxo de potássio durante o curso de X. laevis cura membrana celular de ovócitos utilizando a auto-referência de microeletrodos íon-seletivo. Para ferir o oócito, primeiro puxar um eletrodo capilar com um grande tamanho da ponta (~ 50 mm). Fixe o eletrodo para um suporte do eletrodo em linha reta e montar em um micro-posicionador manual. Ferida o oocyte tocando a membrana com a ponta do eletrodo 24. Logo após ferindo nós detectamos uma grande efluxo de potássio (até 250 nmol cm -2 s-1; Figura 3B - D). À medida que a membrana ferida curada, este fluxo reduzido, o retorno a valores de fluxo não ferida visto na membrana intacta (~ 5 nmol cm-2 s-1) quando a ferida cicatrizada (até 16 min após o ferimento; Figura 3B - D). ANCOVA revelou um efeito significativo de tempo após o ferimento em medições de fluxo de potássio (p &lt;0,001). Análises posteriores mostraram um aumento significativo no efluxo de potássio de 1-2 min (p ​​&lt;0,001) e em 5-6 minutos (p &lt;0,05), mas não em 15-16 min após o ferimento quando comparado com o estado da membrana celular intacta (Figura 3D). Concluiu-se que, após ferimento célula única, um efluxo de potássio aparece ao nível da ferida que diminuem dutocar o curso de cura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Íon </td><td> Ionóforo cocktail </td><td> Solução eletrolítica (100 mM) </td><td> Solução de referência (3 M) </td><td> Solução fonte artificial (1 H) </td></tr><tr><td> Ca 2+ </td><td> Cálcio Ionóforo I Cocktail A (cat # 21048) </td><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> KCl </td><td> CaCl 2 2H 2 O </td></tr><tr><td> Na + </td><td> Sódio Ionóforo II Cocktail A (cat # 71178) </td><td> NaCl </td><td> KCl </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> Cl - </td><td> Cloreto Ionóforo I Cocktail A (cat # 24902) </td><td> NaCl </td><td> CH 2 CO 2 K (Acetato de potássio) </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> K + </td><td> Potássio Ionóforo I Cocktail A (cat # 60031) </td&gt; <td> KCl </td><td> NaCl </td><td> KCl </td></tr><tr><td> H + </td><td> Hydrogen Ionóforo I Cocktail A (cat # 95291) </td><td> pH 7,0 </td><td> KCl </td><td> pH 4,0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Exemplos de cocktails ionóforos comumente usados ​​Também são mostradas as soluções adequadas para colocar nas microeletrodos, pois a fonte artificial e para realizar a calibração. Números de catálogo são da Sigma-Aldrich. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52782/52782fig1.jpg" /> Figura 1:. Microeléctrodos selectivo de iões (A) Representação esquemática do sistema de microeléctrodos auto-referenciar selectivo de iões. Microeletrodos (B) íon-seletivo. (C) do eletrodo de referência. (D) A troca iônica entre a solução externa ea microelectrode através do ionóforo. (E) Esquema da câmara de medição utilizado para X. laevis oócito. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52782/52782fig2.jpg" /> Figura 2: microeletrodos íon-seletivo de calibração, de origem artificial e de cálculo de fluxo (A) Calibração curva.. (B) A equação da curva de calibração e cálculo da concentração de iões. (C) Cálculo do fluxo de iões. Fluxo (D) Ion medidas a distâncias específicas da fonte artificial (KCl 1 M). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52782/52782fig3.jpg" /> Figura 3: Evolução do fluxo de potássio em X. laevis ferida oócito durante a cicatrização. (A) fotografia e ilustração da excursãodo microeléctrodo selectivo de iões na medição da concentração de iões X. laevis ferida ovócito; a linha tracejada entre &#39;&#39; a &#39;&#39; e &#39;&#39; V &#39;&#39; representa o eixo animal vegetal. (B) Ilustração da variação da concentração de ião potássio em X. laevis ferida oócito durante a cicatrização. (C) Dispersão (XY) gráfico que mostra a média e o erro padrão da medição de potássio fluxo ao nível da ferida em diferentes tempos durante X. laevis cicatrização de feridas oócito. (D) Boxplot medição de fluxo que mostra o nível de potássio no da ferida em diferentes tempos durante X. laevis oócito cicatrização de feridas (n = 16; valores de p indicadas as seguintes: *: p &lt;0,05; ***: p &lt;0,001).

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K visualizações.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Vídeo: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...