Agradecemos Marek Weiler para a realização dos experimentos fantasmas. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC Starting Grant 309.495: NeoNaNo), o Estado federado da Renânia do Norte-Vestfália (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), o alemão Ministério de Educação e Pesquisa (BMBF) (programas de financiamento do fígado Virtual (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), photonik Forschung Deutschland (13N13355)), a RWTH Aachen University (I 3 TM Fundo Semente), e Pesquisa da Philips (Aachen, Alemanha).

O protocolo contém uma descrição detalhada das seguintes etapas: Em primeiro lugar, os fantasmas ou ratos e a cama multimodal de rato são preparadas por imagiologia. Em seguida, uma pesquisa de corpo inteiro é adquirido no μCT. Posteriormente, o leito do mouse é transferido para a FMT onde duas varreduras são adquiridas (para cima e cabeça para baixo). Isto pode ser repetido para vários ratinhos em vários pontos de tempo. Após a conclusão da aquisição de dados, os dados precisam ser exportados e ordenadas para permitir a segmentação automática (o que exige uma licença de software Definiens), bem como a fusão de imagens e reconstrução de fluorescência (o que exige uma licença de software Imalytics pré-clínica). Finalmente é mostrado como os conjuntos de dados são multimodais e visualizado como órgãos são interactivamente segmentado para quantificar a biodistribuição de sondas fluorescentes. 1. Preparação Fantasma NOTA: Fantasmas são úteis para testar o sistema de imagem, mas também para determinar a calibração factor para uma nova sonda. <ol><li> Prepara-se uma solução de 200 ml de água, 2% de agarose, 1,8 g de TiO 2 em pó, 50 ul de azul de tripano. Depois de ferver, preencher a solução em uma forma retangular, aproximadamente, de 8 cm de comprimento, 3 cm de largura e 1,5 cm de altura. </li><li> Prepare várias inclusões fluorescentes no simulador usando pontas de pipeta, contendo uma mistura de fluorescência e agente de contraste μCT. Para criar as inclusões, corte as pontas de pipeta e selá-los com um isqueiro. </li><li> Depois que a solução solidificou, insira as inclusões no fantasma. Cortar algumas partes do phantom para alcançar uma forma irregular e para ajustá-lo ao titular multimodal mouse. </li><li> Para determinar o factor de calibragem para uma nova sonda, alguns scans fantasmas são necessários. Para isso, o fantasma FMT padrão é utilizado em combinação com quantidades conhecidas da sonda. Para uma maior precisão, adicionar 4% emulsão lipídica para a solução de receber o mesmo coeficiente de dispersão no interior da inclusão como noresto do fantasma. Também adicionar uma pequena quantidade (2%) de agente de contraste μCT para análise de imagem mais fácil. </li></ol> 2. Preparação do rato NOTA: μCT-FMT imagem requer uma preparação especial, incluindo anestesia e depilação. <ol><li> Posicione o mouse sobre alimentos sem clorofila 7 dias antes da imagem. Isto irá reduzir o sinal de fundo e é particularmente importante para os canais FMT abaixo de 750 nm. </li><li> Todas as experiências com animais são realizadas sob anestesia. Para iniciar a anestesia, colocar o rato numa câmara cheia com isoflurano a 2% em ar (caudal de 5 L / min) até o rato é adormecer. Confirme anestesia adequada por toe suave ou pele beliscar e verificando relaxamento do tônus ​​muscular (por exemplo., Músculo da mandíbula). Para manter a anestesia, continuar a aplicação isoflurano utilizando um tubo que é colocado sobre o nariz do rato (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min). A fim de evitar drynes olhos, use veterinário pomada em ratos anestesiados. </li><li> Para injetar agente de contraste, corrigir o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento usando fita. Coloque um (agulha de seringa ligada a um tubo) do cateter na veia da cauda e injectar o agente de contraste fluorescente (por exemplo, 2 nmol, com o volume máximo de injecção de 5 ml / kg de peso corporal, isto é, 150 ul para um ratinho de 30 g). </li><li> Para digitalizar um rato peludo, a área de digitalização tem de ser depiladas com antecedência. Para isso, use um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo. Algumas cepas de camundongos pode desenvolver erupções cutâneas do creme de depilação. Portanto, monitorar os ratos para alterações na pele e entre em contato com o pessoal veterinário para a assistência se necessário. Também testar a tolerância em um pequeno número de animais ao usar novas linhagens de camundongos. </li><li> Manter o rato anestesiado durante μCT e imagiologia FMT (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min). </li></ol> 3. Rato Bed Preparação NOTA: Para a digitalização μCT-FMT, use uma multimodalcama do mouse, que se encaixa tanto no μCT ea FMT. <ol><li> Antes de imagem, limpe o rato cama com tecidos molhados. Não use álcool, pois isso pode danificar o vidro acrílico. Certifique-se de que os marcadores são livres de água, pois isso pode prejudicar a detecção do marcador automatizado. </li><li> Abra os parafusos da cama multimodal mouse e remover a parte superior. </li><li> Fixe o tubo de gás anestésico na cama mouse e fixar-lo com fita adesiva. </li><li> Posicione o mouse anestesiados para o leito do mouse e colocar o nariz para dentro do tubo de gás. Certifique-se a cabeça do rato é o indicador de frente da cama do mouse (Figura 1). </li><li> Certifique-se de que o ratinho está no meio do leito de rato para utilizar de forma óptima o campo de visão da FMT. </li><li> Feche a cama do mouse e apertar os parafusos até que o mouse é bem realizada. Verifique se o mouse pode respirar de forma constante pelo monitoramento visual dos movimentos respiratórios torácicos. </li></ol> 4. μCT Imaging NOTA: uma pesquisa de corpo inteiro é realizado usando o μCT. Os dados anatómica gerado é necessária para a fusão de imagens, para uma melhor reconstrução de fluorescência e para análise de imagem. <ol><li> Coloque a cama do mouse com o mouse para o μCT. Certifique-se de que o mouse é colocado de uma forma que ele vai &quot;cauda-primeiro&quot; no μCT. Isto é importante para a fusão automatizado. </li><li> A fim de manter a anestesia quando o μCT-tampa está fechada, volte a ligar os tubos para canalizar o gás através do caso do μCT. Primeiro retire o tubo longo do leito do mouse e anexá-lo ao conector na parte externa do μCT. Em seguida, ligue a extremidade livre restante ao conector dentro do μCT. </li><li> Dirija a cama do mouse na μCT. Certifique-se de que o tubo do gás não está solto e não pode ser pego pelo pórtico rotativo. Se necessário, fixam-o com fita adesiva. Insira o tubo no cut-out do titular da cama mouse. </li&gt; <li> Feche a μCT e adquirir uma topograma. Seleccionar pelo menos dois subscans para cobrir uma parte substancial do rato e do leito do rato, o que é importante para a fusão e reconstrução. </li><li> Selecione o protocolo de digitalização μCT chamado HQD-6565-360-90, que adquire 720 projeções com 1032 x 1012 pixels, durante uma rotação completa que exige um tempo de leitura de 90 s por subscan. Tubos são operados com tensão de 65 kV e corrente de 1,0 mA. Como alternativa, para reduzir a duração da dose de radiação e digitalização, selecione o protocolo de digitalização SQD-6565-360-29 que adquire 720 projeções com 516 x 506 pixels com o tempo de digitalização 29 s por subscan. </li><li> Inicie a digitalização μCT. A barra azul indica o progresso. Os subscans serão adquiridas posteriormente. Hipotermia e perda de fluido não são um problema por causa da duração da verificação curta de apenas alguns minutos. Não abra a tampa do μCT durante a verificação, porque isso irá interromper automaticamente a digitalização para proteger o usuário deradiação. </li><li> Quando a análise é completada, abra a tampa, volte a ligar o tubo anestésico e retire a cama do rato do suporte para transportá-lo para a FMT. </li></ol> 5. FMT Imagem NOTA: Imediatamente após a digitalização μCT, o rato é digitalizado na FMT em duas configurações (para cima e cabeça para baixo) que são usados ​​em conjunto para uma melhor reconstrução de fluorescência. <ol><li> Ligar o fornecimento de gás anestésico (isoflurano a 2% em ar, caudal de 1 L / min) para o FMT antes de colocar a cama do rato para a FMT. Usando o software de controle FMT, criar um grupo de estudo com um número adequado de sujeitos (ou seja, os ratos). Selecione as sondas que serão utilizados para a imagem latente (uso OsteoSense para novas sondas que não estão listadas). </li><li> Leve a cama multimodal do mouse com o mouse para a FMT. O tubo do gás anestésico de longa flexível mantém o fluxo de gás. Antes de inserir o leito do mouse na FMT, remova cuidadosamente o tubo, uma vez quenão é necessária dentro da FMT. Evite os parafusos da cama mouse. </li><li> Coloque a cama do mouse na FMT com o indicador vermelho primeiro (&quot;head-first&quot;). Isto é importante para a fusão de imagens para ser consistente com o μCT. </li><li> Feche a FMT. </li><li> Selecione o grupo de estudo correta e assunto. Selecione o canal desejado da FMT (para OsteoSense 750EX, usar o canal 750 nm). </li><li> Adicione uma descrição, por exemplo., &quot;Para cima&quot; ou &quot;para baixo&quot; e adquirir uma visão geral de digitalização pressionando &quot;Capture&quot;. Esta captura uma imagem de reflectância de todo o campo de vista. Certifique-se de não ter &quot;reflectância Images Only&quot; selecionado, porque caso contrário não é possível adquirir 3D verifica posteriormente. </li><li> Ajustar os parâmetros de imagem para a digitalização 3D. Ampliar o campo de visão para incluir o máximo possível do mouse. Geralmente, a cabeça e cauda não inteiramente encaixar-se no campo de vista, no entanto. Clique em &quot;Avançado221; e verifique as configurações de imagem. Definir densidade de amostragem a 3 mm, sensibilidade ao min / max normal e iluminação para 5000 e 50.000, respectivamente. </li><li> Clique em &quot;Adicionar à fila reconstrução&quot; e clique em &quot;Scan&quot; para iniciar a digitalização FMT. Isto levará cerca de 5 a 15 minutos, dependendo do tamanho e espessura do rato, porque os tempos de exposição mais longos são necessários para os objectos mais espessos. O dispositivo contém uma câmara de imagem aquecido para evitar a hipotermia. </li><li> Após a verificação, virar a cama do mouse incluindo o mouse de cabeça para baixo e adquirir outra digitalização. Isso fornece dados adicionais para a reconstrução de fluorescência. </li><li> Quando o μCT e os FMT-varreduras são concluídas eo rato acorda da anestesia, não deixá-lo sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente, por exemplo, para passear ou para manter decúbito esternal. </li></ol> 6. Imagem Fusão e Reconstrução NOTA: Depoisconclusão da digitalização μCT-FMT, por exemplo, no final do estudo, a aquisição de dados tem de ser resolvida para permitir a fusão de imagens e de reconstrução de fluorescência automatizada. <ol><li> Para classificar os exames para posterior processamento, crie uma pasta para o estudo. Para cada varredura μCT-FMT, crie uma subpasta cujo nome contém a identificação do mouse, o ponto de tempo, por exemplo., M01_02h. </li><li> Para cada μCT-FMT varredura, exportar os scans FMT (para cima e para baixo) como .fmt arquivos e guardá-los para a subpasta usando nomes de arquivos que terminam com o &quot;_up.fmt&quot; ou &quot;_down.fmt&quot;. Cada arquivo .fmt contém os dados brutos adquiridos, ou seja, as imagens de excitação e emissão adquiridos pela câmara, os metadados, tais como os tempos de exposição, bem como a reconstrução de fluorescência gerada pela FMT. </li><li> Usando o software μCT, criar uma reconstrução com o tamanho do voxel isotrópico de 35 mm. Selecione um kernel reconstrução liso (T10). Ajuste o campo de visão de modoque todo o leito do rato, incluindo os marcadores é coberto. Selecione MIFX / RAW como formato de saída e começar a reconstrução. Após a reconstrução é feita, mova os arquivos de reconstrução μCT para a subpasta da digitalização μCT-FMT. </li><li> Exportar os dados μCT e FMT para todas as digitalizações. Certifique-se de que cada subpasta contém dois arquivos .fmt (para cima e para baixo) e à reconstrução μCT na / formato RAW MIFX. Para verificar a integridade selecionar Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Verificar Integridade usando o software Imalytics pré-clínica. Uma lista de erros podem aparecer, como falta .fmt arquivos ou reconstruções μCT. Corrigir os erros e verificar se há integridade até que todos os erros sejam resolvidos. </li><li> Usando Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Configurações, verifique o nome do servidor do software Definiens e ajustar, se necessário. O padrão é http: // localhost: 8184, assumindo que o software Definiens está instalado no mesmo computador. O software Definiens é necessária no passo seguinte para realizar o ausegmentação tomated da cama mouse e marcadores. </li><li> Clique Menu-&gt; CT-FMT-&gt; grupo de fusível no software Imalytics pré-clínica para realizar a fusão automatizado μCT-FMT para o estudo inteiro. Isso leva alguns minutos por μCT-FMT digitalizar e resulta em uma pasta com o sufixo &quot;Pacote&quot; paralela para a pasta estudo. Este contém um subconjunto menor de arquivos (os dados μCT ea FMT reconstrução fornecido pelo fabricante fundido) que são relevantes para uma análise mais aprofundada. </li><li> Clique Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Reconstruçã grupo (FMT) no software Imalytics pré-clínica para executar a reconstrução de fluorescência, incluindo a geração de mapas de absorção e de difusão 13. Mesmo que o processamento é acelerada por GPU 20, cada reconstrução requer 1 a 4 horas, dependendo do tamanho do rato. Os resultados será armazenado na pasta pacote. Nota: Para permitir um caudal superior, que atualmente executar essas reconstruções em um cluster GPU com 56 GPUs. </li&gt; </ol> 7. Análise de Imagem NOTA: Para extrair medições quantitativas a partir dos dados da imagem, é necessário segmentação de lesões e órgãos. <ol><li> Uma vez que todos os conjuntos de dados são fundidos e reconstruídos, criar uma segmentação para cada μCT-FMT digitalizar utilizando o software Imalytics pré-clínica. </li><li> Carregue um arquivo μCT como underlay eo arquivo de fluorescência como sobreposição. Pressione o botão &quot;3D&quot; para ligar a renderização de volume e inspecionar o conjunto de dados. </li><li> Para o segmento de pulmão, clique em Menu-&gt; classes:&gt; Adicionar classe e criar uma classe chamada &quot;tmp&quot;. Isso também pode ser feito através do menu de contexto. Criando uma nova classe define automaticamente como classe de saída para as operações de segmentação subsequentes. <ol><li> Executar uma operação de limiar para o segmento todas as regiões com baixa intensidade no conjunto de dados μCT (clique Menu-&gt; Segmentation-&gt; Thresholding-&gt; Abaixo e digite 600). Agora a classe tmp contém o ar fora do mousar, mas também o tecido pulmonar. </li><li> Crie uma classe de &quot;pulmão&quot;. Executar uma &quot;Encha Região&quot; operação (botão direito do mouse no pulmão e selecionar Menu-&gt; Preencher Região-&gt; Preencher região ilimitado), para separar o pulmão do ar exterior. </li><li> Excluir a classe tmp, pois não é mais necessário. </li></ol></li><li> Para regiões convexas segmento, por exemplo., A bexiga, utilize o modo rabisco. Primeiro, crie uma &quot;bexiga&quot; classe. <ol><li> Pressione F1 para excluir todos os rabiscos. </li><li> Usando o rato do computador, desenhar rabiscos para delinear as fronteiras da bexiga. </li><li> Pressione F3 para preencher a região delimitada pelos rabiscos com uma máscara temporária que aparece como sobreposição de vermelho. Iterativamente adicionar mais rabiscos (em qualquer orientação slicing) e pressione F3 até que uma precisão suficiente é alcançada. Tipicamente, rabiscos em 10 fatias são suficientes. </li><li> Pressione F4 para armazenar a máscara temporária como &quot;bexiga&quot;. </li><li> Proceda assim para o segmentooutras regiões convexas, tais como o coração e os rins. Muitas regiões, por exemplo., O estômago ou o fígado, pode ser aproximada por algumas regiões convexas. </li></ol></li><li> Para segmento da coluna vertebral, primeiro crie uma classe &quot;Bone&quot;. <ol><li> Escolha ContextMenu-&gt; Thresholding-&gt; acima para executar uma operação de limiar para classificar todos os voxels brilhante (por exemplo., Acima de 1600) como &quot;osso&quot;. </li><li> Uma operação de enchimento região não seria suficiente para segmento da coluna vertebral, porque está ligada com muitas outras partes do esqueleto, por exemplo., As nervuras. Executar algumas operações de corte por iterativamente desenho rabiscos e pressionando F2 para separar a espinha do crânio, as costelas, e o osso sacro. </li><li> Finalmente, criar uma classe &quot;Spine&quot; e realizar uma operação de enchimento região para obter a coluna vertebral (botão direito do mouse na coluna e selecionar ContextMenu-&gt; Preencher Região-&gt; Preencher região ilimitado). </li></ol></li><li> Salve a segmentação como um arquivo dentro the subpasta da varredura μCT-FMT. Use um nome consistente, por exemplo, organs.seg, para permitir o processamento em lote. </li><li> Selecione Menu-&gt; Estatísticas-&gt; Class estatísticas (overlay), para gerar uma planilha que contém a intensidade de fluorescência média, o volume eo valor total (produto de média e volume) para cada classe. </li><li> Para gerar uma única planilha que contém os valores para todas as regiões de todos os rastreamentos μCT-FMT, clique em Menu-&gt; batch-&gt; Definir configurações em lote e clique em Menu-&gt;&gt; batch- estatísticas lote. Isso evita o esforço de criar e fundir muitas limas de planilha, ou seja, um para cada varredura μCT-FMT. </li></ol> 8. Calibração Probe <ol><li> Para calcular o fator de calibração de uma sonda, várias varreduras fantasmas μCT-FMT são obrigatórios diferentes quantidades conhecidas de sonda (veja o passo 1.4), por exemplo., Com 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol e 0 pmol. </li><li> Digitalizar os fantasmas como descrito noseções 4 e 5. Também para varreduras fantasmas, para cima e para baixo scans na FMT são obrigatórios. </li><li> Exportar os dados e realizar a fusão e reconstrução conforme descrito no capítulo 6. </li><li> Segmento a inclusão usando os dados μCT para cada varredura por limiarizar (acima de 1200) e enchimento região. </li><li> Gerar uma planilha com os valores de fluorescência medidos e traçar-los em função das quantidades conhecidas. Calcular a inclinação de um ajuste de regressão linear. Este é o factor de calibração para a sonda. </li></ol>

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M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+with+optics:+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine.">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).</li></ol>

Felix Gremse é fundador e proprietário da Gremse-IT, uma empresa iniciante que oferece software e serviços para análise de imagem médica em cooperação com a Philips e do Departamento de Experimental Imagem Molecular da Universidade RWTH Aachen.

Nós descrevemos e aplicar um protocolo para multimodal imagem μCT-FMT. Nós usamos comercialmente disponível e amplamente utilizado FMT e dispositivos μCT 3,11,15 - 17,21. Embora o protocolo requer uma FMT específico, o μCT pode ser substituído por outro μCT com funcionalidade semelhante e os parâmetros de digitalização comparáveis, por exemplo, o campo de visão deve ser suficientemente grande para cobrir a cama de rato, incluindo os marcadores. A FMT foi usado para a análise de biodistribuição sem combinando-o com μCT ou ressonância magnética 21, no entanto, os dados anatómica é benéfica para aumentar a reprodutibilidade porque a segmentação pode basear-se nos limites de órgãos que são visíveis nos dados μCT 10. Embora os dispositivos μCT-FMT integrados foram desenvolvidos 2,7, estes ainda não estão disponíveis comercialmente. Além disso, a utilização de dois dispositivos separados permite tubagem, isto é., A próxima ca raton ser trabalhada na μCT enquanto o primeiro ratinho ainda está no FMT, para aumentar o rendimento. Para reduzir a carga de trabalho manual, realizar a detecção de marcador automatizado e de fusão. Além disso, a forma do rato é automaticamente segmentado e esta informação melhora significativamente a reconstrução 11,13,22 fluorescência. Para a reconstrução de fluorescência quantitativa, mapas absorção e espalhamento são necessários 13,23. Obtivemos o mapa de dispersão por segmentação automatizada dos dados μCT e atribuir coeficientes de dispersão conhecidos de vários tipos de tecidos (pulmão, ossos, pele, gordura, e restantes tecidos moles) 24. Posteriormente, reconstruir um mapa da absorção a partir dos dados em bruto óptico que é particularmente importante para os órgãos perfundidos bem como o coração e o fígado 13,20. Digitalizar vários ratos em vários pontos de tempo rapidamente resulta em um grande número de conjuntos de dados a serem analisados. Para BIODIStribuição estudos, vários órgãos precisam ser segmentados para cada varredura μCT-FMT. Infelizmente, as segmentações não pode ser reutilizado, porque o rato foi recentemente posicionado no leito rato repetidamente. Nós usamos uma ferramenta de segmentação interativo, desenvolvido no nosso instituto, no entanto, outras ferramentas pode também ser apropriada 25. Geramos segmentações baseada em voxel, porque estes corresponder melhor aos órgãos complexos do que formas simples, como elipses e cubos 26. Segmentação de todo animal automatizado seria útil para reduzir ainda mais a carga de trabalho manual de 27, mas uma ferramenta de segmentação interativa ainda seria necessário para corrigir erros de segmentação. Além disso, ferramentas de segmentação automatizados dificilmente pode antecipar casos especiais, tais como patologias corretamente. Desde que nós usamos varreduras μCT nativos, alguns órgãos como o baço são muito difíceis de segmento mesmo manualmente. Os agentes de contraste ajudaria, mas existem problemas com a tolerância e que é difícil de manutenna distribuição de agente de contraste constante ao longo do imaging longitudinal. O nosso estudo mostra que fantasma a localização do sinal é melhorado quando se usa a informação da forma de reconstrução por fluorescência. In vivo, a uma melhoria semelhante é evidente para o ponto de tempo inicial (15 minutos após a injecção), quando uma grande quantidade da sonda já está no bexiga urinária. A sonda de ligação hidroxiapatita acumula em ossos e articulações. É notável que esta rápida ocorre, por exemplo, o sinal já é claramente visível na coluna 15 minutos após a injecção. Isto é provavelmente causado pela baixa peso molecular da sonda, o que permite o extravasamento rápido e difusão para as regiões alvo. A sonda se liga covalentemente a sua hidroxiapatita alvo e a sonda não ligada é excretado. Para os pontos de tempo posteriores, entre 6 h e 24 h após a injecção, a intensidade do sinal na coluna vertebral permanece relativamente estável, provavelmente, porque praticamente nenhuma luz redói profundamente o mouse para branquear a fluorescência. Para nosso estudo, usamos o canal 750 nm, o que resulta em baixa fluorescência de fundo, como é evidente para os exames adquiridos antes da injeção. Em comprimentos de onda mais baixos, mais sinal de fundo pode ser esperado 28. Em resumo, nós descrevemos um protocolo de imagem multimodal para comercialmente disponíveis dispositivos FMT e μCT. Mostra-se que a combinação proporciona benefícios para a reconstrução de fluorescência. Nós ilustrar como as curvas de biodistribuição são extraídos a partir da grande quantidade de dados de imagem por meio de segmentação órgão interactivo, e o processamento em lote. Acreditamos que este fluxo de trabalho padronizado pode ser útil para o desenvolvimento de medicamentos e de outros estudos de imagem utilizando sondas com marcação fluorescente.

Tomografia mediada por fluorescência, tomografia molecular também chamado de fluorescência (FMT), é uma técnica promissora para avaliar quantitativamente a distribuição nos tecidos de fluorescência difusa, tais como ratinhos anestesiados ou mesmo tecidos do corpo humano, por exemplo, seios ou articulações dos dedos. Em contraste com técnicas de microscopia não-invasivos, que permitem imagens de metas superficiais no subcelular resolução 1, FMT permite a reconstrução tridimensional das fontes fluorescentes em profundidades de vários centímetros, embora em menor resolução 2. Muitas sondas fluorescentes estão disponíveis para segmentados angiogénese imagem, apoptose, inflamação, e outros 2-5. Algumas sondas são activável, por exemplo., Por clivagem enzimática específico levando a unquenching de fluorocromos. Além disso, os genes repórter que expressam proteínas fluorescentes pode ser trabalhada, por exemplo, para controlar a migração de células tumorais 6. FMT beneficia fortemente a partir da combinação com uma modalidade anatômica, por exemplo, μCT 2,7 ou ressonância magnética 8. Embora os dispositivos FMT autônomos estão disponíveis comercialmente 9, as imagens de fluorescência são difíceis de interpretar sem informações de referência anatômica. Recentemente fomos capazes de mostrar que os dados de imagem anatômica fundido permite uma análise mais robusta 10. Os dados anatómicas também pode ser utilizado para proporcionar conhecimento anterior, tais como a forma exterior do rato, o que é importante para a modelação exacta óptica e fluorescência reconstrução 11. Além disso, os mapas de dispersão e de absorção óptica pode ser estimada utilizando a segmentação dos tipos de tecido e através da atribuição de coeficientes específicos de classe 12,13. Para luz infravermelha, a hemoglobina é o principal absorvedor em camundongos, além de melanina e pele 14. Uma vez que o volume de sangue relativa varia regionalmente por ordens de magnitude, um mapa de absorção é particularmente importante para quanquan- fluorescência reconstrução 13. Uma vantagem da utilização de dispositivos de imagem não invasivas é que os ratinhos podem ser visualizados longitudinalmente, isto é, em vários pontos de tempo. Isso é importante para avaliar o comportamento dinâmico de sondas, ou seja, a sua acumulação alvo, biodistribuição e excreção 10,15, ou para avaliar a progressão da doença 16. Quando imagiologia de vários ratinhos em vários pontos de tempo, uma grande quantidade de conjuntos de dados de imagem se levanta. Para ativar a comparabilidade, estes devem ser adquiridos de forma sistemática, ou seja, com um protocolo bem definido e documentado. O grande número de verificações, representa um desafio para a análise de imagem, que é necessária para extrair as medições quantitativas a partir dos dados da imagem. O objetivo do nosso estudo é fornecer uma descrição detalhada de um protocolo de imagem μCT-FMT que foi usado e aperfeiçoado ao longo de vários estudos 10,13,15,17,18. Nós descrevemoscomo os conjuntos de dados são gerados, processada, visualizada e analisada. Isto é demonstrado usando uma sonda molecular estabelecido, OsteoSense, que se liga a hidroxiapatita 19, e pode ser usada para doenças do osso e remodelação imagem 2. Todos os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo comitê de revisão governamental sobre cuidados com animais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>FMT2000</td>
			<td>Device for fluorescence molecular tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;CT (micro computed tomography) Tomoscope Duo</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Tomoscope Duo</td>
			<td>Device for micro computed tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimodal Mouse Bed</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Partially transparent animal holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>Isoflurane Inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia system</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>726419</td>
			<td>Complete Isoflurane Table-Top System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyll-free mouse food</td>
			<td>Ssniff</td>
			<td>E15051</td>
			<td>low chlorophyll / low fluorescence food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 750EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10053EX</td>
			<td>Animal FMT contrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Fine Bore Polythene Tubing</td>
			<td>Smith medical</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>Tube for injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican 30g</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Hypodermic needle for catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imeron</td>
			<td>Altana pharma</td>
			<td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td>
			<td>CT contrast agent for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90-12-36-6</td>
			<td>Agarose for phantom production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1900,1000</td>
			<td>Titanium oxyde as phantom scattering agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93595</td>
			<td>Trypan blue to adjust phantom light propagation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy7</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>15020</td>
			<td>Fluorochrome for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipovenoes 20%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3094740</td>
			<td>Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Definiens Developer XD Server</td>
			<td>Definiens AG</td>
			<td>Server XD</td>
			<td>Software platform for automated segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalytics Preclinical</td>
			<td>ExMI/Gremse-IT</td>
			<td>Version 2.0.1</td>
			<td>Software for image fusion, reconstruction and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVIDIA Geforce Titan</td>
			<td>Asus</td>
			<td>GTXTITAN6GD5</td>
			<td>High end computer graphics card, 6GB Memory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid &#181;ct-fmt imaging and image analysis

Tomografia mediada por fluorescência (FMT) permite a determinação quantitativa longitudinal e da distribuição de fluorescência in vivo e pode ser utilizado para avaliar a biodistribuição de novas sondas e para avaliar a progressão da doença, utilizando sondas moleculares estabelecidas ou genes repórter. A combinação com uma modalidade anatómica, por exemplo, tomografia computadorizada micro (μCT), é benéfico para a análise de imagens e de reconstrução de fluorescência. Nós descrevemos um protocolo para multimodal imagem μCT-FMT incluindo as etapas de processamento de imagem necessários para extrair medidas quantitativas. Depois de preparar os ratos e executar a imagem latente, os conjuntos de dados multimodais são registrados. Subsequentemente, uma melhor reconstrução de fluorescência é realizada, o que leva em conta a forma do rato. Para a análise quantitativa, segmentações de órgãos são geradas com base nos dados anatómicas utilizando a ferramenta de segmentação interactivo. Finalmente, o Cu biodistribuiçãorves são gerados usando um recurso de processamento em lote. Mostramos a aplicabilidade do método de avaliar a biodistribuição de uma sonda bem conhecida que se liga aos ossos e articulações.

Aplicou-se o protocolo descrito para avaliar a biodistribuição de uma sonda, OsteoSense alvo, que se liga a hidroxiapatita. 3 ratinhos (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - ratos knockout duplas, 10 semanas de idade) foram fotografadas antes e 15 minutos, 2 h, 4 h, 6 h e 24 h após injecção intravenosa de 2 nmol OsteoSense. O nosso software detectado automaticamente os marcadores construídas no leito rato multimodal (Figura 1, Figura 2A, B), o que permitiu a fusão dos dados μCT anatómicas com a reconstrução da fluorescência realizada pela FMT (Figura 2C, D). Desde OsteoSense é uma sonda com um baixo peso molecular, uma rápida excreção renal e, por conseguinte, o sinal de alta na bexiga urinária é esperado. Fusão de fluorescência a reconstrução da FMT revelaram problemas tais como sinal deslocado fora da bexiga (Figura 2C, D). Esses problemas ocorrem porque a FMT não sabe a verdadeira forma do mouse e assume uma forma de bloco. Our reconstrução determina a forma exacta dos dados e gera μCT dispersão e absorção mapeia 13, a fim de permitir uma reconstrução de fluorescência mais precisa com uma melhor localização do sinal, que é particularmente evidente para a bexiga (Figura 2E, F). Para atribuir a fluorescência reconstruída para regiões apropriadas, nós interativamente segmentado vários órgãos que utilizam nosso software (Figura 3). Para cada um dos 18 varreduras, 7 regiões foram segmentadas com base nos dados μCT, isto é., Coração, pulmão, fígado, rins, da coluna, do intestino e da bexiga. Subsequentemente, o software foi utilizado para calcular a concentração de fluorescência média para cada uma das regiões 126. Felizmente, o software fornece um modo de lote, que calcula todos os valores e os salva em uma única planilha. Para visualizar a distribuição de fluorescência, de desenhos em 3D foram gerados para cada ponto de tempo,usando a configuração de janelas comparável (Figura 4A-F). Utilizando os valores quantificados de órgãos, a biodistribuição foi calculado pela média dos valores durante os três órgãos ratinhos (Figura 4G). Os exames pré, adquiridos antes da injeção, mostrou sinal de fundo insignificante. 15 min após a injecção, o sinal mais forte apareceu na bexiga urinária, devido à rápida excreção renal. Nos pontos de tempo subsequentes, a sonda restante tinha acumulado em ossos e articulações. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> Figura 1. Multimodal Rato Bed. (A) A cama multimodal rato contém duas placas de vidro acrílico que firmemente segurar o mouse. O aperto é ajustado através de dois parafusos. A cama do mouse contém marcadores (buracos vazios) para a fusão de imagens. Gás anestésico é fornecido através de um tubo flexível que é fixado com tmacaco. (B) A cama do rato está ligado a um suporte de metal e mantido no centro do pórtico μCT rotativa. (C) evitar um hiato entre a cama do mouse, o titular do metal, porque, caso contrário, os marcadores podem ser incorretamente atribuído levando a fusão incorreta. O tubo do gás anestésico deve ser ligado ao conector do tubo. (D) A cama do rato deverá ser inserido na parte da frente com FMT primeiro para permitir uma fusão automatizado correcta. (E) Os marcadores são visíveis para a câmera FMT, que é usado para a detecção do marcador automatizado e de fusão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem de fusão e reconstrução. (A, B) Marcadores e a forma exterior do mouse é determinado pelo algoritmo de segmentação automatizado. (C, D) 15 min após a injecção de OsteoSense, uma quantidade considerável de a sonda já foi excretado para dentro da bexiga urinária. Após a fusão da reconstrução fornecido pelo fabricante com os dados μCT, os problemas tornam-se visíveis. A maior parte do sinal aparece em torno da bexiga, mas não dentro da bexiga e alguns mesmo sinal aparece no ar. Isso acontece porque a FMT assume um mouse em forma de bloco. (E, F) Nossa melhorada reconstrução de fluorescência, usando a forma do rato derivada dos dados μCT, resulta em melhor localização da fluorescência dentro da bexiga. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> Figura 3. Órgão interactivo Segmentat. ion (A) Para quantificar a distribuição de fluorescência, vários órgãos são segmentadas: coração (vermelho), pulmão (rosa), fígado (marrom), estômago (bege), coluna vertebral (roxo), rins (amarelo), intestino (verde) e bexiga urinária (ouro). (B) O pulmão, o que é fortemente contrastada em comparação com o tecido circundante, é segmentada com limite de enchimento e região. (C) Adesivo órgãos, tal como a bexiga, rins, coração e são segmentados usando &quot;rabiscos&quot;. (D) Os órgãos com uma forma mais complexa, por exemplo, fígado e estômago são segmentadas incrementalmente utilizando rabiscos. Para segmento da coluna vertebral, um limiar alto é aplicado ao segmento de todos os ossos. Em seguida, alguns ossos, por exemplo., As costelas, são cortados, até a coluna vertebral permanece. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. A biodistribuição. Para avaliar a biodistribuição, os ratinhos são verificados em vários pontos temporais (AF). (A) O exame de pré, antes da injecção, mostra pouco sinal de fundo no canal de 750 nm. (B) 15 min após a injecção, uma quantidade considerável de a sonda já está na bexiga urinária. (C) No ponto de tempo de 2 h, o rato tinha urinou, o que resulta em alguma fluorescência fora do rato. Em pontos de tempo posteriores (DF), o sinal aparece predominantemente nos ossos e articulações, isto é., A coluna vertebral e os joelhos. (G) A concentração de fluorescência quantificado é mostrado para órgãos seleccionados.

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Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

13.1K visualizações.  RWTH Aachen University. We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Vídeo: Hybrid  µCT-FMT imaging and image analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Bioengenharia

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Imagem Domínio óptico Freqüência de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonares espécimes de ressecção: Obtenção de One to One Imagem para Histopatologia Correlação

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Levitação magnética Juntamente com imagem Portátil e Análise para a doença Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

Quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem Serial

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Imagem e quantificação da área de microbolhas em movimento rápido usando uma câmera de alta velocidade e análise de imagem

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...