This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.

<ol>
	<li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+clinical+study+for+quantitative+spectral+diagnosis+of+non-melanoma+skin+cancer.">Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer.</a> Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).</li><li>Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advancements+in+the+use+of+high-resolution+microendoscopy+for+detection+of+gastrointestinal+neoplasia.">Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).</li><li>Chang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+microendoscopy+for+classification+of+colorectal+polyps.">High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps.</a> Endoscopy. 45, 553-559 (2013).</li><li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+oral+neoplasia+with+a+high-resolution+fiber-optic+microendoscope.">Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope.</a> Head Neck. 34, 305-312 (2011).</li><li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).</li><li>Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proflavine+Hemisulfate+as+a+Fluorescent+Contrast+Agent+for+Point-of-Care+Cytology.">Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology.</a> PLoS One. 10, e0125598 (2015).</li><li>Parikh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+diagnostic+accuracy+of+high+resolution+microendoscopy+in+differentiating+neoplastic+from+non-neoplastic+colorectal+polyps:+a+prospective+study.">In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study.</a> Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).</li><li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+high-resolution+microendoscopic+images+for+diagnosis+of+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).</li><li>Prieto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+comparison+of+colonic+microendoscopy+image+features+to+histopathology.">Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology.</a> Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).</li><li>Greening, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-bundle+microendoscopy+with+sub-diffuse+reflectance+spectroscopy+and+intensity+mapping+for+multimodal+optical+biopsy+of+stratified+epithelium.">Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium.</a> Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).</li><li>Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+effects+of+microvasculature+pigment+packaging+on+in+vivo+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy.</a> Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).</li><li>Spliethoff, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+tumor+response+to+cisplatin+using+optical+spectroscopy.">Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy.</a> Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).</li><li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+physiology+of+the+precancerous+cervix+in+vivo+through+optical+spectroscopy.">Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy.</a> Neoplasia. 11, 325-332 (2009).</li><li>Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+reflectance+spectroscopy+of+epithelial+tissue+with+a+smart+fiber-optic+probe.">Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe.</a> Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).</li><li>Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+probe+geometry+and+optical+properties+on+the+sampling+depth+for+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy.</a> J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).</li><li>Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polarized+multispectral+imaging+system+for+quantitative+assessment+of+hypertrophic+scars.">A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars.</a> Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).</li><li>Vasefi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization-sensitive+hyperspectral+imaging+in+vivo:+a+multimode+dermoscope+for+skin+analysis.">Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li><li>Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+tool+for+rapid+disease+mapping+using+optical+coherence+tomography+images+of+azoxymethane-treated+mouse+colon.">Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon.</a> J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).</li><li>Bish, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handheld+Diffuse+Reflectance+Spectral+Imaging+(DRSi)+for+in-vivo+characterization+of+skin.">Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin.</a> Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).</li><li>Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Absorption of Hemoglobin. , (1999).</li><li>Rajaram, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+clinical+instrument+for+spectral+diagnosis+of+cutaneous+malignancy.">Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy.</a> Appl Opt. 49, 142-152 (2010).</li><li>Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+one-layer+assumption+on+diffuse+reflectance+spectroscopy+of+skin.">Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin.</a> J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).</li><li>Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lookup+table-based+inverse+model+for+determining+optical+properties+of+turbid+media.">Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media.</a> J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).</li><li>Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+lookup+table-based+approach+for+measuring+tissue+optical+properties+with+diffuse+optical+spectroscopy.">Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy.</a> J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).</li><li>Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , 1-37 (2015).</li><li>Karsten, A. E., Smit, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+verification+of+melanin+concentration+on+human+skin+type.">Modeling and verification of melanin concentration on human skin type.</a> Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).</li><li>Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+changes+in+the+hemoglobin+concentration+of+skin+with+total+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy.</a> J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).</li><li>Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe+pressure+effects+on+human+skin+diffuse+reflectance+and+fluorescence+spectroscopy+measurements.">Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements.</a> J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> A imagem de alta resolução e multimodal microendoscope fibra feixe espectroscopia de reflectância difusa sub-relatada aqui pode ser optimizado e utilizado pelos investigadores para uma variedade de aplicações, incluindo o uso manual ou endoscópico para estudos em seres humanos ou animais. Assim, fornece um método flexível para visualização in vivo do tecido micro-arquitetura apical juntamente com medições de concentração de hemoglobina, concentração de melanina, e saturação de oxigênio nos tecidos de duas profundidades de tecido diferentes. Este artigo descreve as especificações para a sonda de fibra óptica, delineou um protocolo para a montagem do sistema de imagem de alta resolução e sistema de imagens de reflectância sub-difusa, e mostrado a sua aplicação em tecidos humanos in vivo, usando a tinta piranina como o agente de contraste fluorescente para visualização do tecido. Outras tintas, tais como proflavina ou fluoresceína, pode ser usado em vez de tinta piranina com aprovação apropriado 4-7,11. &quot;&gt; Qualquer característica sonda pode ser modificada a partir desta concepção. Para o de alta resolução modalidade fluorescência microendoscopy, a fibra de imagem 1 mm de diâmetro consistia em 50.000 fibras de núcleo individuais com 4.5 mm de espaçamento, o que resulta em uma resolução espacial sub-celular constante de 4,5 uM . os investigadores que desejam uma fibra de imagem de tamanho diferente para obter uma menor ou maior campo de visão pode encontrar estas fibras imagem prontamente disponíveis com diâmetros entre 0,14 e 1,40 mm. uma lente de tubo com comprimento focal de 50 mm, foi escolhido de tal modo que o sensor CMOS capturou a completa um milímetro campo de visão a partir da fibra da imagem. ao manter a constante lente objetiva, aumentando a distância focal da lente do tubo vai aumentar a ampliação e amostragem frequência, mas diminuir campo de visão. 11 Assim, a ampliação da da lente objectiva, o comprimento focal da lente do tubo, o tamanho do sensor de imagem, e o tamanho da imagem de fibra pode e deve ser optimizada, dependendo da necessidade. Finalmente, os filtros de excitação e a luzfonte pode ser modificado, dependendo do espectro de excitação / emissão de corantes fluorescentes. 4-7 Além de modificar a sonda de alta resolução e de fluorescência microendoscopy instrumentação, o sub-instrumentação espectroscopia de reflectância difusa pode ser modificado. Para o sub-difusa modalidade de espectroscopia de reflectância, diferentes fibras multimodo porte pode ser usado em cada SDS. Pequenas fibras multimodo diâmetro será capaz de entregar e recolher luz sobre uma área menor, mas recomenda-se a utilização de um conjunto de fibras identicamente espaçados para aumentar a relação sinal-ruído, se os diâmetros das fibras inferior a 200 um são usados. Os investigadores que analisam a pele ou tecido oral podem beneficiar de uma sonda geral maior para aumentar a área de visão e sinal-ruído, mas em órgãos luminosos mais estreitos, como o esôfago ou do trato gastrointestinal, os investigadores terão de enfrentar constrangimentos adicionados em relação ao tamanho da sonda, especialmente para a compatibilidade com a porta de biópsia de conventoional endoscópios. 8 Outros componentes de espectroscopia que podem ser alterados incluem a fonte de luz de banda larga e interruptor óptico motorizada. Uma lâmpada de tungsténio-halogénio foi escolhida, neste caso, embora outras fontes de luz podem ser e foram utilizados em outros estudos, incluindo lâmpadas de arco de xenon e LEDs, que podem aumentar a relação sinal-ruído e tempos de integração mais baixas. A 2,15,20 interruptor óptico motorizada apresentado aqui foi construído sob encomenda para lidar com até três FDS, mas pode ser modificado para incluir mais ou menos entradas. Deve notar-se que o interruptor óptico motorizada se adicionar um componente adicional óptico entre a fonte de luz de banda larga e espectrómetro, a diminuição de sinal-para-ruído. O interruptor pode não ser necessário para os investigadores com vários espectrômetros que adquirem dados simultaneamente, mas incluindo um componente interruptor óptico em última análise, reduz o custo de instrumentação em cerca de $ 3.000 dólares por SDS. A construção da instrumentação ( <strong&gt; Figuras 2 e 3) é bastante simples. O passo mais crítico neste protocolo é a calibração do sub-difusa espectroscopia de reflectância modalidade (Figura 4). A calibração deve ser concluída imediatamente antes da coleta de dados espectrais. Uma vez que a calibração foi concluída, garantir que não haja pedaços de os instrumentos sejam desligadas ou re-calibração pode ser necessária. calibração adequada é necessária para obter os espectros de reflectância preciso, e, assim, obter os valores exactos para subjacente concentração de melanina, a concentração de hemoglobina, e a saturação de oxigénio do tecido a partir de uma amostra desconhecida. Convenientemente, a maioria dos investigadores usam técnicas de calibração semelhantes que têm sido bem descritos. 2,11,12,25 As informações sobre requisitos de software para converter espectros de reflectância em parâmetros ópticos podem ser encontrados em outros lugares. 11,24,26 No que diz respeito à resolução de problemas, espectros resultando em ataques pobres (médiapor cento erros superior a 10% entre os dados brutos e dados ajustados) irá produzir valores não confiáveis para os parâmetros fisiológicos de três tecidos ([Hb], [Mel], e São 2) apresentado aqui. Fits pobres são provavelmente o resultado de qualquer movimento entre a sonda e local da pele durante a aquisição de dados, condições de contorno estreitas no código de pós-processamento, ou valores a priori pouco fiáveis de [Hb] e [Mel]. 11,21,24, 26 Melhorias nestas três ocorrências de erros comuns deve corrigir o encaixe preciso dos espectros de reflectância sub-difusa. Deste modo, a recolha de dados pode ser melhorada por redução do tempo de integração espectrómetro para reduzir os artefactos de movimento dentro do espectro. Além disso, condições de contorno representam a gama de possíveis valores de saída computacional para [Hb], [Mel], e São 2 seguinte pós-processamento. Nestes estudos, condições de contorno foram 0-10 mg / ml de [Hb], 21,22 0-40 mg / ml de [Mel], 27,28 e 0-100% para SaO 2, <sup&gt; 29, que se baseiam em valores de estudos anteriores 21,22,27-29. Se a determinação do tecido sem a melanina, os limites inferior e superior para [Mel] tanto pode ser simplesmente configurado para 0 mg / mL. Finalmente, recomenda-se a utilização estabeleceu um valores de absorvância a priori para hemoglobina e melanina publicada por Prahl et al. 21 Estas melhorias simples devem fixar o encaixe preciso dos espectros de reflectância sub-difusa, e se questões permanecem, espectros pode ser validado com fantasmas com propriedades ópticas conhecidas (reduzida dispersão e coeficientes de absorção). A principal limitação para esta plataforma multimodal microendoscopy imagiologia e espectroscopia de fibra feixe é a falta de uma modalidade de imagem de campo amplo. A alta resolução modalidade fluorescência microendoscopy tem um campo de visão que é circular de 1 mm de diâmetro, o que torna difícil para digitalizar rapidamente uma grande área de tecido. Um método computacional para superar esta limitação é a imagem mosaIcking, uma técnica utilizada para fornecer um campo de visão mais amplo pelo empilhamento de imagens em micro-escala adjacentes em um único mapa de imagem, maior. 10 Tal mosaicking imagem foi anteriormente demonstrada por Prieto et al. para investigar características da imagem do cólon. 10 An modificação instrumentação para superar esta limitação seria fazer a sonda compatível com a porta de biopsia de um endoscópio convencional, tal como a sonda apresentados por Parikh et ai. para investigar neoplasia colorrectal. 8 esta característica combina as vantagens de um campo de visão à escala com imagens de micro-escala de alta resolução microendoscopy fluorescência 8. No geral, esta técnica foi demonstrada in vivo sobre a pele humana e mostra o valor de tecido de alta resolução imagens micro-arquitectura co-registrar com a concentração subjacente a melanina, concentração de hemoglobina, e saturação de oxigênio tecidual (Figura 5). este tecnolique pode ser usado por investigadores que desejam estudar a ligação entre as alterações estruturais e funcionais dos tecidos in vivo, ou analisar alterações funcionais do tecido na ausência de alterações estruturais observáveis. Estudos futuros irá investigar a viabilidade desta técnica em vários estados de doença epiteliais.

Técnicas microendoscopy de fibra pacote normalmente analisar no tecido vivo usando ou técnicas de imagem ou uma combinação de técnicas de espectroscopia. 1-3 Uma tal técnica de imagem de alta resolução microendoscopy de fluorescência, pode imagem do tecido apical micro-arquitetura com resolução sub-celular em um pequeno , field-of-view microescala, utilizando um agente de contraste tópica, tais como proflavina, fluoresceína, ou tinta de piranina. 1,3-11 Esta modalidade de imagem mostrou promissor desempenho clínico em qualitativamente diferenciação entre tecido epitelial doentes e saudáveis em tempo real com baixo inter-observador variabilidade. 8 ocasionalmente, os investigadores irão utilizar os dados de microscopia de fluorescência de alta resolução para extrair características quantitativas, como celular e tamanho nuclear ou área da glândula, mas esta continua a ser uma técnica essencialmente qualitativa orientada para visualizar a morfologia dos tecidos. 1,3,8- 10 Por outro lado, as técnicas de espectroscopia, talcomo espectroscopia de reflectância difusa, são direcionados para fornecer informações de tecido funcional e têm se mostrado promissoras desempenho clínico em identificar quantitativamente lesões cancerosas em vários órgãos 2,12-15. Por conseguinte, existe uma necessidade de um dispositivo que incorpora ambos os tipos de modalidades para, potencialmente, reduzir ainda mais a variabilidade inter-observadores, manter a visualização em tempo real de tecido de micro-arquitectura, e proporcionar uma análise mais completa da saúde do tecido. Para atingir esta meta, um instrumento baseado no sonda multimodal foi construído que combina duas modalidades em uma sonda única fibra óptica:. De alta resolução microendoscopy fluorescência e espectroscopia de reflectância sub-difusa 11 Este método de co-registros qualitativos imagens de alta resolução de apical morfologia do tecido (propriedades estruturais) com informações quantitativas espectral (propriedades funcionais) a partir de duas profundidades de tecido distintas, incluindo a concentração de hemoglobina local ([Hb]), a concentração de melanina ([Mel]) e saturação de oxigênio (SaO 2). 11,12,16 Esta sub-difusa modalidade de espectroscopia de reflectância específica usa duas separações fonte de detectores (SDSS) para provar duas profundidades de tecido exclusivos para fornecer uma visão mais abrangente da saúde do tecido por amostragem até a membrana basal e estroma tecido subjacente. 11 A fibra-sonda é constituída por uma fibra de imagem 1 mm de diâmetro central com aproximadamente 50000 4,5 uM elementos de fibra de diâmetro, um diâmetro do revestimento de 1,1 mm e um diâmetro de revestimento global de 1,2 mm. A fibra de imagem encontra-se rodeado por cinco fibras 200 um de diâmetro com um diâmetro de revestimento de 220 uM. Cada fibra multimodo 200 um situa-se a uma distância de centro a centro de 864 uM de distância a partir do centro da fibra de imagem. Cada um dos 200 fim são fibras multimodo 25 ° entre si. Usando o mais à esquerda fibra multimodo de 200 um como a fibra &quot;fonte&quot;, eo th adicionalree 200 uM fibras multimodo como as fibras de &quot;recolha&quot;, esta geometria cria necessariamente três centro-a-centro FDS de 374 uM, 730 uM, 1,051 uM, e 1,323 uM. As pontas de fibra são colocados em uma caixa metálica cilíndrica que mantém as distâncias entre as fibras constante. O diâmetro do invólucro de metal cilíndrica é de 3 mm. A extremidade distal (para a fibra óptica ponta da sonda) da sonda de fibra óptica é de 2 pés de comprimento. A sonda, em seguida, separa-se os respectivos seis fibras individuais na extremidade proximal (no sentido da instrumentação), que é um adicional de 2 pés de comprimento, para um comprimento total de 4 pés. A Figura 1 mostra uma representação da sonda de fibra óptica. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig1.jpg" /> Figura 1:. Design de sonda de fibra óptica A sonda de fibra óptica é constituído por uma fibra de imagem 1 mm de diâmetro e 200 um de quatro fibras multimodo. esteA Figura mostra representações de (a) a tampa da extremidade de metal que restringe a geometria das fibras na ponta da sonda para se obter FDS de 374, 730, e 1051 uM no que respeita à 200 fibra uM multimodo mais à esquerda (Barra de escala ≈ 1 mM), (b) as fibras ser restringida dentro da tampa de metal, mostrando os núcleos de fibra, revestimento de fibra e revestimento de fibra (Escala bar ≈ 1 mm), (c) a poliamida invólucro de protecção em torno das fibras (Escala bar ≈ 1 mm), (d ) da ponta distal acabado da sonda, com o apoio para os dedos de metal e cabo único preto contendo todas as fibras (barra de escala ≈ 4 mm), e (e) uma imagem da ponta distal da sonda (barra de escala ≈ 4 mm). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54564/54564fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Esta instrumentação multimodal e techni associadoQue é a primeira combinação destas modalidades dentro de uma única sonda, embora existam outras técnicas estruturais / funcionais combinados que combinar modalidades diferentes. Por exemplo, a imagem latente hiperespectral combina imagem de campo amplo com a hemoglobina e a melanina propriedades quantitativas, 17,18 e outras técnicas têm sido desenvolvidas que combinam tomografia de coerência óptica (OCT) com a análise de expressão de proteína de tecido, 19 para citar alguns. Este artigo apresenta uma configuração de instrumentação compacta e fácil de implementar, que utiliza uma sonda de fibra óptica em geral, que pode ser optimizado para vários fins, incluindo o uso endoscópica no tracto gastrointestinal inferior e do esófago ou como uma sonda de mão para uso na cavidade oral e colocação de pele externa. 11,20 O hardware para este instrumentação exige tanto de aquisição de dados personalizado e código de pós-processamento para adquirir espectros de reflectância difusa e, em seguida, extrair o volum resultantetecidos parâmetros fisiológicos média-e incluindo [Hb], [Mel], e SaO 2. O código de aquisição de dados personalizados foi construído para permitir a aquisição simultânea de uma câmera (para microscopia de fluorescência de alta resolução) e um espectrômetro (por espectroscopia de reflectância difusa). Drivers são muitas vezes disponível a partir de sites dos fabricantes para permitir a integração com uma variedade de linguagens de programação. O código personalizado pós-processamento importa um valores de absorção priori de in vivo [Hb] e [Mel] 21 e, em seguida, utiliza um processo de adaptação otimização não-linear desenvolvido anteriormente que cria uma curva ajustada dos espectros. 22 A curva ajustada é construído através da minimização do χ 2 valor entre si e os espectros cru e determinar os parâmetros fisiológicos dos tecidos ([Hb], [Mel], e São 2) a partir da curva ajustada e com o menor valor χ 2. 22 o código pode ser modificado para incluirabsorção de outros cromóforos, bem como a tinta de piranina exógeno utilizado aqui, de modo que os parâmetros fisiológicos alvo não são afectados. Indicadores fisiológicos da saúde dos tecidos, tais como [Hb], [Mel], e SaO 2, pode ser usado como relatórios de resposta do tumor à terapia ou como indicadores da vascularização local e angiogénese. 14,23 Incluindo uma modalidade de alta resolução de fluorescência microendoscopy ajuda a colocação de sonda de guia e fornece investigadores com uma imagem mais completa da relação entre estrutura tecido epitelial e função. Neste artigo, construção e aplicação do microendoscope multimodal é descrito. 11

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CM1-DCH</td>
			<td style="width:427px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">T470lpxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 1.5&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER1.5-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 3.0&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER3-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 2.0&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER2-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1-Threaded 30 mm Cage Plate</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Series Stress-Free Retaining Ring</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1PRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Lens Tube, 1.00&#34; Thread Depth</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">KCB1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">1&#34; UV Enhanced Aluminum Mirror</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PF10-03-F01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Z-Axis Translation Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">10X Olympus Plan Achromatic Objective</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">RMS10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">XY Translating Lens Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1SMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Lens Tube, 0.50&#34; Thread Depth</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">440/40 Bandpass Filter (Excitation)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ET440/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">525/36 Bandpass Filter (Emission)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Quick Set Epoxy</td>
			<td style="width:175px;">Loctite</td>
			<td style="width:171px;">1395391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt</td>
			<td style="width:175px;">LED Supply</td>
			<td style="width:171px;">ALK-LH-3W-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">1&#34; Achromatic Doublet, f=50mm</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">AC254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Flea 3 USB Monochrome Camera</td>
			<td style="width:175px;">Point Grey, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">FL3-U3-32S2M-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">0.5&#34; Post Holder, L = 1.5&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PH1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">0.5&#34; Optical Post, L = 4.0&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Mounting Base, 1&#34; x 2.3&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR)</td>
			<td style="width:175px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:171px;">HL-2000-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">20X Olympus Plan Objective</td>
			<td style="width:175px;">Edmund Optics, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Arm</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Housing</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Stepper Motor - 400 steps/revolution</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">ROB-10846</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Arduino Uno - R3</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">DEV-11021</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Electronic Breadboard - Self-Adhesive</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">PRT-12002</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">EasyDriver - Stepper Motor Driver</td>
			<td style="width:175px;">Sparkfun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">ROB-12779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">12V, 229 mA Power Supply</td>
			<td style="width:175px;">Phihong</td>
			<td style="width:171px;">PSM03A</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR)</td>
			<td style="width:175px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:171px;">USB2000+VIS-NIR-ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">550 &#181;m, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">M37L01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Fiber-Optic Probe</td>
			<td style="width:175px;">Myriad Fiber Imaging</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard</td>
			<td style="width:175px;">Labsphere, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SRS-20-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Standard Yellow Highlighter</td>
			<td style="width:175px;">Sharpie</td>
			<td style="width:171px;">25005</td>
			<td>Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal imaging and spectroscopy fiber-bundle microendoscopy platform for non-invasive, in vivo tissue analysis

Técnicas recentes microendoscopy fibra feixe permitir a análise não invasiva de tecido in vivo, utilizando quer técnicas de imagiologia ou uma combinação de técnicas de espectroscopia. Combinando técnicas de imagem e espectroscopia em uma única sonda óptica pode fornecer uma análise mais completa da saúde do tecido. Neste artigo, duas modalidades diferentes são combinados, imagens de alta resolução de fluorescência microendoscopy e espectroscopia de reflectância difusa, em uma única sonda óptica. De alta resolução de imagens de fluorescência microendoscopy é uma técnica utilizada para visualização de tecido apical micro-arquitetura e, embora na maior parte uma técnica qualitativa, demonstrou diferenciação em tempo real eficaz entre tecido neoplásico e não-neoplásica. espectroscopia de reflectância difusa é uma técnica que pode extrair parâmetros fisiológicos dos tecidos incluindo concentração local de hemoglobina, concentração de melanina, e saturação de oxigênio. Este artigo descreve as especificações de required para construir a sonda de fibra óptica, como construir a instrumentação, e, em seguida, demonstra a técnica in vivo sobre a pele humana. Este trabalho revelou que o tecido micro-arquitetura, queratinócitos da pele especificamente apicais, podem ser co-registadas com os seus parâmetros fisiológicos associados. A sonda de fibra e instrumentação-feixe aqui apresentado pode ser optimizado, quer como um dispositivo portátil ou endoscopicamente-compatível para uso numa variedade de sistemas de órgãos. investigação clínica adicional é necessário para testar a viabilidade desta técnica, para diferentes estados de doença epiteliais.

Seguindo este protocolo, o investigador irá obter uma imagem do local de tecido de alta resolução de focagem com o campo de visão completo (Figura 5). Esboços de células pode ser visto se coradas com tinta de piranina a partir de um marcador amarelo padrão, enquanto que os núcleos das células individuais podem ser vistas se marcadas com um corante, tal como proflavina. Após a aquisição espectral, o software de pós-processamento utiliza um conhecimento a priori das in vivo de concentração de hemoglobina ([Hb]) e as concentrações de melanina ([Mel]) 21 para se ajustar ao sub-difusa espectros de reflectância e de determinar os valores de [Hb], [Mel ], e a saturação de oxigénio no tecido (SaO2) como mostrado na Figura 5. O software de pós-processamento utiliza limites fisiológicos de largura ([Hb] = 0-150 mg / mL, [Mel] = 0-30 mg / ml, e São 2 = 0-100%) para se ajustar o espectro calibrados. 21 <img alt = &quot;Figura 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54564 / 54564fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5:. Co-registro de dados qualitativos e quantitativos da pele humana normal in vivo e um nevo melanocítico benigno Uma imagem de fluorescência de alta resolução foi obtida a partir de um piranina de tinta (a partir de um marcador amarelo standard) manchado nevo melanocítico benigno e pele normal adjacente tecido com um tempo de exposição de 150 mseg. Esboços de queratinócitos pode são claramente visíveis em ambas as imagens. O local de tecido e pele normal nevo melanocítico tinha concentrações de hemoglobina de 1,63 e 0,86 mg / ml, concentrações de melanina de 0.78 e 10,20 mg / ml, respectivamente, com semelhantes saturações de oxigénio de 99%. Este número demonstra o benefício de informações funcionais estrutural e quantitativa qualitativa co-registrar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54564/54564fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma vers maiores</a>ion desta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis at JoVE.com

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

multimodal-imaging-spectroscopy-fiber-bundle-microendoscopy-platform

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

7.8K visualizações.  University of Arkansas. The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Vídeo: Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Hand-Held fotoacústico clínico sistema de imagem para imagens de animais em tempo real não-invasiva pequenas

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...