This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde 26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins. 1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação <ol><li> Sacrifique um rato neonatal por inalação de CO2. </li><li> Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato. </li><li> Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml. </li><li> Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação. <ol><li> Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio. </li></ol></li><li> Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose. <ol><li> Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração. </li></ol></li></ol> 2. Inclusão do Tecido <ol><li> Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média. </li><li> Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde. <ol><li> Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro. </li></ol></li><li> Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito. </li><li> Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. </li><li> Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado. </li><li> Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses. </li></ol> 3. cryosectioning incorporado Limbs <ol><li> Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário. </li><li> Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte. </li><li> Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato. </li><li> Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço. <ol><li> Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação) <ol><li> Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana. </li><li> Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível. </li><li> Seções permeabilizar <ol><li> Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS. </li><li> Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa. </li><li> Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide. </li><li> Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar. </li><li> Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados. </li><li> Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível. </li></ol></li><li> Rotulagem pausa DNA TdT mediada <ol><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso. </li><li> Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado &quot;nuclease&quot; no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação. </li><li> Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al<html> ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin. </li><li> Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível. </li></ol></li><li> Marcação fluorescente <ol><li> Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min. </li><li> Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide. </li><li> Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min em PBS. </li><li> Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Aquisição de Imagem Digital <ol><li> Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo. </li><li> Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa. <ol><li> Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático. </li><li> Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade. </li></ol></li><li> Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser &quot;costurado&quot; juntos. </li></ol> Análise 6. Imagem <ol><li> Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL. </li><li> Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H &amp; E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H &amp; E em combinação com um atlas de anatomia 5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados. </li><li> Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado). </li><li> Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência. </li><li> Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras. </li><li> Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado. </li><li> Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computador para análise de imagens. O pesquisador deve estar ciente dos perigos potenciais. Autofluorescência do tecido é uma grande preocupação em imagens de fluorescência. Em animais não perfundidada, mantendo-se os glóbulos vermelhos contribuirá sinal bastante elevado autofluorescent. As células endoteliais também podem ser significativamente autofluorescente. Portanto, é importante para confirmar que a autofluorescência não é confundido com o sinal de TUNEL positivo. Esta avaliação é realizada facilmente, tendo uma imagem em um canal sem fluorophore, a ser utilizado para comparação e possível subtracção do canal de TUNEL positivo. Desta forma, o método de TÚNEL à base de fluorescência é superior aos métodos de microscopia de campo claro colorimétricos que não proporcionem um controlo interno para a coloração de fundo. Fixação do tecido terá um impacto significativo no sucesso da rotulagem TUNEL. É melhor para minimizar o tempo de fixação em paraformaldeído, para não exceder 24 horas. Tecido embrionário e neonatal, serão necessários tempos de fixação significativamente menores do que 24 horas. Quando marcação TUNEL é bem sucedido, o sinal de TUNEL positivo deve ser muito maior do que o fundo da autofluorescência, de modo que o sinal pode ser facilmente isolado por intensidade de limiar de propagação usando software de análise de imagem. Recuperação de antigénios utilizando o protocolo padrão de aquecimento em tampão citrato 27,35 pode melhorar ligeiramente sinal de baixa TUNEL se o tempo de aquecimento é mantido a um mínimo (5 min), mas este pré-tratamento de dezds para reduzir o sinal de TUNEL, se o aquecimento for prolongado por períodos mais longos (por exemplo, 20 minutos a 95 ° C). Recuperação antigênica aumentará autofluorescência de fundo e falsos positivos, e, portanto, pode anular quaisquer ganhos na relação sinal-ruído de sinal aumentado TUNEL. As medições de sinal TUNEL deve ser normalizada quer para a área total do músculo ou quantificada com o número de núcleos por área quantificada. Porque TUNEL mede núcleos apoptóticos, a normalização ideal seria núcleos totais. No entanto, mesmo em 10 (um) seções musculares relativamente finas, as fibras musculares e núcleos são tão numerosas e embalado tão de perto, que é impossível contar automaticamente núcleos Hoechst-manchadas por thresholding e de separação de partículas algoritmos. Contagem manual também é muito trabalhoso e impreciso. A alternativa viável é a normalizar a área total do músculo. O ensaio de TUNEL, utilizado com o processamento do tecido apropriadotécnicas e os controlos positivos e negativos, é um método relativamente rápido, reprodutível, quantitativo para a detecção de danos no ADN e morte celular em tecidos. Ele pode ser usado para confirmar a apoptose como um mecanismo patológico, para identificar os tipos de células afectadas, e para avaliar a eficácia dos tratamentos terapêuticos. Este procedimento será de valor para pesquisadores nas áreas de doença do músculo esquelético e lesões, incluindo SMA, ALS, distrofia muscular, miopatia induzida pela toxina, e fisiologia do exercício.

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 &#39;da dupla e ADN de cadeia simples quebra 12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido 7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios 6,14,29 e cardiomiócitos 43,44, morte celular neuronal excitotóxica 30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite 39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras 7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células 4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético 8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples 25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) 13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica 34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite. Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) 10 que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas 16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal 10. Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária. Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (ADNase adicionada) deve apresentar o sinal de TUNEL positivo abundante, distribuído uniformemente em todos os tecidos na secção (Figura 1C). O controle negativo (enzima TdT omitido da reação) deve render fundo de baixa intensidade e sinal autofluorescent apenas (Figura 1D). Pele, proporciona um controlo positivo interno em secções de perna inteiros, como esse tecido tem uma alta taxa de apoptose normal (Figura 1A). Sangue vermelhocélulas do osso, células endoteliais, e pode contribuir sinal autofluorescente significativa (Figura 2). Aconselha-se a imagem de cada seção em um canal separado sem marcação fluorescente para garantir que autofluorescência não é confundido com sinalização TUNEL positivo. Sinal de TUNEL positivo verdadeiro deve ter muito maior intensidade do que a autofluorescência, de modo que possa ser isolado por meio de estabelecimento de limiares de intensidade de imagem (Figura 2A, linha média). Alternativamente, o canal pode ser autofluorescente digitalmente subtraído do canal de TUNEL para produzir o sinal de TUNEL positivo (Figura 2A, linha inferior). O método de marcação TUNEL aqui descrito foi usado para quantificar a morte de células do músculo esquelético, em um modelo de rato de SMA 10. Rotulagem TUNEL mostra um aumento no número de perfis apoptóticos em músculos da perna, de 5 dias de idade os ratos SMA, em comparação com controlos da mesma ninhada (Figura 3A). O aumento em apoptose équantificável pelo método descrito acima, indicando diferenças estatisticamente significativas em vários grupos musculares (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: rotulagem TUNEL Representante dos músculos dos membros posteriores do mouse. (A) TUNEL marcado secção transversal do membro posterior do rato mostrando músculo tibial anterior, tíbia, e pele. TA - tibial anterior, Fdl - flexor longo dos dedos, Edl - extensor longo dos dedos. Green - TUNEL, azuis - núcleos, vermelho - sinal autofluorescent. As linhas pontilhadas delinear áreas musculares para quantificação. Pele adjacente músculos dos membros posteriores fornece um controle interno positivo para a rotulagem TUNEL. Barra de escala = 200 mm. (B) representativos imagens de alta ampliação identificando TUNEL-positivo estruturas (verde) em embrionário<html> dia 13 de rato músculo esquelético como núcleos apoptóticos. Escala da barra = 10 m. A e B modificada a partir Fayzullina e Martin 2014 10. (C) de secção transversal do membro posterior do rato TUNEL marcado após o tratamento de DNase para servir como um controlo positivo. A maioria dos núcleos têm rotulagem TUNEL brilhante. Escala da barra = 50 m. (D) Secção transversal do mesmo membro posterior do rato como se mostra em C (semi-adjacente a secção em C) TUNEL marcado com enzima TdT omitido para servir como um controlo negativo. Não há sinal de TUNEL-positivo brilhante; o único sinal verde é autofluorescência como detectado por co-localização com sinal no canal vermelho. Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2 &quot;fo: content-width =&quot; &quot;src =&quot; 6 pol / files / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 2: A autofluorescência do tecido deve ser considerado e excluídos da quantificação na análise de rotulagem TUNEL. (A) seção transversal hindlimb Rato com rotulagem TUNEL e autofluorescência: imagem original (topo de linha), a mesma imagem com os limites ajustados (linha do meio), e mesma imagem com autofluorescência canal (vermelho) subtraído (linha de fundo). Thresholding elimina celular mais vermelha do sangue e autofluorescência de células endoteliais, mas não o artefato coloração (ponta de seta, linha do meio). Subtração Canal também elimina o artefato coloração (ponta de seta, linha inferior). Green - TUNEL, vermelho - autofluorescência, azuis - núcleos. Barra de escala = 100 pm. Imagem Maior ampliação do painel autofluorescência vermelho retângulo cinza delineia área ampliada em B. (B) em A. Glóbulos vermelhos e algumas células endoteliais (setas), e uma TISSue coloração artefato (seta) autofluoresce em ambos os filtros de fluorescência vermelha e verde. Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: rotulagem TUNEL mostra a morte de células no músculo esquelético de ratos SMA neonatais músculos da parte inferior dos membros posteriores de ratos SMA em dia pós-natal 5 foram marcadas pelo método TUNEL (A) rotulagem TUNEL mostra vários perfis apoptóticos em vários grupos musculares em SMA mouse.. músculo (direito) em comparação com o controlo da mesma ninhada (esquerda). Green - TUNEL, azul - Hoechst (núcleos), vermelho - autofluorescência. As linhas pontilhadas delinear as áreas musculares quantificados. TA - tibial anterior, Fdl - dig flexoritorum longus, Edl - extensor longo dos dedos. Barras de escala = 200 pm rotulagem. (B) TUNEL foi quantificada como a área total de pixels de sinal de TUNEL normalizada para a área total de pixels de músculo. Médias ± erros padrão são ilustrados, n = 4 - 5 ratinhos. A significância estatística entre SMA e de controlo para cada grupo muscular (unicaudal t-teste): * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Este valor foi modificado a partir Fayzullina e Martin 2014 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K visualizações.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Vídeo: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.