A transferência genética mediada por eletroporação no músculo é uma técnica fácil e eficiente para investigar mudanças na fisiologia muscular. Descobrimos que a eletroporação não compromete a contratude muscular. A eletroporação de construções genéticas em in vivo muscular é um procedimento simples e eficiente que não requer embalagens mais extensas de construções genéticas em vetores virais.
É difícil visualizar, isolar e injetar o EDL devido à sua localização e tamanho pequeno. Praticar em uma carcaça de rato e injeção de tinta biológica, como a tinta da Índia, pode ajudar a fornecer evidências de injeção suficiente. Demonstrando o procedimento será Brian Hain, um pós-doutor do meu laboratório.
Antes de injetar o rato, confirme o plano cirúrgico da anestesia usando fórceps com a ausência do reflexo do dedo do pé, em seguida, transfira o rato para um cone de nariz descansando em uma placa de água circulante a 37 graus Celsius para o resto do procedimento. Uma vez que o rato é colocado em uma posição supina, remova o cabelo de ambos os membros traseiros usando pequenos cortadores de cabelo, em seguida, higienize a área de injeção com 70% de etanol e betadina alternadas. Para a injeção, localize o tendão tibialis anterior ou TA visível através da pele no lado lateral da perna inferior e marque a extremidade superior do músculo TA.
Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 montada em uma micro seringa de 50 microliter no músculo em um ângulo raso de cinco graus de um a dois milímetros superior à junção miotendinous até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo. Deprimir o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho de injeção para entregar 50 microliters da solução plasmida no músculo. O músculo deve inchar.
Defina o temporizador por um minuto e meça a espessura da perna no músculo TA e, em seguida, coloque os eletrodos de pinça na espessura medida. Em seguida, defina a tensão eletroporante para 12,5 volts por milímetro. Após um minuto, coloque os eletrodos de pinça de perto ao redor do membro inferior sem ser excessivamente apertado para entregar cinco pulsos de onda quadrada com duração de 20 milissegundos e intervalos de 200 milissegundos.
O músculo deve se contrair a cada pulso. Repita o procedimento com o outro membro usando o vetor plasmídeo de controle. Quando feito, remova o mouse do cone do nariz e deixe que o mouse se recupere em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius.
Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola. Com o rato em uma posição supina, localize a crista anterior do osso da tíbia visualmente e através da gentil palpitação. Use um bisturi para fazer uma incisão rasa através da pele no lado lateral da crista anterior da tíbia cinco milímetros inferior ao joelho a dois milímetros superior à junção miotendinous TA.
Com a ajuda de uma tesoura pequena dissecar sem rodeios a fáscia, expondo o músculo TA, e então separar o músculo TA da tíbia suavemente puxando o músculo para revelar o extensor digitorum longus ou EDL. Mantenha o TA afastado do EDL durante o procedimento usando pequenas fórceps curvas. Insira a agulha de calibre 30 no EDL longitudinalmente até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo e injete 10 microliters da solução plasmida como demonstrado antes.
O músculo EDL deve inchar. Meça a espessura da perna no EDL e coloque os eletrodos de pinça na espessura medida para entregar cinco pulsos de onda quadrada, como explicado anteriormente. Quando feito, feche a incisão usando suturas descartáveis de nylon 4-0 não absorvíveis.
Mais tarde, remova o mouse do cone do nariz e deixe-o se recuperar em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius. Administre um analgésico subcutâneo apropriado imediatamente após a cirurgia e de 12 a 24 horas após a cirurgia. Uma vez recuperado, devolva o rato para a gaiola.
Após a injeção e eletroporação do plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e EDL, observou-se a expressão GFP indicando a absorção de DNA nas fibras musculares. Quando visualizada em uma ampliação mais baixa, a eficiência de transfecção muscular EDL poderia ser visualizada através do aparecimento de fibras verdes versus fibras pretas. Os EDLs injetados e eletroporados tiveram respostas tetanicas semelhantes em 100 Hertz em comparação com o controle de músculos não injetados ou eletroporados.
O EDL injetado e eletroporado, a força muscular tetanica, força muscular tetanica específica, tempo para pico de tensão, e metade do tempo de relaxamento não foram comprometidos em comparação com o controle intocado. É importante identificar com precisão o músculo a ser injetado e entregar eficientemente a solução plasmida. Uma série de medições histológicas e bioquímicas podem ser feitas usando este protocolo.
Localização celular de proteína alvo, derrubada de genes alvo, repórteres transcricionais e uma série de manchas de tecido podem ser conduzidas. Esta técnica tem sido usada para identificar uma vasta gama de alterações na sinalização molecular no músculo durante condições fisiológicas e fisiodicos. A investigação da contralidade muscular após a transferência genética é viável usando essa técnica.
