This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco. 1. Preparar o animal para a cirurgia <ol><li> Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia. NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós-natal (10-12 P10-12) camundongos FVB. Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usados ​​para atender às necessidades de um projeto específico. Ratos com idade superior a P40 pode ser um desafio, porque o osso bolha fica mais difícil. </li><li> Anestesiar os ratos com injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg), hidrocloreto de xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Comece a preparação cirúrgica só depois que o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. Se necessary, administrar uma dose de reforço (um quinto da dose original) do cocktail de anestésico para restaurar o plano anestésico originais. Nota: Tenha cuidado nesta etapa porque a maioria da mortalidade observada nesta idade é causada por overdose de anestésico. </li><li> Cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica de proteção para manter os olhos úmidos durante a anestesia, suprimindo piscar reflexo do animal. </li><li> Posicione o mouse com o pescoço estendido sobre uma almofada de aquecimento durante todo o processo até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia. </li><li> Raspar a região pós-auricular esquerdo com um clipper e desinfectar com álcool 70% e iodopovidona antes de manipulação cirúrgica. </li></ol> 2. O procedimento cirúrgico e Vector Injection <ol><li> Use uma abordagem pós-auricular para expor a bula timpânica. Inciso a tecido subcutâneo com uma tesoura pequena para expor o músculo pós-auricular. Depois de recolher o tecido adiposo para poe lado posterior da incisão, para separar os músculos do lado direito e esquerdo perpendicularmente à incisão para expor o osso temporal. Certifique-se de que esta incisão é tempo suficiente para trabalhar confortavelmente com visualização adequada. </li><li> Perfurar a bula timpânica com uma agulha de 25 G e expandir o buraco, se necessário com uma pinça por descascar o osso de volta para permitir o acesso ao giro basal da cóclea, e, em seguida, ampliar o suficiente para visualizar a artéria estapediana ea membrana da janela redonda (VM) . </li><li> Perfurar o VM suavemente no centro com uma pipeta de borosilicato capilar. Observe efluxo fluido através da VM neste ponto; isso é normal. Aguarde até que o efluxo estabilizou (o fluido effluxed da cóclea é seca com um papel de filtro estéril). NOTA: Tome cuidado ao segurar e fazer avançar a agulha de vidro para que a perfuração RWM é tão pequeno quanto possível. Dependendo do microscópio utilizado, segurar as pipetas utilizando um micromanipulador ou à mão, utilizando uma pipetatitular. </li><li> Prepare as pipetas para injecção utilizando uma pipeta extrator da mesma forma que as pipetas de fixação de membranas são preparadas. Certifique-se de que o diâmetro da ponta é grande (cerca de 15 m de diâmetro), de modo que a pipetagem do vírus dentro e para fora é feito facilmente. </li><li> Elaborar 1-2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP em uma pipeta de injeção. Depois do efluxo é estabilizada (5 a 10 min), microinject este volume fixo na rampa timpânica através do mesmo orifício feito previamente RWM. </li><li> Selar o nicho RW rapidamente depois de retirar a pipeta com uma pequena porção de músculo e fixe-o com uma pequena gota de cola de tecido colocado no músculo para evitar fugas da janela redonda. NOTA: Selar este furo muito bem após a agulha é removida com uma pequena camada de músculo para impedir qualquer fuga de perilinfa a cóclea-este passo é crítico para preservar audição. Falha para selar completamente o VM irá resultar em perda de audição ao longo do tempo. </li><li> Após a injeção, cobrir oburaco na bula auditivo com o tecido adiposo, os músculos retornar pós-auricular e tecido adiposo para a sua posição normal e suturar a ferida em camadas com uma sutura absorvível 6-0 crómico ou menor. </li><li> Desinfectar a ferida com iodopovidona. </li></ol> 3. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Coloque os ratos em uma gaiola quente e não deixá-los abandonados até que sejam totalmente recuperado depois movê-los de volta com a mãe. Recomenda-se a remover o macho da gaiola antes de colocar os filhotes de volta com a mãe. </li><li> Administrar Carprofeno subcutânea (2 mg / kg) para analgesia pós-operatória e a cada 24 horas depois durante 3 dias, para gerir a inflamação e dor. Monitorar os animais diariamente para sinais de sofrimento, perda de peso anormal, dor ou infecção. Geralmente pelo 3º dia após a cirurgia todos os ratos devem estar agindo normalmente. Se quaisquer sinais de angústia ou doença aparecer em um rato após o 3º dia, considerar a eutanásia de tele rato conforme diretrizes institucionais. </li></ol> 4. Avaliação da função coclear Após Parto Viral Usando Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) Recordings NOTA: O tronco encefálico (ABR) é um potencial auditivo extraído da atividade elétrica em curso no cérebro e gravado através de eletrodos colocados sob o couro cabeludo evocado. O animal é estimulado com som. A gravação resultante consiste de cinco ondas que reflectem a actividade eléctrica dos pontos sucessivos da via auditiva nos primeiros 10 ms após o início do estímulo auditivo. <ol><li> Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina. </li><li> Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento durante todo o teste de audição até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia. NOTA: Useos seguintes estímulos sonoros nesta experiência: clique (5 ms de duração, 31 de taxa de apresentação Hz). </li><li> Coloque eletrodos de agulha subdérmicos no vértice, abaixo do pavilhão auricular esquerdo (de referência), e abaixo da orelha contralateral (terra) e começar a gravação ABRs como descrito anteriormente em uma câmara à prova de som 27,28. Grave ondas ABR em 5 intervalos de nível de pressão sonora dB para baixo de amplitude máxima. </li><li> Determinar os limiares ABR postoperatively logo aos quatro dias após o parto viral NOTA: Threshold é definido como o nível mais baixo de estímulo no qual a resposta picos de ondas I-V foram claramente e repetidamente presente na inspeção visual. </li><li> Medida da onda I analisar a atividade do nervo coclear. O nível mais baixo estímulo que produz uma forma de onda ABR detectável é definido como o limiar. </li></ol> 5. Coclear Transgene Expression Protein, através de imunofluorescência <ol><li> Anestesiar ratos com uma sobredosagem de intraperitoneal injeção de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina. </li><li> Decapitar a cabeça somente após o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. </li><li> Dissecar o cochleae fora e processo para imunofluorescência todo o monte, como descrito 26. Um protocolo detalhado do conjunto de montagem coclear imunofluorescência utilizando anticorpos anti-VGLUT3 7a e anticorpos anti-miosina é descrito em Akil et al., 2013 29. </li><li> Para a etiquetagem de GFP, incubar as cocleares inteiras montagens durante a noite a 4 ° C com um anticorpo de coelho anti-GFP em 1: 250 de diluição. </li><li> Lavar as cócleas duas vezes durante 10 min com PBS e depois incubar durante 2 horas em IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy2 diluído 1: 4000 em PBS. </li><li> Lavar as cócleas com PBS duas vezes durante 10 minutos e incubar com DAPI durante 15 min. </li><li> Monte o cochleae em lâminas de vidro e observar under um microscópio com imunofluorescência confocal. </li></ol>

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M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais 30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral 24, cocleostomias 31,32 e saco endolinfático entrega 33 em rato e cobaia. Na nossa experiência, a abordagem pós-auricular é mais rápido, mais simples e associada com lesão reduzida e mortalidade dos animais. Além disso, a abordagem pós-auricular oferece melhor visualização do VM com menos chance de trauma e perda associada de ouvir 34,35,36. Este relatório documenta os aspectos técnicos e de utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, demonstrando entrega de AAV1-VGLUT3 em the ouvido interno via o VM, resultando em expressão transgênica de ambos VGLUT3 e GFP (Figura 1 e Figura 2 e Figura 3A) e salvamento de ouvir neste modelo de ratinho de perda auditiva congênita. Estudos anteriores que descrevem métodos para entrega gene mostrou apenas expressão transgênica limitada em áreas críticas do órgão de Corti 12,37,38,39,40,41. Estas diferenças podem ser devidas à qualidade da preparação virai, o título do vector viral, o serotipo utilizado, ou simplesmente entrega viral insuficiente para dentro da cóclea. Em contraste, usando esta abordagem pós-auricular, que foram capazes de obter muito boas taxas de transfecção para ambas as células ciliadas externas e internas e distribuição de um gene repórter (GFP) após transfecção AAV2-GFP (Figura 2 e Figura 3A) em toda a cóclea. Com base na percentagem de IHCS transfectadas com AAV1-VGLUT3 (Figura 3B), que sugerem que a transfecção através de VM é mais efcaz e uniforme através de toda a cóclea do que outros métodos, incluindo a descrita na cobaia, que relatou as taxas mais elevadas de transfecção, no giro basal, próximo ao local de aplicação viral 42. A expressão de longo prazo da GFP / VGLUT3 dentro da cóclea, durante pelo menos um ano e meio, é consistente com os dados obtidos a partir de outros modelos animais e diferentes sistemas de órgãos 38,43. Além disso, a análise histológica da cóclea transf não demonstraram evidência de uma resposta inflamatória, com excelente preservação da citoarquitetura do órgão de Corti, incluindo a estria vascular e neurônios do gânglio espiral 26. Além disso, em contraste com os métodos que utilizaram um cocleostomias, a transfecção RWM utilizado no presente estudo não causar danos na cóclea, e maiores volumes podem ser injectados 31,32. Falta de trauma usando esta técnica foi verificada por demonstrando thresho ABR equivalentelds entre as orelhas operadas e controle, um achado semelhante ao observado por Xia et al. 4 Finalmente, a entrega AAV-VGLUT3 através da VM resultou em ABR limiares comparáveis ​​aos observados em camundongos WT (Figura 4A e 4B) 26. Temos usado essa técnica em todas as idades de camundongos, mas é tecnicamente desafiador em camundongos com idade superior a P40 porque o osso bolha se torna mais difícil para perfurar e o osso quebrado da bula é mais acentuada em mais velho do que nos ratos mais jovens. Em idades mais avançadas, o sangramento se precaução não é tomada pode ocorrer se um pedaço do osso bula dilacera os tecidos do pescoço. Em conclusão, este relatório documenta a transferência de genes de sucesso em vários tipos de células da cóclea do rato usando um vector à base de AAV como foi mostrado anteriormente. Esta técnica de entrega de genes minimiza o trauma, não conduz a perda de audição, e pode resultar em transfecção de uma ampla variedade de tipos de células no interior da cóclea, including células ciliadas e neurônios do gânglio espiral. Ela tem um grande potencial de aplicação para outros tipos de formas congênitas e adquiridas de perda auditiva, e também pode ser aplicada a uma variedade de terapias moleculares em modelos de ratos de perda auditiva.

A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita 1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um certo número de causas de perda de audição. Entrada de AAV na célula é mediada por receptores específicos 2; assim, a escolha de um serotipo particular, deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. AAV pode eficazmente transfectar células ciliadas 3 e incorporar no genoma hospedeiro, resultando em estabilidade, expressão de longo prazo do traproteína nsgenic e mudança fenotípica na célula 4. Embora não seja necessariamente vantajoso para as aplicações de curto prazo, tais como a regeneração de células de cabelo, expressão de longo prazo é muito importante para o salvamento estável de defeitos genéticos. Porque os AAV não estão associados com qualquer doença humana ou infecção e não demonstram 5,6,7 ototoxicidade, que é um candidato ideal para utilização na terapia de gene para formas herdadas de perda auditiva 8. Transferência de material genético exógeno para o ouvido interno de mamíferos utilizando vetores virais tem sido estudada ao longo da última década e está emergindo como uma técnica promissora para o tratamento de ambas as formas genéticas e adquiridas de perda auditiva 9. A cóclea é potencialmente um alvo ideal para terapia génica, por várias razões: 1) o seu volume pequeno necessita de uma quantidade limitada do vírus necessária; 2) seu relativo isolamento de outros efeitos limites de sistemas de órgãos secundários; e 3) suas câmaras cheias de líquido facilitar viralentrega ao longo do labirinto 10, 11,12,13,14, 15. Modelos de ratos com surdez congênita permitir o uso de vários métodos de estudo para monitorar o desenvolvimento do ouvido interno de uma forma sistemática, replicável. Enquanto o pequeno tamanho do rato cochleae não apresenta alguma dificuldade cirúrgica, o mouse funciona como um modelo extremamente importante no estudo de surdez genética, com várias vantagens em relação a outras espécies experimentais 16. Modelos de ratos permitir a avaliação de um conjunto de características por meio de análise de ligação genética, a coleta de observações morfológicas detalhadas, e simulação de cenários patogénicos; como tal, eles são bons candidatos para a terapia génica mediada por vírus. Estudos genéticos extensas em ratos, combinados com os avanços tecnológicos tornaram possível gerar camundongos geneticamente modificados de forma reproduzíveis em laboratório 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existem inúmeros modelos para ambas adquiridas e herdou auditivos fenótipos perda em ratos, permitindo testes rigorosos neste modelo animal 22, 23,24. Assim, corrigindo audiência usando terapia genética mediada por vírus em um modelo de rato é um primeiro passo adequado na busca de uma cura para a doença humana. Nós já mostraram que camundongos transgênicos que faltam glutamato vesicular transporter 3 (VGLUT3) nascem surdos devido à falta de liberação de glutamato na fita sinapse IHC 25. Porque esta mutação não leva a uma degeneração primária das células sensoriais ciliadas, estes ratinhos mutantes são potencialmente um excelente modelo em que para testar a terapia genética coclear para a perda auditiva congênita. Até à data, foram descritos um número de técnicas de entrega virais para terapia genética coclear, incluindo membrana da janela redonda difusão, injecção membrana da janela redonda, e entrega através de um cocleostomias. Existem potenteial vantagens e desvantagens de cada uma destas abordagens 9. Aqui nós relatamos um método cirúrgico para entrega gene viral mediada para o ouvido interno VGLUT3 KO rato através da membrana da janela redonda (VM). O método de injeção RWM pós-auricular é minimamente invasivo, com excelente preservação auditiva, e é relativamente rápido. Como já publicado anteriormente, num esforço para restaurar a audição neste modelo de ratinho, um vector que transporta o gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) foi introduzido na cóclea destes ratinhos surdos, dia pós-natal 12 (P! @), Resultando em a restauração da audição 26. Ouvindo nos ratos VGLUT3 KO foi verificada por audiometria de tronco encefálico (ABR), enquanto que a expressão da proteína transgene foi verificada através de imunofluorescência (IF). Esta metodologia demonstra, portanto, que a terapia génica mediada por vírus pode corrigir um defeito genético que de outra forma seria resulta em surdez.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen analgesia</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary pipette</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Suture PDS*plus Antibacterial</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GFP antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puller Model P-97&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT BioSig III System&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).

Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP Figura 2 e Figura 3A) 26 sem órgão significativa de prejuízo Corti. A observação de diferentes tipos de células que expressam GFP visto nas imagens de imunofluorescência cocleares inteiras de montagem (Figura 2 e Figura 3A) demonstra que a escolha do serotipo do AAV deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. Figura 1, Figura 2 e Figura 3A 26 mostram muito bom transfection em ambos os IHCS e CCEs, bem como a distribuição da proteína do transgene (GFP / VGLUT3) ao longo da cóclea após AAV1-GFP ou AAV2 ou AAV1-VGLUT3 transfecção. A distribuição de IHCS expressando VGLUT3 após AAV1-VGLUT3 transfecção (Figura 3B) 26 sugere que a transfecção via RWM é mais eficaz e uniforme através de toda a cóclea do que outros métodos que têm relatado taxas de transfecção superior mais perto do local de entrega viral. Verificou-se que as taxas de transfecção pode ser feito mais eficiente, aumentando o volume do vírus injectado no ouvido interno (Figura 1) 26. Nossa observação de expressão VGLUT3 sucesso em VGLUT3 KO rato IHCS com nenhum dano coclear nos levou a testar ouvir medindo ABRs nos camundongos KO resgatados. Figura 4A e 4B 26 documento a capacidade de entrega RWM pós-auricular de AAV1-VGLUT3 no e interiorar dos ratos VGLUT3 KO para produzir resgate ouvir neste modelo de ratinho de perda auditiva congênita. Audiometria de tronco encefálico (ABR) vestígios foram restaurados no VGLUT3 resgatado KO (Figura 4A), e os limiares ABR eram mensuráveis ​​e comparáveis ​​aos observados em camundongos selvagens (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig1highres.jpg" /> Figura 1:. VGLUT3 IHC transfecção após a entrega viral RWM para P10-P12 KO ​​O cochleae transfectadas foram examinados no P30 por imunofluorescência utilizando anticorpos anti-MYO7A, um marcador de células de cabelo, e um anticorpo contra VGLUT3. MYO7A e VGLUT3 foram expressos em todos os IHCS apenas no WT, enquanto IHCS de camundongos KO expresso apenas MYO7A. O cochleae resgatado rato mostrou alguns IHCS expressam VGLUT3, e todos os IHCS expressa MYO7A (linha 3) IHC:. Células ciliadas internas. Reimpressão com permissão de26. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52187/52187fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig2highres.jpg" /> Figura 2: Rato coclear todo o monte de imunofluorescência após o parto RWM AAV2-GFP para camundongos selvagens P10-P12 AAV2-GFP foi usado para avaliar a entrega viral utilizando a abordagem pós-auricular para a cóclea mouse.. Entrega AAV2-GFP foi feito em P10-12 e expressão da GFP transgénico foi examinada na cóclea em P21 utilizando um anticorpo anti-GFP. Expressão GFP (green) em camundongos WT coclear todo-mount mostrar mais forte expressão da GFP em células ciliadas externas (CCE) do que as células ciliadas internas (CCI). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig3highres.jpg" /> Figura 3: Rato coc<html> hlear imunofluorescência conjunto de montagem após a entrega RWM AAV1-GFP para ratinhos de tipo selvagem P10-P12. Após a entrega AAV1-GFP para a expressão de GFP cóclea é visto em células ciliadas internas (IHC) e células de suporte (A), mas não CCEs , ao passo que a entrega AAV1-VGLUT3 para a cóclea do VGLUT3 KO ratinhos (B) resultou na expressão VGLUT3 apenas em IHCS. O número de IHCS expressando VGLUT3 nos ratinhos KO cóclea VGLUT3 após o parto AAV1-VGLUT3 depende da quantidade de vírus entregue ao ouvido interno; por exemplo, 40% de IHCS quando expressa VGLUT3 0,6 ul do vírus foi injectada, ao passo que 100% dos IHCS expressa VGLUT3 após 1 ul do vírus foi entregue. Não houve diferença na expressão de VGLUT3 entre o vértice, meados de mudança de direcção ou de base quando 0,6 ul de vírus foi injectado. Reimpressão com permissão de 26. g &quot;/&gt; . Figura 4: Audiometria de tronco encefálico (ABR) avaliação de formas de onda ABR representativos após o parto AAV1-VGLUT3 foram semelhantes entre os camundongos resgatados e do tipo selvagem; em contraste, não há formas de onda ABR foram observadas nos ratinhos KO (A). KO resgatados também mostrou limiares ABR mensuráveis. Estes limiares ABR foram comparáveis ​​aos observados nos ratinhos WT para todas as frequências de medição (B). I:. ABR onda I. Reprint com a permissão de 26 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52187/52187fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K visualizações.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Biologia do Desenvolvimento

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) has been shown to be a useful approach to local drug delivery into the inner ear. The goal of this article is to describe, in detail, the surgical techniques involved in canalostomy in both adult and neonatal mice. As indicated by fast-green dye and adeno-associated virus serotype 8 with the green fluorescent protein gene, the canalostomy facilitated broad distribution of injected reagents in the cochlea and vestibular end-organs with minimal damage to hearing and vestibular function. The surgery was successfully implemented in both adult and neonatal mice; indeed, multiple surgeries could be performed if required. In conclusion, canalostomy is an effective and safe approach to drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice and may be used to treat human inner ear diseases in the future.

Here we describe canalostomy procedure which allows local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice through the semicircular canal with minimum damage to hearing and vestibular function. This method can be used to inoculate viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse inner ear.

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Genética

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Neurociência

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small, easy-to-handle New World monkey which has a similar anatomy of the temporal bone, including the middle ear ossicular chains and inner ear to humans, than in comparison with that of rodents. Here, we report a reproducible, safe, and rational surgical approach to the cochlear round window niche for the drug delivery to the inner ear of the common marmoset. We adopted posterior tympanotomy, a procedure used clinically in human surgery, to avoid manipulation of the tympanic membrane that may cause conductive hearing loss. This surgical procedure did not lead to any significant hearing loss. This approach was possible due to the large bulla structure of the common marmoset, although the lateral semicircular canal and vertical portion of the facial nerve should be carefully considered. This surgical method allows us to perform the safe and accurate administration of drugs without hearing loss, which is of great importance in obtaining pre-clinical proof of concept for translational research.

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

We report a surgical method to administrate drugs to the inner ear of a non-human primate, the common marmoset (Callithrix jacchus), via the round window membrane.

Um procedimento cirúrgico para a administração de drogas para o ouvido interno em um Non-Human primatas Sagui (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Injeção transtimpânica

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Resumo

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