Este trabalho foi apoiado por F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), e R01 NS052669 (GKP) e EIA9100012. Os autores agradecem Eileen Kasperek para perícia e assistência com a biologia molecular e cultura de tecidos; e Jason Myers para a partilha de dados obtidos a partir primeiros neurônios corticais pré-frontais.

1. Cultura de células e Protein Expression <ol><li> Manter células HEK293 (ATCC número CRL-1573) entre as passagens 22 e 40, que inclui passagens realizadas pela ATCC, em cultura em monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a mistura de 5% de CO 2 e 37 ° C. Entre as experiências, as células de passagem em frascos T25 em 5-20 diluições em um volume final de 10 ml. Nota: A utilização de células durante essas passagens garante a saúde das células favorável que permitirá a formação de selo ideal e estabilidade patch. </li><li> Para a transfecção, as células HEK293 prato em pratos de 35 mm a uma densidade de ~ 10 5 células / prato, o que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensão de células por prato e crescer células em 2 ml de meio por 18-24 horas. </li><li> Numa esterilizado de 1,5 mL do tubo de centrífuga, preparar a mistura de transfecção para quatro placas de 35 mm por adição (por esta ordem): (1) 1 ug de cada ADNc (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ul deágua bidestilada (DDH 2 O); (3) 350 ul de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), e (4) 35 ul de 2,5 M de CaCl2 gota a gota, a qual é usada para formar o precipitado. </li><li> Tubo de vórtice durante 5 segundos e adicionar 175 ul de suspensão de transfecção de cada uma das quatro placas 35 milímetros plaqueadas no dia anterior, que agora contêm células de 50-60% de confluência, e incuba-se as células a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Aspirar fora o meio de transfecção, lavou-se com PBS e substituir com 2 ml de meio de crescimento suplementado com 2 mM de MgCl2 para impedir o receptor de NMDA excitotoxicidade mediada 9. Nota: As células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos 24-48 horas após a transfecção. </li></ol> 2. Eléctrodo Preparação <ol><li> Gerar duas pipetas de gravação simétricas puxando tubos de vidro de borosilicato com um puxador vertical. Com base no tamanho e geometria da ponta resultante, mais pipetas formausando um polidor. Nota: O tamanho da ponta pode ser avaliado visualmente e eletricamente. Visualmente, o diâmetro exterior deve estar no intervalo de 1,4-5,6 mM. Electricamente, uma ponta de tamanho ideal, quando preenchidos com a solução extracelular, deve produzir resistências na gama mohms 12-24 (ver Figura 2B). </li><li> Use uma solução de pipeta, que para experimentos com células anexado representa o meio extracelular que irá produzir a atividade do canal máxima e altas amplitudes atuais. Nota: Para os receptores de NMDA, o que corresponde a uma solução contendo as concentrações saturantes de agonistas (glutamato e glicina), 1 mM de EDTA, que quela os inibidores bivalente catiónicos e bloqueadores, e tem concentrações fisiológicas de sódio (150 mM) como o único ião permeante ( em mM: glutamato 1, 0,1 glicina, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA a 1, e 10 HEPBS, tamponada a pH 8,0 com NaOH 1 N). </li></ol> 3. Gravação patch-clamp anexado-Cell <ol><li> Abrir softwa aquisição de dados QUBre (www.qub.buffalo.edu), e selecione a janela de aquisição em &#39;esquema&#39;. Abra um novo arquivo de dados QUB (QDF), clicando em &quot;New Data&quot; sob o menu drop-down intitulado &#39;File&#39; e digite os seguintes parâmetros iniciais: taxa de amostragem, 40 kHz; A escamação / D, 3000; canal de saída, 1; e tamanho de dados A / D, 2. Ajuste a escala de amplitude de 0,1 V / Pa, clicando com o botão direito no arquivo de dados, selecionando propriedades e clicando na guia &#39;dados&#39;. Nota: Estes parâmetros podem ser refinados para cada configuração usando uma célula modelo no modo conectado à célula. Instrução adicional sobre a aquisição de dados com software QUB e propriedades QDF estão online no www.qub.buffalo.edu. </li><li> Seleccione um prato de 35 mm contendo canais de iões de células que expressam e substituir o meio de crescimento com 2 ml de PBS contendo cálcio e magnésio; montar o prato para o palco microscópio e foco no campo celular por microscopia de contraste de fase para avaliar que as células são saudáveis ​​e bem ligado ao pratoem monocamada de moda (Figura 1A). Mudar para detecção de fluorescência para verificar que a transfecção foi bem sucedida (Figura 1B). Nota: A escala de intensidade de fluorescência pode ser utilizado como uma medida da expressão da proteína em bruto. </li><li> Para a gravação de um único canal, ajuste o ganho do amplificador de saída para x10, configuração patch para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, o modo de tensão-clamp e aplicada tensão para 100 mV. Com o comando de tensão de retenção na posição OFF, selecione o botão &quot;teste de vedação. </li><li> Com base na fluorescência e saúde celular, escolher uma célula para corrigir. Verifique sob contraste de fase que a célula é bem ligado ao prato, tem uma grande porção da superfície da célula exposta para remendar, e caso contrário, parece saudável. Nota: Manter a iluminação de contraste de fase, para evitar o branqueamento do celular durante a abordagem e patch-fixação. </li><li> Preencha uma pipeta recém polida com apenas uma solução suficiente para que ele faz contato com a electrode e agitar suavemente para retirar as bolhas de ar que possam estar presas na ponta. Fixe a pipeta de gravação para o headstage amplificador, apertando o parafuso de vedação do titular da pipeta e certificando-se de que o fio de prata está imerso na solução de pipeta. </li><li> Usando um pequeno (5 cc) de seringa de plástico, o qual está ligado ao suporte da pipeta por tubagem, aplicar suavemente a pressão positiva para prevenir a entrada de impurezas e entupimento da ponta, durante a abordagem (Figura 2A). </li><li> Usando o micromanipulador, direcionar a pipeta para o banho e posicioná-lo diretamente sobre a célula selecionada para remendar (Figura 1C), fechando o circuito elétrico. Tome nota do osciloscópio, que deve indicar uma forma de onda retangular correspondente ao sinal de teste de vedação do amplificador (Figura 2B). Nota: Após a entrada para o banho, a resistência pipeta dentro da faixa ideal é de 12-24 mohms. Para um sinal de teste de 5 mV, a corrente medida range corresponde a ~ 20-40 pA. </li><li> Enquanto monitoriza a posição da pipeta visualmente através de um microscópio e pipeta resistência eléctrica no osciloscópio, continuar a abordagem em pequenos incrementos até que a pipeta colide suavemente sobre a célula, e o sinal de teste diminui ligeiramente para indicar o aumento da resistência (Figura 2B). </li><li> Para formar uma vedação, escolhe-se a seringa e aplicar uma ligeira pressão negativa através do tubo lateral, puxando o êmbolo da seringa, o que puxa a membrana celular para dentro da ponta da pipeta de gravação e inicia a formação de um selo de resistência GÊ 10. Tome nota da forma de onda do sinal de teste no osciloscópio, em que a formação de selo é indicado por seu achatamento completo, com apenas transitórios capacitivos visíveis (Figura 2B). Nota: Se o sinal não achatar ou completamente a linha de base torna-se barulhento, isso indica um selo fraco com vazamento de corrente substancial em torno do selo. Isso vai evitar que resolving uma correntes de canal. Se este for o caso, retirar a pipeta a partir da célula e para fora do banho, removê-lo a partir da fase de cabeça e descartá-lo. Repita o processo com uma pipeta de recém polida até a obtenção de um selo na faixa adequada (≥ 1 GÊ). </li><li> No amplificador, mude o comando externo de alternância de &#39;test selo&#39; para &#39;off&#39;; mudar o comando de tensão segurando para positivo (que foi previamente definido como &#39;off&#39;); e aumentar o ganho de x100. Observe o osciloscópio para a atividade do canal, que, se presente, será mostrado como desvios quadrados para cima da linha de base anteriormente plana (Figura 2C). </li><li> Se a atividade do canal é exibido no osciloscópio, adquirir dados no arquivo digital anteriormente aberto QUB, pressionando o botão &#39;play&#39;, seguido do botão &quot;gravar&quot;. Para interromper a aquisição de dados, pressione o botão Parar no QUB, e salve o arquivo com um QDF facilmente retrievlocalização capaz no disco rígido do computador selecionando &quot;Salvar dados como ...&quot; no menu drop-down intitulado &#39;File&#39;. </li></ol> 4. Dados pré-processamento e Idealização Nota: Informações importantes podem ser extraídos a partir de gravações de canal único por análises estatísticas, que atribui a cada ponto de dados a uma classe condutância apropriado (no caso mais simples, fechadas ou abertas). Este processo é referido como idealização de dados e uma breve descrição da idealização de dados com os meios de k segmentares (SKM) método 11 em qub se descritos abaixo. <ol><li> Abra o arquivo de dados em QUB, e ver os traços atuais na interface &#39;pré&#39; em &#39;esquema&#39;. Mostrar o arquivo gravado não filtrada (remover filtro digital), desmarcando a caixa &quot;Fc. </li><li> Visualmente a varredura do registro para detectar irregularidades e artefatos (Figura 4A). Breves picos de corrente correto que ocur dentro do traço (Figura 4A), selecionando uma região limpa ao lado da mesma classe condutância, com destaque para a região, clicar botão direito e selecionando &quot;tampão erase definido. &#39; Zoom sobre o pico até pontos de amostragem individuais são visíveis, selecione a região a ser substituído e apagar destacando apenas nesta região e, em seguida, clique com o botão direito &quot;apagar&quot;. </li><li> Definir a linha de base atual de zero para todo o registro selecionando uma parte inicial do registro, onde a linha de base é estável, destaque, clique com o botão direito e selecione &quot;linha de base definida. Verifique se a diretriz que aparece com precisão representa o nível basal (roxo na Figura 4B) </li><li> Identificar pontos no registro onde a linha de base de dados brutos desvia visivelmente a partir da linha de base set. Corrija isso selecionando uma pequena seção da linha de base na região desviar, clique com o botão direito e selecione a opção &#39;adicionar um nó de base &quot;de comando. </li><li> Identificar regiões de tele gravação contendo excesso de ruído ou artefatos que não pode ser facilmente corrigido (Figura 4C). Destaque a região a ser descartado, clique com o botão direito e selecione &quot;excluir&quot;. Nota: Neste caso, a informação cinética será perdido: a Importação será menor e os pontos que ocorrem após o ponto de emenda aparecerá para ser contínuo com a região do pré-ruído. </li><li> Para idealizar registros usando o algoritmo SKM 11, destacar uma parte do rastreamento contendo tanto aberta e eventos fechados e entrar na interface de &quot;Mod&quot; em &quot;Layout. &#39; No painel &quot;modelo&quot;, destacar uma parte limpa do traço que é representante da linha de base em todo o arquivo, clique com o botão direito no quadrado preto (estado fechado) e selecione &quot;agarrar&quot;. Faça o mesmo para as aberturas de canal, destacando a condutância aberto, clique o botão direito no quadrado vermelho no painel &quot;modelo&quot; e selecione &quot;agarrar&quot;. </li><li> Realize a idealizaçãoção para todo o registro, selecionando o botão &quot;Arquivo&quot; em &quot;fonte de dados&quot;. Clique com o botão direito do mouse na guia &quot;idealizar&quot; debaixo da seção &#39;Modelagem&#39; para verificar se os parâmetros desejados para análise estão corretos e, em seguida, clique em &quot;Executar&quot;. O resultado da idealização, juntamente com o histograma de amplitude para o arquivo inteiro, é sobreposto com os dados para permitir a inspeção visual da idealização (Figura 5). Nota: idealização inadequada pode levar à geração de &quot;eventos falsos, &#39;em que QUB detecta aberturas e fechamentos de canais que realmente não ocorrer. Dentro da resolução de gravação, o qual é definido pelo filtro analógico do amplificador e da taxa de amostragem, a resolução com as quais SKM detecta eventos de abertura e fecho podem ser controlados pela fixação de um tempo morto para as análises. Tempos mortos ideais devem ser selecionados por tentativa e erro e dependerá de taxa de amostragem, no entanto, uma boa regra de ouro épara selecionar um tempo morto que é de 2-3 amostras de 12. </li><li> Para verificar se a idealização representa com precisão os dados brutos, procurar manualmente o traço idealizado. Após a identificação de erros na idealização, realce o traço sobre o falso evento, clique direito e selecione &quot;Join Idl. Nota: Para as opções adicionais e uma explicação detalhada de vários comandos e funções em QUB, consulte o manual on-line QUB (www.qub.buffalo.edu). </li></ol>

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Os autores deste manuscrito declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

No campo canal iônico, uma importante área de pesquisa é dedicado à compreensão da seqüência de eventos que leva ao canal de abertura ou mecanismo de propagação do canal. Para a maioria dos canais, este processo é complexo e envolve várias etapas cinéticas, que não pode ser deduzida a partir de um sinal multicanal macroscópica. Em contraste, os experimentos podem ser projetados em observar a seqüência de eventos aberto / fechado no registro de canal único pode produzir informações mais detalhadas sobre gating mecanismos. Nos métodos descritos aqui, o domínio de ligação ao ligando, localizados externamente possuída pelos receptores NMDA permite gravações de patch-clamp minimamente invasivas para ser realizada sob condições constantes. Este protocolo pode ter de ser adaptado, a fim de ser adequado para a investigação de outros canais iônicos ligante dependendo tanto de ligação e propriedades receptoras. Registros de atividade do canal único fornecer dois tipos de informações valiosas. Primeiro,porque a amplitude da corrente unitária pode ser medido diretamente, os experimentos podem ser projetados para obter informações sobre as propriedades dos poros, como canal de condutância, permeabilidade e seletividade. Em segundo lugar, porque a duração dos eventos abertos e fechados também pode ser medido diretamente a partir do registro, os experimentos podem ser projetados para obter informações sobre a cinética de propagação e, assim, fazer inferências sobre o mecanismo de funcionamento do canal. Para ambos os tipos de experimentos, análise estatística significativa requer binning cada ponto individual do rastreamento atual a uma classe condutância específica. Apresentado aqui foi um tal método de fazer isto, utilizando os k-segmentares meios (SKM) 11 algoritmo, no entanto, esta pode ser realizada por vários algoritmos mais ou menos sofisticadas, incluindo semi-limiar, SCAN 12, Baum-Welch, Viterbi, etc Gravações usando a configuração anexado células são poderosos em que os canais iônicos são preservados em biológicomembranas com ambientes intracelulares não perturbados. Devido a isto, é essencial que opérculos são adequadamente formado e mantido ao longo do registo com duas finalidades: 1) de continuidade experimental e 2) manter uma relação favorável de sinal-para-ruído (pico a pico do ruído de linha de base &lt;2 pA). O tamanho e forma da ponta da pipeta geradas determina a probabilidade de um selo de membrana bem sucedida contendo exactamente um canal. A ponta plana garante que quando a pipeta se aproxima da célula que vai tocar e pressionar para a membrana celular com toda a superfície da ponta de uma só vez, ajudando a selar de maneira uniforme sobre a célula. A pipeta com uma dica que é muito grande vai ser menos propensos a resultar em manchas de um canal; em contraste, após puxar uma pipeta com uma ponta que é demasiado estreita irá resultar num ciclo de membrana em forma de ómega, que pode vedar na base e entupir a pipeta 10. Um sinal favorável à relação de ruído pode ser gerenciado por minimizar fontes de elétricaruído. O recurso de refrigeração headstage no Axopatch 200B tem permitido para a resolução de sinal ótimo; no entanto o ruído pode ainda ser produzido por qualquer dos instrumentos envolvidos na electrofisiologia configurar, bem como fontes externas, tais como a luz e electrónica independentes. Felizmente, várias estratégias podem ser implementadas para minimizar o ruído a um nível desejado 2, 27. Resumidamente, certifique-se que as peças de equipamentos que são capazes de produzir ruído são fundamentadas em um único ponto dentro do setup. Ao fazer isso, é importante para evitar a formação de circuitos de terra que vai causar um ruído significativo. Além disso, se 60 ruído ciclo está presente, não se esqueça de desligar todas as luzes que possam estar interferindo com o sinal de gravação. Finalmente, colocando uma gaiola de Faraday em torno do aparelho de gravação irá impedir obstáculos próximas de causar ruído elétrico. Observando um canal para um longo período de tempo demonstrou que gatingalterações conformacionais pode ocorrer ao longo de uma ampla gama de escalas de tempo. Temporalmente, os dados de patch-clamp são limitadas na extremidade &#39;curto&#39; pela largura de banda do amplificador e a taxa a que o sinal amplificado é digitalizado e no final &quot;longa&quot; pela janela de observação. Para mudanças de conformação que são mais rápidos do que o limite baixo, as gravações de patch-clamp só pode oferecer informações quando combinada com abordagens experimentais complementares. Para mudanças conformacionais que ocorrem com taxas muito lentas, e, portanto, são amostrados com pouca freqüência, pode-se aumentar o número de observações ou aumentar a duração do registro, no entanto, isso pode não ser sempre possível. Apesar destas limitações, os dados de patch-clamp, particularmente quando obtidos a partir de um canal individual, muitas vezes contêm mais informações do que imediatamente extraível com metodologias computacionais atuais. Assim, a expectativa é que os futuros aumentos de capacidade computacional e da Sophistication de algoritmos de análise vai fazer possíveis aplicações adicionais. Após o advento de tais avanços, é previsível que as gravações de patch-clamp de canais individuais podem ser capazes de ocorrer em simultâneo com as medições se preocupe, imagens de cálcio ou mesmo em preparações in vivo para fornecer mais informações sobre a estrutura, funcionamento e dinâmica dos canais iônicos em ambos os ambientes nativos e controladas. Como a diversidade de canais iônicos investigado aumenta, compreensão detalhada dos seus mecanismos de propagação e, finalmente, a compreensão de como a sua operação contribui para as suas funções biológicas únicas serão beneficiados a partir de observações de moléculas individuais. Em particular, os dados obtidos com a promessa de patch-clamp de um canal para informar sobre as propriedades de condutância unitários e seqüências de propagação para canais recombinantes e nativos.

Comunicação rápida através das membranas biológicas depende quase que exclusivamente em proteínas de membrana oligoméricas poros formando, comumente referido como canais. Estas proteínas são muito diferentes em sinais de ativação, mecanismos de propagação e as propriedades de condutância. Proteínas canal cujo poros são seletivos para os íons são classificados como canais iônicos; sua ativação produz correntes iônicas através da membrana, e suas respostas podem ser gravados com alta resolução em tempo real, usando técnicas eletrofisiológicas. Os sinais de ativação abrangem uma ampla gama de insumos químicos e físicos, incluindo gradientes de concentração, forças mecânicas e elétricas, e temperatura; Assim, a classificação mais canais iônicos em ligante fechado, mechanosensitive, tensão fechado, ou tipos sensíveis ao calor. Neste artigo, os protocolos estão descritos para registar a actividade de um canal de um canal fechado ligando, o receptor de NMDA, e um canal mechanosensitive, Piezo1, usando a técnica de patch-clamp.0; Patch-clamp electrofisiologia é a primeira e mais largamente utilizado o método experimental suficientemente sensível para permitir a observação de moléculas individuais 1, 2. Além dessa sensibilidade apurada, ele expandiu enormemente as preparações biológicas passíveis de registros eletrofisiológicos e também permitiu a observação de canais iônicos em membranas intactas. Em primeiro lugar, porque, tanto de fixação de tensão e corrente de gravação são realizadas com o mesmo eléctrodo, que pode ser utilizado para gravar sinais através de pequenas células ou membranas de remendos. A técnica revelou que canais iônicos não se restringem a membranas excitáveis ​​dos músculos do sapo, electroplaques enguia, ou axônios gigantes de lula 3, 4, mas sim que eles representam luminárias onipresentes de transmembrana mecanismos de sinalização e são intrínsecos a todos os tipos de membranas celulares de uni ou organismos multicelulares, e também às membranas intracelulares. Importaçãoantly, a capacidade de gravar correntes transmembrana, basta anexar uma pipeta de vidro de uma célula intacta desde que a oportunidade sem precedentes para gravar a atividade de canais iônicos em suas membranas ininterrupto nativas. Assim, a célula ligada técnica de patch-clamp, que é descrito neste protocolo, permite monitorar a atividade dos canais iônicos continuamente por dezenas de minutos ou mais em seu ambiente nativo. Sob flutuações térmicas normais, todas as proteínas, incluindo proteínas de canais iônicos, são submetidos a mudanças estruturais mais de uma escala de tempo largo, com os rearranjos mais rápidas e mais freqüentes representados provavelmente por movimentos de cadeia lateral e muito mais lentas mudanças, menos freqüentes representados pelo reposicionamento de toda domínios ou sub-unidades, ou em alguns casos por modificações pós translacionais ou interações proteína-proteína 5, 6. Observando longos períodos de atividade geradas por uma molécula pode ajudar a compreender a funçãodinâmicas tradicionais de canais de íons nas membranas fisiológicas intactas e fornece informações valiosas sobre o mecanismo operacional da molécula observado. Em contraste com a crescente compreensão da diversidade de canais iônicos em todo os tipos de células e estágios de desenvolvimento, o conhecimento sobre a composição molecular de canais iônicos em membranas nativas ainda é limitada. Todos os canais iônicos são proteínas multiméricas ea maioria dos canais iônicos nativas montar a partir de vários tipos de subunidades que produzem proteínas da diversidade molecular de largura, que é muitas vezes acompanhada com diversas condutância e gating propriedades. Por esta razão, os canais de iões da composição molecular definida são estudados por expressão em sistemas heterólogos. Em particular, as células HEK293, que são uma linha clonal de células embrionárias de rim humanas imortalizadas 7, ganhou aceitação generalizada como o sistema preferido para a expressão heteróloga de canais de iões recombinantes. Entre o homemvantagens y que elevaram células HEK293 como o sistema de escolha para canal iônico eletrofisiologia são a facilidade e acessibilidade de cultivo e manutenção de culturas estáveis ​​de longa duração, a sua capacidade de realizar pós-translacional dobrar, processamento e tráfico de proteínas de mamíferos, e em muitos casos , o seu nível baixo ou até mesmo ausência de expressão endógena para o canal de interesse 7, 8. Expressando os canais de iões recombinantes e estudar as suas propriedades funcionais em células HEK293 que continua a ser uma ferramenta valiosa para obter informações sobre as propriedades de estrutura-função de canais iónicos, assim como das propriedades específicas das isoformas dos canais de iões e os seus papéis no tecido nativo. Os protocolos descritos neste artigo pode ser aplicado igualmente bem para os canais de iões recombinantes expressos em células HEK293 e a canais de iões nativos. Em resumo, a técnica de patch-clamp, através da sua capacidade sem precedentes para resolver sinals de uma molécula permanece, até hoje, o método mais direto para observar o comportamento de moléculas individuais. Em seu modo conectado à célula, gravação de patch-clamp permite longos períodos de observação que, quando feito por uma molécula, pode proporcionar uma visão excepcional sobre o funcionamento de canais iônicos. Abaixo é apresentado um protocolo para a obtenção de alta resolução a partir de gravações atuais celulares manchas anexo contendo uma proteína de canal iônico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:189px;">Chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:205px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosillicate Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bright field inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1x51</td>
			<td>Nikon also has similar microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluroescent box</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>Series 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Light Guide</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>OEX-LG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td colspan="2">Axon Axopatch 200B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">63561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIDAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>776844-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Microforge MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday Cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">8133306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Pressure Clamp</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA HSPC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressue/Vaccuum Pump</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PV-PUMP</td>
			<td>For HSPC-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-channel cell-attached patch-clamp recording

Proteínas de canais iônicos são dispositivos universais para comunicação rápida através das membranas biológicas. A assinatura temporal do fluxo iónico geram depende das propriedades intrínsecas de cada proteína de canal, bem como o mecanismo pelo qual é gerada e controlada e representa uma importante área de pesquisa actual. Informações sobre a dinâmica de funcionamento de proteínas de canais iónicos pode ser obtida observando longas extensões de corrente produzidos por uma única molécula. Descrito aqui é um protocolo para a obtenção de ligado de células de patch-clamp gravações actuais um canal para um canal de iões fechado ligando, o receptor de NMDA, expresso de forma heteróloga em células HEK293 ou nativamente em neurónios corticais. Também são fornecidos instruções sobre como adaptar o método para outros canais de íons de interesse, apresentando o exemplo do canal Piezo1 sensível ao mecano. Este método pode fornecer dados sobre as propriedades de condutância do canal ea seqüência temporal de opeconformações n fechados que compõem mecanismo de ativação do canal, ajudando a compreender as suas funções na saúde e na doença.

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One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

24.2K visualizações.  University at Buffalo, SUNY.  Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

Gravação de ECG ambulatorial em Ratos

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...