Este trabalho foi financiado pelo NIH HL109478 (KNF). Os autores reconhecem e agradecem Gina Kim e Joann Taylor para a sua assistência em isolar e manter o PASMC na cultura.

O Animal Care Institucional e Comitê de uso da Northwestern University aprovou este protocolo. 1. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day One <ol><li> Prepare os completos M199 mídia - Misturar 400 ml M199 com 100 ml (concentração final = 20%) de calor FBS inativado e 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina. </li><li> Preparar o soro grátis M199 Media - Misture 500 ml M199 com 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina. </li><li> Prepare o PA Agarose - Mix 0,05 g de agarose mais 0,05 g de partículas de ferro em 10 mL estéreis, sem soro M199 mídia. </li><li> Prepare o Lung Agarose - Misturar 0,1 g de agarose em 10 ml estéreis, sem soro M199 mídia. </li><li> Preparar a colagenase - colagenase mistura em estéreis, isentos de soro no meio M199 a uma concentração final de 80 U / ml e, em seguida, esta mistura de filtro estéril. </li&gt; <li> Configure todos os equipamentos antes do tempo antes de eutanásia do mouse. </li><li> Definir PA agarose e pulmão agarose a ferver logo antes de eutanásia do mouse. </li><li> Sacrificá o mouse na jarra com overdose de anestésico isoflurano e ter cuidado para não permitir que o mouse cachorro para entrar em contato com o isoflurano. O melhor rendimento de células é obtido quando as células são colhidas imediatamente após a morte, a fim de evitar os micro-coágulos que se formam na circulação após a morte. </li><li> Remova o mouse do frasco do anestésico, garantir o mouse para o conselho operacional e esterilizar o mouse, instrumentos e luvas com álcool. </li><li> Coloque o bisturi com a lâmina e inciso o mouse desde o pescoço até o abdômen inferior. </li><li> Abra o abdómen do lado esquerdo do rato, expor o rim, e corte da artéria renal, para permitir que o rato para desangrar, evitando assim a formação de coágulos nos pequenos vasos dos pulmões. </li><li> Use a tesoura para cortar ao longo do lado esquerdo do rato deesterno para abrir o tórax. </li><li> Cuidadosamente use bisturi para cortar o diafragma em ambos os lados e abrir completamente a cavidade torácica. Use uma pinça ou pinos para segurar a cavidade torácica aberta. </li><li> Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada direcionada para o PA e perfundir o RV / PA / pulmões com PBS estéril até os pulmões aparecem em branco (todo o sangue liberado para fora da circulação pulmonar). Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PBS, dependendo do tamanho do animal. É importante lavar primeiro a prevenir a formação de coágulos nos vasos pulmonares pequenas. </li><li> Cuidadosamente use dissecção romba para expor a traquéia e um fio por baixo da sutura. </li><li> Coloque os menores fórceps debaixo da traquéia para suporte e coloque o angiocateter G 24 na traquéia. Colocar o angiocateter como se colocando uma IV. </li><li> Fixe o angiocateter na traquéia com sutura enfiada no passo 1.16. </li><li> Leve a ferver PA agarose de água fervente, e inverter para misturar bem. Resfriar o agarosi, a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que vai danificar as células do PA. </li><li> Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada e perfundir o RV / PA / PA pulmões com agarose até os pulmões aparecem na cor cinza. As partículas de ferro na mistura de agarose fará com que os pulmões aparecem na cor cinza. Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PA de agarose, dependendo do tamanho do animal. É também importante para ir lentamente como injecção muito rápido pode fazer com que o ferro de vazamento para as vias respiratórias. </li><li> Pegue o pulmão agarose de água fervente e inverta para misturar bem. Em seguida, arrefecer a agarose a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que danificam as células do pulmão. </li><li> Elaborar a agarose pulmão e anexar a seringa ao angiocateter G 24 na traquéia. Infundir a agarose através da traquéia para inflar completamente os pulmões. Os pulmões será easier para picar (veja as etapas posteriores) se os pulmões estão adequadamente inflado. </li><li> Remover o bloco de coração-pulmão, e mergulhado em 25 ml de PBS gelado para solidificar a agarose (~ 5 minutos). Use esse tempo para limpar a área cirúrgica. </li><li> Para camundongos recém-nascidos (P7-P21), o melhor rendimento PASMC vem da combinação 2-3 filhotes em um lote de células. PASMC preferem estar em contato com outras células para a saúde celular ideal e crescimento. Se um rato é usado por isolamento, em seguida, as células são muito escasso e não se desenvolvem bem. Ao combinar os animais, colheita e frio os blocos coração-pulmão em conjunto e, em seguida, passar para picar uma vez que todos os blocos coração-pulmão foram retirados dos animais. </li><li> Mover-se para a capa de cultura de células para a esterilidade deste ponto em diante. </li><li> Colocar os pulmões refrigerados na tampa do 10 centímetros prato de cultura de tecidos e remover cuidadosamente o coração, timo, traqueia, e de qualquer tecido conjuntivo a partir dos pulmões. </li><li> Mover os pulmões para a parte inferior do prato de 10 centímetros de tecido de culturae adicionar cerca de 1 ml gelada estéril PBS. </li><li> Picar os pulmões em pedaços muito pequenos (1-2 mm) com dois bisturis. </li><li> Quebrar a ponta fora de uma pipeta de 5 ml sorológica estéril. Pipeta picados lama pulmão em tubo de 50 ml estéril. Utilização adicional estéril PBS gelado para lavar a placa para assegurar que todo o tecido pulmonar entra no tubo de 50 mL cónico. </li><li> Coloque o tubo de 50 ml cônico sobre o ímã. Aguardar o tecido contendo ferro para mover para o lado do tubo ao lado do íman. Dependendo da proporção do navio contendo ferro para tecido pulmonar, alguns dos recipientes pode ainda ser flutuante neste ponto. Aspirar fora da PBS devagar e com cuidado tentando não aspirar o tecido pulmonar flutuante, uma vez que não está claro se ele contém vasos. </li><li> Lava-se a pelete 3x pulmão com 5 ml de PBS estéril, novamente para tentar minimizar a quantidade de tecido do pulmão que é aspirado. </li><li> Ressuspender o sedimento de pulmão em 3 ml de colagenase e despeje em 60 milímetros de tecido prato de cultura. Nãotentar pipeta isso, os pedaços do pulmão vai ficar com o interior de sua pipeta. </li><li> Use um adicional de 3 ml para enxaguar o tubo após o vazamento, e não derramar sobre isso em 60 milímetros de tecido prato de cultura também. </li><li> Colocar em 37 ° C incubadora de cultura de tecido durante 1 hora. </li><li> Pipeta tecido + pasta colagenase cima e para baixo com uma agulha 15 G contundente em uma seringa de 5 ml até que todos os grandes pedaços de pulmão são interrompidas. O tecido + pasta de colagenase será nublado neste momento, sem pedaços de tecido visíveis. </li><li> Despeje em um novo tubo de 50 ml estéril e anexar ao ímã. </li><li> Lava-se a placa de cultura de tecido com cerca de 5 ml de meio M199 completo para assegurar que todo o tecido tenha sido recolhido, e despeje este para dentro do tubo cónico. </li><li> Aspirar fora da colagenase + media sobrenadante. Desta vez, não será muito poucos flutuadores, e um sedimento contendo ferro compacto estará no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de completa media de 3x. Isto é necessário para inactivar a colagenase. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Deite o sedimento ressuspenso em tecido de 35 mm prato de cultura. Utilizando um microscópio, haverá fragmentos pequenos vasos flutuando com partículas de ferro contidos no lúmen do vaso. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido (denominado placa zero) na incubadora de cultura de tecido durante a noite. As primeiras células que migram para fora da placa de zero a cerca de 50% são fibroblastos e PASMC 50%, com base na coloração para marcadores de músculo liso. Esta placa é chamado de zero chapeado e finalmente descartado após os passos subsequentes de enriquecimento. </li></ol> 2. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day Two <ol><li> Despeje a mídia sobrenadante de placa de zero em um tubo de 50 ml limpo. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez não haverá quase nenhum floaters, e um compacto de ferro-Containing pelete vai formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Esta será uma placa (Figura 1A). </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 3. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Seis Dias <ol><li> Despeje a mídia sobrenadante de uma placa em um tubo de 50 ml limpo. Repetindo várias vezes este passo assegura que todas as células do músculo liso residentes na parede do recipiente ter uma oportunidade de migrar para fora de uma placa de cultura celular. Não é um retorno diminuindo com cada etapa ou seja, cada placa irá ter menos e menos células aderir. </li><li&gt; Refeed uma placa com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidos incubadora. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será duas placas. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 4. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Nove <ol><li> Despeje o sobrenadante mídia da cultura de tecidos prato dois em um tubo de 50 ml limpo. </li><li> Placa refeed dois com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidosincubadora. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será o prato três. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 5. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Treze <ol><li> Aspirar a mídia fora de placas de 1-3. </li><li> Delicadamente, lave as células com água morna, PBS estéril. </li><li> Adicionar uma película fina de tripsina (~ 0,25-0,5 ml) de tripsina a cada placa trypsinize para fora das células. As células são muito aderente e terão de ser em tripsina no tecido blore incubadora por aproximadamente 10 minutos para retirar a placa. </li><li> Células colheita fora das placas em 5 ml de meio completo em um tubo de 50 ml anexado ao ímã para retirar as partículas de ferro residuais. </li><li> Lava-se cada uma das placas com um adicional de 0,5 ml de meio completo e adicione que os meios para o tubo de 50 ml. </li><li> Desta vez, tomar a mídia sobrenadante (não aspirado), e descartar a partícula pelota de ferro. </li><li> Placa as células em 5 ml de meio M199 completo em um prato de 60 milímetros para ter células confluentes em poucos dias. Alternativamente, placa de células em 10 ml completos M199 mídia em uma placa de 10 cm, e PASMC levará cerca de mais 1-2 semanas para chegar a confluência. </li></ol> 6. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Quatorze <ol><li> Troque a mídia para novos completos M199 mídia para remover qualquer tripsina residual. Haverá uma população de PASMC fina em placa de cultura de tecido (figura 1B). </li></ol> 7. Cuidados de Rotina <ol><li> Troque a mídia para novos completos M199 media cerca de 2x por semana. </li><li> Ao dividir estas células, cerca de 10 min no incubador por uma película de tripsina (0,25-0,5 ml) é necessária para as células para retirar a placa. Usando o filme tripsina permite repique da PASMC sem girar as células. Se demasiado tripsina é usado, então a PASMC deve ser centrifugado para girar a tripsina, ou as células não readhere à placa. Às vezes, depois de girar as células, é difícil conseguir a PASMC ressuspenso em completa M199 mídia. </li><li> Em observações, o PASMC isolado se comportar como células musculares lisas de forma confiável por 4-5 passagens, mas as células isoladas vai manchar para células musculares lisas marcadores até passagem 7. Contar o primeiro pool 60 milímetros ou 10 centímetros prato no dia treze como passagem 2 (revestimento após a primeira exposição a tripsina). </li></ol>

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	<li>Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+the+pulmonary+vascular+bed+in+fetal+lambs.">Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs.</a> Circulation. 53, 144-151 (1976).</li><li>Walsh-Sukys, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn+in+the+era+before+nitric+oxide:+practice+variation+and+outcomes.">Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes.</a> Pediatrics. 105, 14-20 (2000).</li><li>Khemani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+hypertension+in+formerly+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia:+clinical+features+and+outcomes+in+the+surfactant+era.">Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era.</a> Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).</li><li>Jobe, A. H., Bancalari, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia.">Bronchopulmonary dysplasia.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).</li><li>Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+echocardiography+for+the+diagnosis+and+management+of+pulmonary+vascular+disease+in+young+children+with+chronic+lung+disease.">Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease.</a> Pediatrics. 121, 317-325 (2008).</li><li>Check, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction+and+pulmonary+hypertension+in+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia.">Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia.</a> J. Perinatol. , (2013).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+increases+phosphodiesterase+5+expression+and+activity+in+ovine+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 102, 226-233 (2008).</li><li>Aschner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+synthase+gene+transfer+enhances+dilation+of+newborn+piglet+pulmonary+arteries.">Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries.</a> Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).</li><li>Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hypoxia+increases+cytosolic+calcium+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).</li><li>Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+activation+by+hypoxia+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+is+age+and+site+specific.">RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific.</a> Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).</li><li>Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibroblast+growth+factor-2+expression+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+involves+increased+reactive+oxygen+species+generation.">Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).</li><li>Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturational+shift+from+PKCzeta+and+voltage-gated+K++channels+to+RhoA/Rho+kinase+in+pulmonary+vasoconstriction.">Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction.</a> Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).</li><li>Wedgwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+regulates+extracellular+superoxide+dismutase+activity+and+expression+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension.</a> Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+increases+PDE5+activity+in+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).</li><li>Chester, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinaciguat,+a+soluble+guanylate+cyclase+activator,+augments+cGMP+after+oxidative+stress+and+causes+pulmonary+vasodilation+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).</li><li>Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+voltage+gated+potassium+channel+responses+in+a+fetal+lamb+model+of+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).</li><li>Olschewski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+K(Ca)+channel+to+membrane+potential+and+O2+sensitivity+is+decreased+in+an+ovine+PPHN+model.">Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).</li><li>Aslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+lung+injury+in+a+murine+model+of+neonatal+chronic+lung+disease.">Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).</li><li>Balasubramaniam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+angiogenic+cells+restore+lung+alveolar+and+vascular+structure+after+neonatal+hyperoxia+in+infant+mice.">Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+attenuates+pulmonary+inflammation+in+neonatal+lung+injury.">Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury.</a> Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste artigo, descreve pela primeira vez o isolamento de PASMC de ratinhos em P7, P14 e P21. A fim de realizar isto, uma suspensão de agarose e 0,2 uM partículas de ferro são infundidas através de RV no PA. Devido ao pequeno tamanho das partículas de ferro, que não podem passar através do leito capilar pulmonar e assim, são depositados na pequena PA. Os pulmões são inflados, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para fora da solução usando um imã. Finalmente, os vasos foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos e as células migram fora dos vasos e para a placa de cultura. A placa inicial de células é uma mistura de fibroblastos e PASMC, e a puxar para baixo procedimento é repetido várias vezes para obter uma população enriquecida PASMC. Com uma exposição prolongada a níveis elevados, existe um risco teórico de ferro residual pode impactar o equilíbrio redox dentro das células isoladas. Assim, o cuidado é tomado na última etapa para remover todo o ferro residualantes da partilha e propagação das células. Imunocoloração para α-miosina do músculo liso e desmina é feito para confirmar que a população enriquecida é&gt; 90% PASMC. Estas células têm a PDE5 actividade enzimática, consistente com um fenótipo de células de músculo liso vascular. Curiosamente, a actividade da enzima PDE5 é diferente em PASMC isolado a partir de ratos de idades diferentes, sugerindo regulação do desenvolvimento contínuo na PASMC após o isolamento. Embora essa técnica é intelectualmente muito simples, um problema comum é a baixa produtividade de PASMC. Pode haver várias razões para este problema, mesmo quando 2-3 camundongos são agrupados. Em primeiro lugar, o melhor rendimento celular é alcançado se o procedimento de isolamento é iniciada imediatamente após o rato sucumbe à sobredosagem isoflurano. Uma vez ocorrida a morte, a forma de micro-coágulos em todo o leito vascular. Estes coágulos na vasculatura pulmonar irá impedir as partículas de ferro de entrar como muitos pequenos PA, assim, devincar o rendimento. Além disso, a viabilidade da PASMC isolado torna-se uma preocupação maior quanto maior for o ratinho é morto antes do isolamento. A etapa chave absoluta que afeta o rendimento PASMC é a infusão de ferro. Se os pulmões não são visivelmente cinza após a infusão de ferro, as possíveis razões são: 1) o ferro vai retrógrado para dentro do átrio e do fígado, dois à direita) há buraco ou rasgo na RV, ou 3), existem micro-coágulos na circulação pulmonar em algum lugar impedindo boa infusão de ferro. Por fim, notamos que PASMC isoladas de diferentes linhagens de camundongos geneticamente modificados apresentam taxas de crescimento muito diferentes na cultura após o isolamento. Portanto, quando se tenta primeiro esta técnica, o melhor é utilizar uma estirpe de tipo selvagem de ratinhos. Obviamente, a contaminação é uma preocupação em qualquer altura é um isolamento de células a partir de um animal inteiro. Todos os instrumentos são esterilizados e limpa com álcool antes do procedimento, e, em seguida, uma vez que o bloco de coração-pulmão é removido, ail dos passos seguintes são realizadas numa câmara de cultura de tecido com uma técnica estéril. Usando estas precauções junto com a mídia antibiótico contendo praticamente eliminou qualquer contaminação. Com o isolamento de qualquer linha de células primária, existe uma preocupação sobre quanto tempo uma célula manterá a sua fenótipo em cultura. Ovinos FPASMC isolado do controle e cordeiros PPHN manter seu fenótipo do músculo liso para 8 e 5 passagens, respectivamente, 7,14. Para o rato PASMC, as células começam a perder as respostas de sinalização por meio de passagem 5 e marcadores de músculo liso por meio de passagem 7 (dados não mostrados). Isso evidencia uma das limitações desta técnica. Vários ratinhos são necessários para atingir as pequenas quantidades de células, e o tempo de isolamento de células suficientes para experiências é longo; 2-4 semanas, dependendo do número de células necessárias. Finalmente, uma vez que as células são isoladas, só tem três passagens para trabalhar com eles antes de perder a sua células musculares lisas sinalizaçãorespostas. Uma área potencial de melhoramento seria desenvolver um método através do qual estas células podem ser congeladas e recuperadas com sucesso a partir de azoto líquido. Isto iria permitir ao laboratório para fazer regularmente e congelar as células como os ratos estão disponíveis, e, em seguida, os investigadores podem descongelar e utilizar as células para as experiências conforme necessário. Apesar do desafio técnico de realizar o isolamento e a longo prazo para o isolamento, estes PASMC representam uma ferramenta nova e valiosa para o estudo das vias de sinalização na vasculatura pulmonar de murino em desenvolvimento. Acreditamos que esta técnica para isolar PASMC neonatal mouse irá permitir a maior investigação das vias de sinalização importantes envolvidos no desenvolvimento da hipertensão pulmonar, o que levará a uma melhor compreensão da patogenia da doença e permitir o desenvolvimento de novos tratamentos.

A hipertensão pulmonar é normal, durante a vida intra-uterina desde a placenta serve como o principal órgão de troca gasosa e apenas 10% do débito cardíaco é circulado através do leito vascular pulmonar. No útero, as pressões pulmonares são semelhantes às pressões sistémicas devido à resistência vascular pulmonar elevada . A progressão da gestação, há um rápido crescimento da pequena PA dentro do pulmão, preparação do feto para o aumento dramático no fluxo sanguíneo pulmonar que ocorre no momento do nascimento 1. Quando a transição perinatal normal falhar em crianças de curto prazo ea termo, o resultado é a hipertensão pulmonar persistente do recém-nascido (HPP). HPP é uma síndrome clínica causada por diversas patologias subjacentes diferentes. No entanto, todas essas crianças compartilham aspectos fisiopatológicos comuns, tais como elevada resistência vascular pulmonar, hipoxemia e manobras da direita para a esquerda do fluxo de sangue através de conexões fetais persistentes, como a persistência do canal arterial ou paraamen ovale. HPP afeta 2-6 por 1.000 nascidos vivos e transmite um risco de 8-10% de mortalidade, bem como significativa a curto prazo e de longo prazo morbidade 2. Além disso, os nascidos de muito baixo peso ao nascer prematuros podem desenvolver hipertensão pulmonar como conseqüência de sua doença pulmonar subjacente. A doença pulmonar subjacente mais comum dos prematuros é a displasia broncopulmonar (DBP). Não obstante o risco de DBP se correlaciona com a idade gestacional e peso ao nascer, ainda não está claro por que um subconjunto dessas crianças se desenvolve hipertensão pulmonar significativa e como tratar adequadamente essas crianças. Maus resultados, incluindo a internação prolongada e aumento da mortalidade, são comuns 3-6. Historicamente, PASMC fetais ovinos ou PASMC fetal de suíno de animais saudáveis ​​têm sido usados ​​para estudar as vias de sinalização envolvidos na transição vascular pulmonar normal após o nascimento. Estes são tipicamente isoladas a partir de resistência à quinta geração de um PAn ovina e suína feto que é entregue e sacrificados antes de qualquer respiração espontânea 7-9. Além disso, alguns pesquisadores têm isolado e utilizado PASMC de um pouco mais velha e com respiração espontânea cordeiros e leitões em 3 dias, 2 semanas e 4 semanas 10-12. Mais recentemente, alguns grupos isolados e utilizados PASMC isolado cordeiros com HPP para examinar os distúrbios em vias de sinalização no estado de doença 13-17 com sucesso. Estas células têm provado ser uma ferramenta valiosa para examinar as vias de sinalização que são cruciais tanto na vasculatura pulmonar normal e doente a curto prazo e longo prazo. No entanto, eles não dar dicas sobre as vias de sinalização afetadas em prematuros com hipertensão pulmonar. Além disso, não permitir que as possibilidades de manipulação genética observada em modelos do rato da doença. Modelos de ratos e camundongos têm sido muito utilizados para modelar BPD e, mais recentemente, estão sendo usados ​​para hy pulmonar modeloarterial sistêmica resultante do DBP 18-22. Ratos recém-nascidos são atraentes para trabalhar devido ao seu tamanho maior, mas eles também sofrem com a falta de potencial de modificação genética. Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para investigar os efeitos de genes alvos específicos sobre a fisiologia animal inteiro em camundongos recém-nascidos, mas até agora ninguém foi previamente isolada com sucesso PASMC destes pequenos ratos. Ao isolar PASMC, maior informação pode ser obtida sobre como alterar as vias em resposta a estímulos ambientais e / ou a modificação genética específica no músculo liso da artéria pulmonar. Além disso, ao vivo PASMC podem ser visualizados em tempo real para examinar as mudanças rápidas nas principais moléculas sinalizadoras, como cálcio e espécies reativas de oxigênio 23-25. Recentemente, descreveram o isolamento de PASMC de ratinhos adultos utilizando uma variação da técnica de Marshall et al. 26 utilizada para isolar rato PASMC 23,25,26. Temos, agora, adaptado aª estendeu esta técnica para pequenos ratos 7-21 dias de idade (P7, P14 e P21). A principal limitação a esta nova técnica de isolamento PASMC é que requer múltiplos ratinhos para gerar suficientes células para as experiências e as células que crescem muito lentamente, o que é característico de células primárias de músculo liso. Apesar destas limitações, acreditamos que esta técnica para isolar PASMC neonatal mouse irá permitir a maior investigação das vias de sinalização importantes envolvidos no desenvolvimento da hipertensão pulmonar, e representa um avanço significativo nesta matéria.

<table><tbody><tr><td>Bard Parker surgical blade handle</td><td>BD</td><td>371030</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td><td>Miltex</td><td>4-310</td><td></td></tr><tr><td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td><td>BD</td><td>309657 and 306646</td><td></td></tr><tr><td>Needles (27 G, sterile)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>Monoject blunt cannula (15 G)</td><td>Kendall</td><td>SWD202314Z</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9782896</td><td></td></tr><tr><td>Dynal magnet particle collector</td><td>Invitrogen</td><td>120-01D</td><td>This is a critical tool for the protocol.</td></tr><tr><td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td><td>BD</td><td>353001, 353004, and 353003</td><td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td></tr><tr><td>Iris Scissors (4 &amp;frac12; inch stainless steel)</td><td>American Diagnostic Corporation</td><td>3424</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (4 inch stainless steel)</td><td>Quick Medical</td><td>L5-5004</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>M199 media</td><td>Mediatech</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>VWR</td><td>TX16777-164NWU</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone/Thermo Scientific</td><td>SH3091003</td><td>Heat inactivate at 55 &amp;deg;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td></tr><tr><td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td><td>Aldrich Chemical Company</td><td>#31,006-9</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butlet Schein</td><td>NDC 11695-6776-1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td></tr><tr><td>Anti-desmin antibody</td><td>Sigma</td><td>D-8281</td><td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td></tr><tr><td>Anti-smooth muscle myosin</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-562</td><td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td></tr><tr><td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td><td>Molecular Probes/Invitrogen</td><td>R-6394</td><td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td></tr><tr><td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK800-0001</td><td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td></tr><tr><td>Sildenafil</td><td>Sigma</td><td>PZ-0003</td><td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td></tr></tbody></table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

A hipertensão pulmonar é uma importante causa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Historicamente, tem sido importante estudo das vias de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso vascular em PASMC de feto de ovelha. Enquanto ovelhas fazer um excelente modelo de hipertensão pulmonar prazo, eles são muito caros e não têm a vantagem de manipulação genética encontrada em ratinhos. Por outro lado, a incapacidade de isolar PASMC de ratinhos era uma limitação significativa do referido sistema. Aqui descrevemos o isolamento de culturas primárias de rato PASMC de P7, P14, e P21 ratinhos usando uma variação da técnica descrita anteriormente de Marshall et al. 26 que foi previamente utilizado para isolar PASMC rato. Estes PASMC murino representam uma nova ferramenta para o estudo das vias de sinalização no período neonatal. Resumidamente, uma suspensão de 0,5% (w / v) de agarose + 0,5% de partículas de ferro em meio M199 é infundida no leito vascular pulmonar através do ventrículo direito (VD). Opartículas de ferro são 0,2 m de diâmetro e não pode passar através do leito capilar pulmonar. Assim, as lojas de ferro nas pequenas artérias pulmonares (PA). Os pulmões são inflados com agarose, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para baixo com um ímã. Depois de colagenase (80 U / ml) e após dissociação do tratamento, os vasos são colocados numa placa de cultura de tecidos em meio M199 contendo 20% de soro fetal bovino (FBS), e antibióticos (meio completo M199) para permitir a migração de células para o prato de cultura . Esta placa inicial de células é uma mistura de 50-50 de fibroblastos e PASMC. Assim, o puxar para baixo procedimento é repetido várias vezes, para obter uma população mais puro e PASMC remover qualquer ferro residual. Identidade da célula do músculo liso é confirmado por imunocoloração para o bom miosina muscular e desmina.

Durante e após o isolamento, PASMC sejam apreciados por microscopia óptica e por imunocoloração para os marcadores de células musculares lisas. Por microscopia de luz no início do protocolo, PASMC são vistas migrar para o prato de cultura de tecido a partir do pequeno contendo ferro vasos (Figura 1A). Depois partilha placas de um a três no dia treze, então partículas de ferro não são mais vistos como aqueles têm sido puxado para fora na etapa final pooling. Em vez disso, uma população de PASMC é visto na placa de cultura de tecido (figura 1B). Baseado em imunocoloração, as células iniciais que migram nos vasos que contêm ferro são aproximadamente 50% de fibroblastos e PASMC 50% (dados não mostrados). Desde fibroblastos têm uma vantagem de crescimento significativo, os fibroblastos vão ao longo do tempo overgrow o PASMC na placa zero. Por esta razão, a placa de zero é descartado quando existem PASMC claramente isolada nas placas subsequentes. Depois de pooling, a populaçãoPASMC é de&gt; 90% PASMC que coloração positiva para ambos α-miosina do músculo liso e desmina (Figura 2). Quando fotografada em 20X, várias células fusiformes são vistos consistente com um fenótipo de células de músculo liso (Figura 2A). Quando fotografada em maior ampliação (40x), a lamellopodia do bordo de ataque de células individuais são visualizadas como elas crescem e migram para outras células do músculo liso no prato (Figura 2B). A fosfodiesterase 5 (PDE5) é expressa em PASMC e hidrolisa cGMP, um mediador chave de tónus vascular, em GMP inactivo. Diminuição da PDE5 desempenha um papel crítico na transição vascular pulmonar normal após o nascimento. Em modelos animais de grande porte, PDE5 é developmentally regulamentada em toda a gestação, e sua expressão e atividade cair drasticamente após o nascimento 27. De modo a confirmar que estas PASMC isolado manter um fenótipo compatível com a sua fase de desenvolvimento, examinámos PDE5 enzactividade yme em rato isolado a partir PASMC P7, P14, e P21 ratinhos, assim como ratinhos adultos. Nós vemos os mais altos níveis de atividade PDE5 no PASMC isolada de ratos P7. Estes níveis de cair no PASMC isolado de P14 e P21 ratinhos. Os níveis mais baixos de actividade de PDE5 são observadas no PASMC isoladas a partir de ratinhos adultos (Figura 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50889/50889fig1.jpg" /> Figura 1. PASMC Neonatal visualizado por microscopia de luz. PASMC são visualizadas através de um microscópio de luz em 20X. A) No terceiro dia do protocolo, PASMC fusiforme pode ser visto migração do preto cheio de ferro pequeno PA para o prato de cultura de tecidos. B) No décimo quarto dia após a agregação, uma população de PASMC pode ser visto no prato de cultura de tecidos. <img alt="Figura 2" fo:content-width = src &quot;3.5in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50889/50889fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. PASMC Neonatal coraram positivamente para os marcadores de músculo liso. PASMC foram plaqueadas em lamelas de vidro tratadas com colagénio, fixadas em formaldeído a 4%, e permeabilizadas com 0,2% de Triton-X, como previamente descrito 7,23. D) PASMC de P7, P14, e P21 camundongos foram marcadas com anti-desmina (1:200 de diluição) ou anti-miosina de músculo liso (diluição 1:2000) em BSA a 5%, seguido de rodamina-vermelho anti-coelho secundário, a uma diluição 1:200. A fluorescência foi visualizada com um microscópio de epifluorescência a 20X. B) PASMC de P14, P21 e os ratinhos foram coradas com anti-miosina de músculo liso ou desmina como acima, e a fluorescência foi visualizada como descrito acima em 40X. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50889/50889fig3.jpg" /> Figura 3. Fosfodiesterase 5 (PDE5) A atividade éRegulado em termos de desenvolvimento PASMC. PASMC foram colhidas para a proteína total e analisadas para a actividade enzimática da PDE5 como anteriormente descrito utilizando um cíclico colorimétrico comercialmente disponíveis kit de ensaio da fosfodiesterase de nucleótido 7. Cada uma das amostras foi lida ± sildenafil (100 nM). A diferença entre o pmol de cGMP hidrolisadas por mg de proteína total por minuto ± sildenafil representa a actividade hidrolítica de cGMP-específico PDE5. N = 4 para P7 PASMC, n = 10 para PASMC P14, n = 4 para P21 PASMC, e n = 8 para adulto PASMC. * P &lt;0,05 vs P7 PASMC, # p &lt;0,05 contra P14 PASMC.

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K visualizações.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolamento e purificação de Pericytes cardíacos murinos

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Medicina

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Isolamento da artéria intrapulmonar e das células musculares lisas para investigar as respostas vasculares

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.