이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 HL082798 및 HL111580을 부여합니다.

1. 신장 조직 섹션 <ol><li> 포르말린 - 고정 (10 %) 파라핀 신장 섹션 슬라이드 분석 전에 몇 달 동안 저장 될 수 마이크로 미터 HM (355)를 사용하여 S. 5mm 두께로 현미경 슬라이드 상으로 절단된다. </li></ol> 2. 솔루션 준비 <ol><li> 고압 증기 멸균 나사 정상 병에 DDH 2 O에 1X PBS의 1 L를 준비합니다. DDH 2 O 1 L로 다른 병 채우기 각 병, 덮개에 DEPC의 1 ML을 추가하고 격렬하게 흔들어. 솔루션 RNAses을 파괴 한 후 오토 클레이브 실온에서 밤새 앉아 보자. PBS-T 만들기 위해 400 ㎖의 트윈 20 1X PBS의 L 1에 추가합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 K 버퍼 (50 mMTris 염산, pH를 8.0 DEPC에 1 ㎜ 염화칼슘 처리 된 물)을 준비합니다. </li><li> PBS-T에서 0.2 % 글리신의 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 3. 조직 준비 <ol><li> 혼성화 완충액 대량 50 % 포름 아미드로 이루어진 (50 ~ 100 ㎖), 5X SSC, 0.1 % 트윈, 9.2 준비pH가 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 및 DEPC에 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 MM의 구연산은 DDH 2 O를 처리 C. º -80에서 1 ㎖ 분량 씩 분주하여 보관하여 </li><li> 5 분마다 신선한 크실렌의 3 배를 세척하여 조직에서 파라핀을 제거합니다. </li><li> DDH 2 O. 에탄올 농도 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %)를 감소에서 5 분 배양하여 조직 절편을 재수 </li><li> 완전 1 분 동안 조직 절편 (약 0.4 ~ 0.5 ml)에 충당하기에 충분한 DEPC로 슬라이드를 취급한다. 확인 조직은 건조하지 않습니다. </li><li> DEPC의 슬라이드는 적절한 처리에 대한 DEPC 포함 된 폐기물을 수집, 5 분 동안 두 번 PBS-T를 처리 씻어. 모든 시약은 DEPC이 시점에서 RNAses을 제거하는 치료를해야한다. </li><li> Prewarm 테 K 버퍼링 및 10 μg / ML의 최종 농도에 단백질 분해 효소의 K를 추가합니다. 단백질 분해 K 솔루션으로 조직 섹션을 덮고 5 분 동안 37 º C에서 알을 품다. </li><li> 빨리 proteinas 제거전자 K 솔루션 30 초 동안 PBS-T에서 0.2 % 글리신을 추가합니다. </li><li> DEPC에 린스 슬라이드는 30 초마다 두 번 PBS-T를 처리. </li><li> 10 분 동안 갓 4 % 파라 포름 알데히드의 부분을 수정. </li></ol> 4. 이종 교잡 <ol><li> 하이브리드 버퍼의 50 μL (50 % 포름 아미드, 배 SSC, 0.1 % 트윈, pH를 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 9.2 MM의 구연산) 조직 섹션 당을 추가하고 이는 RNAse 무료 HybriSlips 커버 조직 섹션보다 더 큰 단지 컷. </li><li> 3 &#39;제닌 표지 프로브 (탐침의 보통 DNA TM에 대해 결정 하이브리드의 온도에서 2 시간 동안 습도 제어 하이브리드 오븐에서 Prehybridize 섹션 -21 ° C ~, 미르 - 382에 대한 (즉, 54 ° C는 DNA TM = 75 ° C를 조사 ), 챔버를 유지하기 위해 50 % formamide/50 %의 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 와이프를 사용하여 가습. </li><li> miRNA의 프로브, 양성 대조군 (U6 작은 핵 RNA)과 대조군 (스크램블을 희석하이브리드 버퍼에 40 nm의 순서는 () 버퍼의 75 μL)는 섹션 당 필요합니다. </li><li> 5 분 동안 65 º C에서 혼성화 버퍼 프로브를 가열한다. </li><li> 하이브리드 오븐에서 슬라이드를 제거하고 예비 혼성화에서 커버 슬립 과잉 하이브리드 버퍼를 제거합니다. </li><li> 직접 조직에, 조직 섹션 당 프로브를 포함하는 버퍼의 75 μl를 추가합니다. 조직 섹션을 포함 할 정도로 그냥 큰 HybriSlips과 조직을 커버. </li><li> 슬라이드 홀더 수준을 유지, 4.2 단계 (약 16 시간)의 온도에서 하룻밤 배양을위한 하이브리드 오븐으로 돌아갑니다. </li></ol> 5. 엄격한 세척 <ol><li> 조직에서 커버 슬립을 해제하는 데 도움이 단지 커버 슬립 중 하나 가장자리에서 하이브리드 온도로 가열 200 μL 2X SSC를 추가합니다. 슬라이드를 기울여 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 30 분 각각의 혼성화 온도의 3 배에 50 %의 포름 아미드, 50 % 2X SSC 200 μL에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 헹구기슬라이드는 저속에서 진탕에 5 분 각각 실온에서 PBS-T에서 5 배. </li></ol> 6. 검출 <ol><li> 저속에서 진탕에 실온에서 1 시간 동안 버퍼 (2 % 염소 또는 말 혈청, 2 ㎎ / ㎖ PBS-T에 BSA를) 차단에 슬라이드를 품어. </li><li> 1:100에서 버퍼를 차단하는 안티-DIG-AP Fab 단편을 희석. 조직 섹션 당 100 μl를 추가하고 HybriSlips 커버는 부분을 커버하기에 충분한 단지 큰 잘라. </li><li> 4 ° C 하룻밤 (약 16 시간)에 가습 실에 항체를 품어. </li><li> 낮은 속도로 진탕에 5 분마다, PBS-T 7 배에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 5 분마다, 3 배 (100 ㎜ TrisHCl의 pH 9.5, 50 mM의 MgCl2를 100mm 크기의 NaCl, 0.1 % 트윈 20) AP 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> AP 버퍼에 NBT / BCIP 솔루션을 추가 (200 μl/10 ML 버퍼) </li><li> 완전히 모든 조직 섹션을 포함하는 각각의 슬라이드에 희석 NBT / BCIP 솔루션의 400 ~ 500 ML을 추가합니다. 어두운, 레벨, humidif에 개발4 ~ 5 시간 동안 폭발물 실. </li></ol> 7. 장착 슬라이드 <ol><li> 5 분마다 에탄올 농도 (25 %, 50 %, 75 %, 100 %)을 증가하는 섹션 탈수. </li><li> 섹션을 취소하기 위해 크실렌 배에 품어. </li><li> 마운트 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 설치 매체 건조 하룻밤에 슬라이드. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney.">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li><li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors.">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li><li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray,+proteomic,+and+bioinformaticanalysis.">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li><li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics:+miR-192+targets+Na+/K+-ATPase+&#946;1.">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase &#946;1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li><li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats:+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes.">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li><li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors.">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li><li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy.">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li><li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. 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G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers.">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li><li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer.">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li><li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21.">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li><li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension.">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li><li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes.">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li><li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue.">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li><li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis.">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li></ol>

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이 문서의 목적은 포르말린 고정 신장 조직에서 잘 작동 현장 하이브리드 화에 miRNA를위한 프로토콜을 설명했다. 이 프로토콜을 작업하는 동안 염색 유물의 몇 가지 중요한 소스가 확인되었습니다. 이러한 점에주의는 염색 유물을 방지하고 성공적인 ISH 실행의 가능성을 높일 수 있습니다. 가 조직 섹션 긴 배양 중에 건조 할 때 염색 유물의 가장 예방 가능한 원인 중 하나가 발생할 수 있습니다. 이 경우 건조되어 조직의 부분은 NBT / BCIP 개발 (그림 1) 동안 매우 어둡게 얼룩 것입니다. 이 프로토콜을 통하여 그 조직 절편이 완전히 모든 배양을 통해와 슬라이드가 완전히 수준 유지되는 액체에 의해 보호 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 절편은 완전히 같은 혼성화 단계만큼 배양 중에 HybriSlips 의해 덮여 및 유지되어야<html> 액체 손실을 방지하기 위해 항체 배양. 조직 절편의 부분 또는 완전 건조가 관찰되는 경우는 샘플이 miRNA의 발현은 그 샘플에서 해석되는 것을 허용하지 않을 것이다 최적 염색을 얻을 것 같지는 않다. 액체의 적용이 필수적이다 프로토콜의 다른 단계는 단백질 분해 효소 K의 소화 및 파라 포름 알데히드 처리 중에 있습니다. 이 분해는 세포 내로의 miRNA 프로브의 액세스를 허용하기 위해 필요하다. 조직의 커버리지가이 짧은 배양 중에 불완전하면 소화 효소에 노출되지 않은 영역은 입력 바인딩만큼 프로브를 허용하지 않으며, 궁극적으로 음울 같은 다른 조직의 다른 영역과 같은 얼룩 않을 것이다. 다른 조직 유형이 프로토콜을 적용하는 경우, 프로 테이나 제 K 소화의 재생 시간이 최적화 될 필요가있다. 후속 파라 포름 알데히드 고정 per​​meabilization는 다음의 miRNAs의 손실을 방지하는 것도 중요하다. NT는 &quot;&gt; NBT / BCIP 개발의 기간도 제어 할 수있는 중요한 변수이다. 우리는 4 ~ 5 시간 이상의 NBT / BCIP의 배양이 중요한 배경 이슈 스크램블 - 미르 제어 프로브 (와 프로빙 조직에서 개발을 시작 발견 NBT / BCIP 개발의 그림 2A). 4 시간 등 U6 작은 RNA 양성 대조군 (그림 2B)로 상대적으로 풍부하게 표현 검색 대상의 검출에 충분하다. 긴 배양 추가 낮은 수준의 표현을 가능하도록 표시되지 않습니다 이 단순히 증가 배경 이슈가 발생 할 수 있습니다 오히려 검출 될 수있다. 이 낮은 표현의 miRNA의 검출 성능의 중요한 문제로 연결됩니다. 우리는 신장에서 우리의 응용 프로그램에 대한 충분한 검출 감도를 저희에게 제공하는 5 &#39;제닌 결합 된 프로브를 찾았지만. 알칼리 포스파타제 근거 발색 EAC 측정되는 여러 신호 입자 허용프로브의 H 분자는 그러나 일부 낮은 수준의 miRNA는 여전히 감지되지 않을 수 있습니다. Exiqon는 마이크로 RNA 분자에 두 번 색채 개발에 대한 가능성을 허용 종료 5 &#39;와 3&#39;모두의 레이블에 명시되어 있습니다 miRNA의 프로브를 개발했다. 우리 연구실은 이러한 프로브를 테스트하지 않은 반면, 비슷한 프로토콜 신장 조직에서의 사용은 8보고 된 바있다. 이 베이직 프로토콜은 프로 테 K 소화 시간을 최적화함으로써 다른 조직 유형 및 miRNA의 프로브로 구성 될 수 있으며, miRNA의 프로브 농도, 혼성화 온도, 및 NBT / BCIP 개발 시간. 그것은 자기 형광 적절히 낮은 조직에서 형광 항체와 조합하여 프로토콜의 제 1 부분을 사용하는 것도 가능하다.

마이크로 RNA는 내생 적으로 생산되는 RNA를 비 암호화 (약 22 뉴클레오티드) 작은 수 있습니다. 그들은 일반적으로 번역 억압 또는 mRNA의 분해를 통해 단백질 발현을 억제하는 기능을한다. 완전 보완와 mRNA의 대상에있는 miRNA 바인딩, 그것이 가능한 하나의 miRNA가 여러 대상을 억제하기 위해 만드는. 세포의 종류와 구조의 miRNAs을 표현 이해 메커니즘을 이해의 중요한 부분 인을 통해 miRNA의 발현에 영향을 미치는 세포와 조직의 표현형의 변화. 이러한 miRNA의 시퀀싱, qPCR에 노던 블로 팅 등의 방법은 전체 조직에서의 miRNA의 검출에 사용 할 수 있지만,이 방법은 하나가 특정 조직 내에서 온 어떤 특정 세포 유형을 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하여 분석 전에 셀룰러 및 구조 구성 요소의 해부는 매우 어려울 수 있습니다 적절한 아이솔레이션을 달성하기 위해 필요한 조건은 알을 초래할 수 있습니다유전자 발현 또는 RNA를 저하에 terations. 원위치 혼성화에서 마이크로 RNA는 조직에서 마이크로 RNA 위치 및 발현 수준을 가시화하기 위해 사용하는 방법이다. 이 기술은 신장 등 이종 구조, 구성 조직에 특히 유용합니다. 마이크로 RNA는 신장 개발 2,3 생리학 4에서 규정하는 역할을하는 것으로 나타났다. 마이크로 RNA 발현의 변화는 또한 섬유증 5-10, 당뇨병 성 신증 7, 신장 암 11, 12, 급성 신장 손상은 13 신장 병리에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서는 신장 조직에 대한 현장 하이브리드 마이크로 RNA를 최적화하는 것이 건강과 질병 (14) 모두에 miRNA의 표현의 정확한 구조 위치를 결정하기위한 가치있는 것을 발견했다. 다른 마이크로 RNA의 관 및 세포 발현의 결정은 중요하기 때문에 타 자신의 규제rgets는 세포 기능에 의존 할 수있다. 병에 걸린 상태에서 그것은 miRNA의 발현의 변경 기능에 영향을 될 수있는 방법을 결정하는 것도 중요하다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 Kloosterman 등. 15, 16, 17, 다른 연구자에 의해 개발 된 기존 ISH 방법론에 따라 구축 할 수 있었고, 사람들은 Exiqon 1에 의해 제안 된 포르말린 고정 신장 조직하는 방법을 최적화 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 일방적 인 요관 폐색 (18)와 신장 마이크로 RNA 미르 - 382 식의 지역적인 차이를 식별하기 위해이 방법을 사용했습니다. 이러한 접근은 추가적인 최적화뿐만 아니라 다른 조직으로 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">D5758</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tween-20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P1379</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Xylenes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">534056</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Ultra Pure</td>
			<td style="width:137px;">200CSPTP</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">15506-017</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">C2536</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:137px;">4059-00</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Citric Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">C2404</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F9037</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">20x SSC Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">15557-044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Heparin</td>
			<td style="width:71px;">SAGENT</td>
			<td style="width:137px;">25021-400-30</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Yeast RNA</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">AM7118</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M8266-1004</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:137px;">4058-01</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:71px;">Fermentas</td>
			<td style="width:137px;">EO0491</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">3&#8217; DIG- miRNA probe</td>
			<td style="width:71px;">Exiqon</td>
			<td style="width:137px;">miR dependent-05</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">3&#8217; DIG- Scrambled miR probe</td>
			<td style="width:71px;">Exiqon</td>
			<td style="width:137px;">99004-05</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">3&#8217; DIG- U6 miR probe</td>
			<td style="width:71px;">Exiqon</td>
			<td style="width:137px;">99002-05</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Roche</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">11093274910</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Fragments</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">NBT/BCIP</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">11681451001</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Permount</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">SP15-500</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">Fit to tissue size</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Microtom HM 355 S</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-900-672</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">In-slide Out Hybridization Oven</td>
			<td style="width:71px;">Boekel</td>
			<td style="width:137px;">241000</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Aluminum Tray Assembly</td>
			<td style="width:71px;">Boekel</td>
			<td style="width:137px;">C2403973</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Stainless Steel Rack Insert</td>
			<td style="width:71px;">Boekel</td>
			<td style="width:137px;">C2403754</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues

이 문서에서 우리는 마이크로 RNA 프로브를 태그 제닌과 현장 하이브리드 화에를 통해 신장의 miRNA의 비색 검출하는 방법을 설명합니다. 원래 Kloosterman 및 Exiqon miRNA의 프로브 1 폭 넓은 사용을 위해 동료에 의해 ​​개발 된이 프로토콜은, 신장 조직에서의 miRNA 분석에 내재 된 문제를 극복하도록 수정되었습니다. 여기에는 구조 식별 및 잔류 조사 및 항체를 제거하기 어려운 문제가 있습니다. 비교적 얇은 사용, 두께 5mm, 강한 프로브 신호가 세포 내에 유지하면서, 신장 구조의 명확한 시각화를 허용 조직 섹션. 또한, 프로브 농도와 배양 조건은 낮은 배경 및 비특이적 신호 마이크로 RNA 발현의 시각화를 용이하게하기 위해 최적화되었다. 여기서, 최적화 프로토콜은 프로 시저의 끝에서 슬라이드 실장 통해 초기 티슈 콜렉션 및 준비를 덮고, 설명한다. 기본 compone이 프로토콜의 국세청은 다른 조직과 세포 배양 모델 응용 프로그램에 대해 변경 될 수 있습니다.

혼성화, 배양 중에 건조 또는 NBT / BCIP를 개발하는 동안 더 어둡게 염색 결국 전체적으로 같이 세척 될 조직 절편의 영역. 1 HybriSlip가 가장자리 떨어져 미끄러 된 신장 부분의 일부를 보여준다 그것은 부분적으로 탈수가 될 수 있도록 조직. 나머지 단계에서 재수 커버리지에도 불구하고, 탈수 부에서의 신호는 인위적으로 높다. NBT-BCIP 개발 시간을 제어의 중요성은도 2a 및도 2b에 설명되어있다. 신장 (그림 2A)를 통해 스크램블 - 미르 제어 탐색 할 조직의 발음 비특이적 발색에 4 ~ 5 시간의 결과보다 긴 개발 기간. 예 U6 작은 핵 RNA 제어와 같은 높은 풍부 대상, 조사해서 신장, (4-5 시간 이상 더 이상 배양 개선 신호가 발생하지 않는도<html> 우레 2B). 신장 조직에서 miRNA의 검출로 여기에 설명 된 ISH 방법의 적용은 그림 3에서 보여줍니다, 그림 등 KRIEGEL에서 재생된다.이 연구에서는 18 우리는 일방적 인 요관 폐색 (UUO가) qPCR에있는 거의 3 배 증가를 유도 발견 가짜 운영하는 동물에 비해 균질 신장 조직에서 미르 - 382 식을 발견했습니다. 이러한 증가는 항 - 미르 - 382 (데이터 미도시)의 정맥 내 전달에 의해 차단되었다. 이러한 신장 조직에 ISH의 사용은이 프로브에 의해 제공 미르 - 382 검출 qPCR에 근거 발현 분석 미러 정량화의 결과를 제공 할 정도로 민감한 것으로 나타났다. 또한, ISH은 우리가 신장 내에서의 miRNA 발현의 지역적인 차이를 측정 할 수 있었다. 600PX &quot;/&gt; 그림 1. 하이브리드 단계에서 쥐의 신장 부분의 부분적인 탈수의 효과. = 100mm 교정 바. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50785/50785fig2.jpg" width="600px" /> 더 이상의 개선을 제공하지 않습니다 동안 NBT / BCIP 개발 기간의 그림 2. 최적화. NBT / BCIP 개발 스크램블 - 미르의 중요한 배경 염색 이상 4 ~ 5 시간의 결과를 계속할 수는 조직 (그림 2A)를 탐색 할 긍정적 인 컨트롤의 신호는 U6 작은 핵 RNA 탐색 할 샘플 (그림 2B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig2highres.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오</a>큰 이미지. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50785/50785fig3.jpg" width="600px" /> 그림 3. 현장 하이브리드 화에 의해 얻어진 마우스 신장 섹션 미르 - 382 표현의 대표 이미지. 교정 바 = 50 μm의. (B) 가짜 + 안티 스크램블 처리 된 생쥐의 %의 평균 IOD로 미르 - 382 식입니다. 이 그림은 KRIEGEL 등 알에서 수정되었습니다., 치료 그룹, 방법의 세부 사항을 설명하고, 18 일 결과 (그림 5). 처리 방지 스크램블 N = 10/group, 안티 - 미르-382 N = 8/group, 같은 수술 (P &lt;0.05)와 안티 스크램블 처리 된 마우스에서 * 유의 한 차이, 사기 조작 동물에서 # 유의 한 차이 같은 안티를 수신 - 미르 치료. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig3highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>더 큰 이미지를 볼 수 있습니다.

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MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

14.9K 조회수.  Medical College of Wisconsin.  이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다. 

비디오: MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.