1. Chemical Mutagênese Nota: Nós achamos que a forma RB replicativo é mais passível de mutagênese química do que a forma EB. No ciclo médio (entre 18 a 20 hpi), RBs estão em maior números anteriores a RB-EB transição. Porque Chlamydia trachomatis é um agente patogénico intracelular obrigatório, os efeitos do agente mutagénico na saúde do hospedeiro pode limitar a recuperação bacteriana. As células Vero foram encontrados para ser mais resistente aos efeitos adversos de níveis elevados de SEM do que outras linhas de células testadas. Segregação de mutações por recombinação exige seleção para antibiótico progênie recombinante resistente. Recomendamos a utilização de cepas resistentes aos medicamentos (por exemplo, rifampicina, spectinomicina, ou trimetoprim) para a geração de mutantes para a capacidade de realizar análises recombinante e isolar linhagens isogênicas. Estirpes resistentes aos antibióticos foram produzidos por um processo passo a passo de selecção (15, 16). Nãoe: Chlamydia trachomatis (estirpe L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) é BSL2 patógeno. Consulte os procedimentos operacionais padrão institucionais (SOP) para lidar com esses patógenos. <ol><li> Preparação de células de cultura e infecção: <ol><li> Semente de aproximadamente 1 x 10 6 células Vero (ATCC CCL-81) por cada 25 cm 2 (T25), balão em 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. As células devem formar uma monocamada confluente dentro de 24 h. </li><li> Aspirar médio. Infect frascos T25 confluentes de células Vero com Chlamydia a uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 (~ 14 x 10 6) num volume total de 3 ml de meio (DMEM, 200 ng / ml ciclohexamida, 10% de FBS). </li></ol></li><li> Comece a mutagênese em 18 horas pós-infecção (hpi): <ol><li> Prepare a 20 mg / mL de EMS (etil metano-sulfonato) em tampão fosfato salino (PBS) com 0,9 mM de cálcioe cloreto de magnésio 0,49 mM em uma capa de segurança química como EMS é um líquido volátil. Nota: EMS é um potente agente mutagênico e carcinogênico. Neutralizar desperdiçar EMS e descontaminar derramamentos, plástico, papel e vidro com 1 M de hidróxido de sódio. </li><li> Aspirar o meio e lava-se as células uma vez com 3 ml de PBS / MgCl2 / CaCl2. Incubar as células com 3 ml de 20 mg / ml em PBS SGA / MgCl2 / CaCl2, durante uma hora, no exaustor de fumos, à temperatura ambiente. Células Vero são capazes de sobreviver a esta concentração de EMS e condições fora da incubadora por curtos períodos. Lembre-se de incluir uma amostra de controlo que não tenha sido mutado. </li><li> Remova o meio contendo EMS e colocá-lo em um recipiente de NaOH 1 M para inativar o agente mutagênico. Lave as células infectadas três vezes em 3 ml de PBS + MgCl2 / CaCl2 para remover mutagénica residual. Adicionar 6 ml de DMEM/10% de FBS, com 200 ng ml ciclohexamida / e 25 ug / ml de gentamicina, e incubar em 5% de CO <sub&gt; 2, 37 ° C durante 48-72 h. Inclusões aparece desprovido de bactérias de cerca de 36 h depois da mutagénese. Em 72 h, cerca de 10% de inclusões são preenchidos com bactérias, enquanto o restante permanece vazio. </li><li> Extraia EBs por lise hipotônica: Completamente aspirar médio. Adicionar 1,0 ml de H2O e rocha para desalojar as células durante 10 min. Lisar as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 10 vezes. Recolhe lisado numa microcentrífuga e adicionar 0,250 ml de tampão de fosfato de sacarose 5x glutamato (SPG) para trazer a concentração final de 1x. Armazenar a -80 ° C. Observação: O nível de mutagénese pode ser avaliada através da indução de resistência à rifampicina. Para ensaiar a frequência da resistência à rifampicina, a placa 1 10 x 8 x 10 e 7 diluições em série de bactérias na presença de 200 ng / ml de rifampicina. A frequência da resistência à rifampicina é definido como o número de placas resistentes a rifampicina, divididos pelo número total de bactérias metalizados. Consulte a seção abaixo para obter instruções de placa. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento clonal de Chlamydia trachomatis cepas mutantes de purificação Plaque <ol><li> Conjunto monocamadas confluentes de células Vero em placas de 6 poços: Semente 0,4 x 10 ~ 6 células em 3 ml de DMEM/10% de FBS por poço. Permitir que as células formam uma monocamada homogénea ao longo do próximo 24 h. </li><li> Descongele solução estoque de Chlamydia mutado no gelo. Realizar 6 x 10 diluições em série em um volume total de 200 ul por diluição em DMEM/10% de FBS e libertá-los em gelo. Nota: A título de bactérias em unidades formadoras de inclusão (IFU) é uma boa estimativa de unidades formadoras de placas (pfu). Destinam-se a placa de 10, 100 e 1000 pfu. </li><li> Lave as células duas vezes com Vero 3 ml de PBS por poço. </li><li> Adiciona-se 3 ml de DMEM a cada poço para placas de 6 poços e 100 ul das diluições bacterianas em duplicado. Redemoinho da placa para garantir uma mistura. </li><li> Rodar as placas infectadas em 2.700 xg durante 30 min a 15 ° C, em seguida, incuba-se a 37 ° C num humidificada,5% incubadora de CO 2 durante 1-2 horas. </li><li> Prepare a 0,54% de agarose em DMEM (de 6 poços): <ol><li> Adicionar os seguintes ingredientes: 18,9 mL 2x DMEM frio, 4,2 ml de FBS, NEAA 100x 0,42 ml, 0,042 ml a 200 ug / ml ciclohexamida, 0,021 ml de 50mg/ml de gentamicina. Misturar bem. </li><li> Misturar em 18,9 ml de água quente estéril agarose a 1,2% / H 2 O, a agitação para evitar grumos. Mistura deve ser quente ao toque. Tenha em um banho de água quente a 55 ° C antes de adicionar às células infectadas. </li></ol></li><li> Aspirar suspensão bacteriana de pratos e aplicar 6 ml de 0,54% de agarose / DMEM por poço. Permitir agarose para solidificar completamente à temperatura ambiente, fora do capuz durante 15 min. Secam-se as placas com as tampas removidas, na capa de biossegurança durante 15 min. NOTA: A vibração da capa de contenção biológica pode distorcer a agarose solidifica. </li><li> Incubar a 37 ° C na incubadora de CO 2 durante 7-10 dias. As placas devem estar disponíveis com o auxílio de um microscópio de dissecação. (Refer à Figura 3, para uma imagem típica de placas.) </li><li> Um dia antes do isolamento de mutantes, de sementes de 1 x 4 10 células Vero em 100 ul por poço de uma placa de 96 poços. As células serão confluente dentro de 24 h. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, placas de marca para ser escolhido. Colete fichas de placas usando um 1,0 ml barreira ponteira estéril. </li><li> Ressuspender as placas em 100 ul de DMEM suplementado com FBS a 10%, 400 ng / ml ciclohexamida, 50 ug / ml de gentamicina. </li><li> Para expandir cepas mutantes, sobrepor a suspensão em monocamadas confluentes de células Vero. Rodar as placas a 2700 x g, 15 ° C durante 30 min. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2, num incubador humidificado. Colheita EBs quando&gt; 50% das células estão infectadas, o que pode ocorrer tão cedo quanto 48 hpi e tão tarde como 14 dias. Esta quantidade de células infectadas permite que as bactérias viáveis ​​suficiente para ser armazenado. Cepas mutantes diferem em taxas de crescimento e infectividade. Permitir retardar estirpes de crescimento para a Naturally re-infectar células vizinhas até células suficientes estão infectados. </li><li> Extrair EB por lise hipotónica das células infectadas: <ol><li> Completamente aspirar médio. </li><li> Adicione 160 ml de água estéril. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Perturbar as células por pipetagem cima e para baixo várias vezes para garantir a lise completa, use dicas de barreira para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Transferir 160 uL de lisados ​​para os tubos de microcentrífuga. </li><li> Misturar em 40 mL de SPG 5x. Armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Ensaio e tela de mutantes para o fenótipo (s) de interesse. </li></ol> 3. Seqüenciamento do genoma inteiro de Mutantes Chlamydia selecionados <ol><li> Extrair DNA genômico de gradiente-purificada EBS, que são em grande parte livre de contaminação DNA do hospedeiro. Protocolos para a cultura em larga escala e purificação de Chlamydia da EBS pode ser encontrado na ref. (17). Use kits de purificação de DNA genômico comerciais (por exemplo, cat Qiagen 69504.) Para extRACT DNA a partir de 2 x 10 9 bactérias seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Use um fluorímetro (Qubit, Invitrogen gato. Q32866) para medir com precisão a quantidade de DNA. 1-5 ug de ADN purificado é necessária para a plataforma de sequenciação Ilumina. Nota: várias plataformas podem ser utilizadas sequências de genomas bacterianos, incluindo os sistemas Illumina/Solexa- e baseada sólida. Optamos por usar HiSeq (Illumina), uma vez que produz alta densidade de curto, mas de seqüenciamento de alta qualidade lê. Seqüenciadores menores do genoma escala, como IonTorrent (Life Technologies) e MySeq (Illumina) são adequados e também mais do que suficiente para multiplexação estes Quencing de até quatro genomas Chlamydia por vez, o que excede a cobertura mínima de 25X para a montagem do genoma adequada. Preparação de bibliotecas de sequenciação de ADN para a plataforma Ilumina são descritos abaixo. </li><li> Fragmento de DNA de tamanho apropriado (300-400 pares de base para Illumina seqüenciamento), utilizando uma Adaptive Acoustics Focada em S220trumento (Covaris) de acordo com as configurações sugeridas pelo fabricante. Nota: fragmentação do DNA por nebulização resultados em maior perda de amostra, devido à dispersão em aerossol da amostra. </li><li> Prepare as bibliotecas de sequenciamento genômico utilizando kits de construção comercial (Illumina FC-102-1001), seguindo as instruções do fabricante. Bibliotecas podem ser indexados usando primers com código de barras (Illumina FC-121-1003) de tal forma que várias amostras podem ser reunidos e seqüenciados simultaneamente. </li><li> Executar o seqüenciamento de amostras. Esta etapa é geralmente realizada por serviços comerciais ou instalações nucleares operadas por pessoal técnico dedicado. Siga os procedimentos e recomendações. </li><li> Ilumina lê (FASTQ formato) pode ser montado a um genoma de referência utilizando o software de interface gráfico de utilizador amigável, como Geneious (Biomatters), que pode também ser utilizado para o SNP / identificação da mutação. Para mutações mapa, definir parâmetros para 90% a frequência mínima para a variante e 50X para a cobertura mínima. Abrir fonelectrónicos genoma montadores, tais como MAQ (18) e BWA (19), também podem ser usados. </li><li> Confirmar mutações pela sequenciação de Sanger: usar o DNA genómico como modelo para a amplificação por PCR de 300-500 pb regiões flanqueadoras mutações identificadas e sequências purificadas ou diluído (01:20) Os produtos da PCR por sequenciação de Sanger. </li></ol> 4. Geração de Chlamydia recombinantes Nota: Chlamydia podem trocar DNA durante a infecção, o que permite a geração de estirpes recombinantes (12, 13, 20). Após a co-infecção de células com duas estirpes resistentes aos antibióticos únicos, recombinante &quot;progénie&quot; podem ser seleccionadas pela resistência aos antibióticos dupla (12, 13). Aproveitamos esse fenômeno para segregar mutações e gerar tensões co-isogênicos. Assim, as estirpes mutantes foram gerados no fundo resistentes a antibióticos (por exemplo, a resistência à rifampicina (RIF R) H471Y em CTL0567 (rpoB)) de tal modo que elas possam ser cruzadas com o tipo selvagem estirpe bearinga alelo resistente ao antibiótico diferente (por exemplo, resistência a espectinomicina (Spc R), G1197A na r01/r02 (16SRNA copia 1 e 2)). Para obter detalhes sobre troca de DNA e recombinação de Chlamydia, consulte as referências (12, 13). <ol><li> Co-infectam tipo selvagem e estirpes mutantes clonais por centrifuging6 5 x 10 bactérias a partir de cada estirpe em monocamadas confluentes de células Vero cultivadas em placas de 24 poços. Em paralelo, infectar monocamadas com cada cepa sozinho. </li><li> Aos 44 hpi, colheita EBs por lise hipotônica das células infectadas: <ol><li> Completamente aspirar médio. </li><li> Adicionar 0,4 ml de água estéril e deixe descansar por 10 min. </li><li> Lisar as células por pipetagem vigorosa cima e para baixo por pelo menos 10 vezes. Transferir os lisados ​​para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Misturar em 0,1 mL de SPG 5x para uma concentração final de 1 x SPG. </li><li> Os lisados ​​brutos podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a -80 ° C. </li></ol></li><li> Plaque 50 mL da EB bruto prepara umd 5 x 01:10 diluições em agarose / DMEM suplementado com os antibióticos apropriados para selecionar para recombinantes. (Consulte a tabela para as concentrações de antibióticos típicos para a seleção de recombinantes). </li><li> Chapa purificar e enriquecer estirpes recombinantes como acima. Pontuação recombinantes para a presença ou ausência do fenótipo desejado. Extrair ADN a partir de estirpes recombinantes por tratamento DNAzol (secção seguinte) com a finalidade de genotipagem para a presença ou ausência de mutações. </li><li> Cruzes pode ser repetido com outras estirpes que carregam os marcadores de resistência a antibióticos para segregar mais mutações, e gerar estirpes isogénicas. Co-infectar recombinantes selecionados para outra cepa do tipo selvagem tendo um marcador antibiótico diferente. </li></ol> Tabela 1: As concentrações de antibióticos para a selecção de recombinantes: <table border="1"><tbody><tr><th> Concentração final </th><th> Instruções de preparação </th></tr><tr><td> 200 ng / ml de rifampicina </td&gt; <td> Adicione 25 mg / ml de caldo de armazenamento em dimetil sulfóxido (DMSO). Adicione-se 200 ug / ml de solução de trabalho por diluição do estoque de armazenamento com H 2 O. Armazenar a -20 ° C no escuro. </td></tr><tr><td> 200 ug / ml de trimetoprim </td><td> Faça um mg / ml estoque 100 em DMSO. Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 ug / ml de espectinomicina </td><td> Faça um mg / ml estoque 100 na água em 100 mL alíquotas. Armazenar a -20 ° C. Evite repetir degelo congelamento. </td></tr></tbody></table> 5. A extração de DNA genômico de linhagens recombinantes para genotipagem Nota: kits de purificação baseados em coluna também pode ser usado. Uma vantagem de extração de DNA por meio de tratamento DNAzol é o custo. <ol><li> Infect 1,2 x 10 5 clamídias para monocamadas de células Vero cultivadas em placas de 12 poços. </li><li> Na 36-48 hpi, aspirar médio e adicione 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agitar suavemente as células e pipeta o lysates para um microtubo de 1,5 ml. </li><li> O precipitado de DNA pela adição de 0,188 ml de etanol a 100%. Misture por inversão. </li><li> Extrair DNA de spool com uma ponta de pipeta e colocá-lo em um tubo limpo. Alternativamente, o sedimento de DNA por centrifugação à velocidade máxima durante 2 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C, e decantar o sobrenadante. </li><li> Lavar ADN precipitar duas vezes com 1,0 ml de etanol a 75%. </li><li> ADN Ar seco após a remoção do etanol por 15 sec. </li><li> Solubiliza-se o ADN com NaOH 0,2 mM de 8 ml, em seguida, neutraliza-se até pH 8,0 com 20,2 mL de 0,1 M de HEPES. Levar até um volume final de 0,5 ml com água ou TE. Alternativamente, o DNA ressuspender em tampão TE (sedimento de DNA não completamente solubilizado.). </li><li> Use DNAzol ADN extraído como molde para amplificação por PCR de 300-500 pb regiões flanqueadoras das mutações identificadas. Seqüência purificada ou diluído (1:20) Os produtos de PCR por seqüenciamento Sanger. </li></ol>

<ol>
	<li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women.">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).</li><li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry.">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Chlamydia+trachomatis+entry+into+nonphagocytic+cells.">Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells.</a> Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).</li><li>Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+intractable+-+approaching+the+genetics+of+Chlamydiales.">Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales.</a> Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).</li><li>Stephens, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+an+obligate+intracellular+pathogen+of+humans,+Chlamydia+trachomatis.">Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis.</a> Science. 282 (5389), 754-759 (1998).</li><li>Thomson, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+genome+sequence+analysis+of+lymphogranuloma+venereum+isolates.">Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates.</a> Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).</li><li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+diverse+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+phylogenetic+relationships+masked+by+current+clinical+typing.">Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing.</a> Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).</li><li>Somboonna, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypervirulent+Chlamydia+trachomatis+clinical+strain+is+a+recombinant+between+lymphogranuloma+venereum+(L(2))+and+D+lineages.">Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages.</a> MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).</li><li>Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydia+psittaci+genome,+a+comparative+analysis+of+intracellular+pathogens.">The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens.</a> PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).</li><li>Jeffrey, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+recent+clinical+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+loci+associated+with+tissue+tropism+and+regions+of+apparent+recombination.">Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination.</a> Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).</li><li>Gomes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots.">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li><li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro,+mechanism+and+significance.">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li><li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li><li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure.">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li><li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis.">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li><li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis.">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).</li><li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores.">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+tetracycline+resistance+among+Chlamydia+spp.+in+vitro.">Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).</li><li>Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

Não há nada para divulgar.

Esta metodologia atende aos requisitos básicos para a análise genética, uma vez que estabelece ligação entre os genótipos e fenótipos. Importante, isto é conseguido sem o auxílio de ferramentas moleculares convencionais de DNA recombinante para a transformação e inactivação por inserção de genes em bactérias, o que é muitas vezes um passo limitante da velocidade para a análise da função dos genes em microrganismos não-modelo. Um passo importante é a assegurar a clonalidade de mutantes de placas purificadas. Contaminação cruzada com o tipo selvagem ou mutantes &quot;montador&quot; pode levar rapidamente a cepas mutantes sendo suplantado. Similarmente, as mutações de mapeamento por sequenciação do genoma inteiro de amostras não clonais podem levar a resultados ambíguos. Isolar mutantes de poços fortemente plaqued ou conectar placas que estão muito próximos uns dos outros devem ser evitados. Além disso, para os mutantes de crescimento lento, pode emergir revertentes em frequências relativamente elevadas. Recomendamos preservar estoques de passagem originais ou baixa. Replmutantes Aque se a contaminação cruzada ou revertentes são suspeitos. A concentração de EMS pode ser reduzido para diminuir a frequência de mutações. A taxa de mutação, como avaliado através da geração de variantes resistentes à rifampicina (devido a mutações pontuais no gene que codifica ARN-polimerase, rpoB) foi óptima nas nossas mãos, a 20 mg / mL de EMS. A indução de resistência à rifampicina pode ser avaliado pela frequência de placas formadas na presença de rifampicina e deve correlacionar com a frequência de mutações induzidas quimicamente. EMS pode ser substituído por outros agentes mutagénicos para alargar o espectro de mutações que podem ser obtidos. Por exemplo, os agentes intercalantes de ADN, como de psoraleno e os seus derivados podem ser utilizados para induzir deleções e inserções (21). As mutações que mapeiam perto um do outro no genoma (&lt;100 kb de intervalo) são difíceis de desligar através da recombinação. Quando altas taxas de mutagênese são alcaned, pode ser difícil de identificar inequivocamente a mutação causal. No entanto, uma vez que a transformação de C. trachomatis é agora possível com os plasmídeos de transferência (22), embora de forma ineficiente, pode ser possível tratar estes problemas de ligação, complementando as mutações em trans, com uma cópia de tipo selvagem do gene mutado em um plasmídeo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50636/50636fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Estratégia para a análise genética para a frente e de mapeamento baseado na recombinação Chlamydia. Rifampin resistente (Rif R) C. trachomatis foi mutagenizado durante a sua fase de replicação e utilizado para infectar monocamadas de células Vero até as placas visíveis formadas. Os clones individuais de mutantes foram recolhidas e ensaiadas para fenótipos específicos, tais como placas morfotipos alterados. Os genomas de mutantes que compartilham um fenótipo comum foram seqüenciados para identify lesões genéticas comuns. Para estabelecer a ligação entre essas lesões genéticas e morfologias de placas específicas, as células Vero foram co-infectados com mutantes gerados no Arif R fundo e cepas do tipo selvagem Spc R clamídia e linhagens recombinantes Rif R Spc R entre a progênie infeccioso resultante foram selecionados no presença de rifampicina e spectinomicina (&quot;cruzes&quot;). A segregação das mutações individuais presentes no Rif R estirpe mutante parental, entre as bactérias recombinantes são visualizadas alterada a morfologia da placa foi determinada por sequenciação de ADN alvo. (Reproduzido com permissão da PNAS (14)) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50636/50636fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50636/50636fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Representação esquemática das células mutagénese EMS protocolo. Chlamydia trachomatis LGV-L2-infectadas foram expostas a EMS, durante a fase de RB do ciclo infeccioso, e a infecção foi deixada prosseguir durante 72 horas para permitir a geração de organismos infecciosos elementares (EB) . Piscinas EB mutagenizados foram colhidas e tituladas para inclusão unidades formadoras (IFU) e unidades formadoras de placas em células Vero. N, núcleo. (Reproduzido com permissão da PNAS (14)) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50636/50636fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50636/50636fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Exemplos de morfologias de placas comuns entre EMS-mutado C. trachomatis. Mutado C. trachomatis LGV-L2 permitido para formar placas em monocamadas de células Veros para 14 dias. As placas variavam de tamanho (A) e na morfologia (B), que pode ser isolado, amplificado em células Vero, e utilizado em reinfecções de monocamadas Vero para confirmar a estabilidade das placas morfotipos. Exemplos de fenótipos comuns são mostrados incluindo favo de mel (CMH), agregada (CLMP), pequena placa (SPQ) e granular (GRN). As setas indicam grandes depósitos granulares dentro de uma placa GRN. (Reproduzido com permissão da PNAS (14)) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50636/50636fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50636/50636fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Identificação de genes de lesões induzidas por EMS. Localização cromossômica de variantes de nucleotídeos em mutantes que exibem o morfotipo placa GRN. Todo o seqüenciamento do genoma de três mutantes Grn identificados mutaçãoes que levam a alterações de aminoácidos nas glgB, que codifica para uma enzima de ramificação de glicogénio. (Reproduzido com permissão da PNAS (14)) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50636/50636fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Os obrigatórios bactéria intracelular Chlamydia trachomatis contas para um número estimado de 2,8 milhões de infecções do trato genital por ano nos Estados Unidos (Center for Disease Control) com seqüelas associadas, como a doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e infertilidade (1). Chlamydia spp têm uma única fisiologia, com um ciclo de desenvolvimento bifásico consistindo de duas formas: o corpo elementar infecciosa, mas não replicante (EB), e o corpo reticulado mas não infecciosa replicativo (RB). A infecção inicia-se com a ligação de células epiteliais EBS para endoctyotosis seguidos por (2). Dentro de um vacúolo ligada à membrana denominada a inclusão, EBS diferenciar na forma RB, que, em seguida, replica por fissão binária. No meio do ciclo, as transições para trás para o RBS EBS, os quais são, em seguida, expelido para o espaço extracelular para iniciar novos ciclos de infecção, quando as células hospedeiras de lise (3). C. trachomatis érefractário à manipulação de rotina com técnicas de genética molecular padrão, tais como a substituição do gene alvo, transposons, e transdução de fagos, que têm sido fundamentais para a maioria dos estudos de genética bacteriana, não é claro até que ponto os genes de Chlamydia individuais contribuem para a evasão da imunidade inata , aquisição de nutrientes, transições de desenvolvimento, ou de outros processos importantes para a sobrevivência do patógeno dentro de um hospedeiro eucarióticas (4). Consequentemente, este patógeno permanece mal caracterizado, apesar da sua importância clínica. Os genomas de Chlamydia spp. são relativamente pequenas (~ 1 Mb) (5) com várias espécies e biovares seqüenciados utilizando tecnologias de seqüenciamento Próxima Geração. Análise do genoma comparativo por WGS tem proporcionado uma visão única sobre a evolução das espécies por clamídia e sua adaptação para os seres humanos (6-8) e em certa medida já forneceu algumas informações sobre a função potencial de fatores de virulência (9, 10). Tele diversidade genética exibida pelos isolados clínicos não fornece a necessária resolução para mapear sistematicamente a função da maioria dos factores de virulência, presumivelmente porque as mutações nesses genes teria sido prontamente seleccionado contra. Sem efeitos de confusão de seleção natural, a variação do gene mutagênico induzido, juntamente com os ensaios definidos que os defeitos medida em virulência, pode expandir o espectro de mutações que podem ser pesquisados. Mutagénicos químicos, em particular, são úteis como eles podem gerar nulo, condicional hypomorphic (função reduzida), e hipermórficos (ganho de função) alelos. Com a chegada das tecnologias de seqüenciamento de genoma robustas de próxima geração, essas mutações podem ser facilmente identificados e mapeados. Deste modo, as associações fortes podem ser feitas entre as mutações no gene ou uma via genética e um fenótipo comum, permitindo a aplicação de abordagens para a frente genéticos. As seqüências do genoma de estirpes clínicas revelou mosaicismo bsorovares ntre e locos de recombinação freqüente (11). A evidência empírica de recombinação foi demonstrada através da co-infecção de duas linhagens resistentes aos antibióticos diferentes e seleção de dupla progênie recombinante resistente, que foi revelado para ter contribuições genéticas de duas amostras (12, 13). Assim, a transferência genética entre o tipo selvagem e estirpes mutantes em um ambiente de co-infecção permite a segregação de mutações quimicamente induzidas para identificar o gene afectado que conduz ao fenótipo observado. Aqui, nós descrevemos um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química, WGS, e um sistema para a troca de ADN no interior das células infectadas (14) (Figura 1).

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, o agente etiológico das doenças sexualmente transmissíveis e infecções oculares, permanece mal caracterizado pela sua intratabilidade a transformação experimental com DNA recombinante. Desenvolvemos uma abordagem para realizar a análise genética em C. trachomatis, apesar da falta de técnicas de genética molecular. O método envolve: i) a mutagénese química para gerar rapidamente extensas bibliotecas de mutantes geneticamente definidos, com fenótipos distintos, ii) de toda a sequenciação do genoma (WGS) mapear as lesões genéticas subjacentes e para encontrar as associações entre o gene mutado (s) e.. um fenótipo comum,. iii) geração de estirpes recombinantes por co-infecção de células de mamíferos com bactérias de tipo selvagem e mutante. Assim, fomos capazes de estabelecer relações causais entre os genótipos e fenótipos. O acoplamento de variação do gene quimicamente induzida e WGS para estabelecer associações correlativos genótipo-fenótipo Should ser largamente aplicável à grande lista de interesse médico e ambientalmente microorganismos importantes actualmente insolúveis para a análise genética.

A exposição a agentes mutagénicos leva a inclusões que aparecem desprovido de bactérias, presumivelmente devido a morte da célula bacteriana. Normalmente, sorotipo LGV-L2 vai lisar completamente as células infectadas dentro de 48 h após a infecção, mas o tratamento com agentes mutagênicos podem estender o ciclo de&gt; 90 h. Cerca de 10% de inclusões devem recuperar. Nas nossas experiências, as células Vero infectadas tratadas com 20 mg / mL de EMS levou a um decréscimo de 99% na recuperação de progenitura infecciosa em comparação com controlos não tratados. Tratamento mutagênico também levou ao surgimento de placas com morfologia alterada, incluindo pequenas placas (SPQ) (Figura 3). Outros morfologias incluem placas que aparecem granular, agrupado, ou em forma de favo de mel (Figura 3). Estes fenótipos pode reflectir defeitos em processos necessários para a infecção e a sobrevivência no ambiente hospedeiro. Mutantes com pequena placa (SPQ) morfologia geralmente produzem significativamente menos progênie infecciosa e pode levar até 2-3 semanas para amplify. Devem ser tomadas precauções quando passaging essas cepas como reversões e mutações supressoras podem acumular-se em uma freqüência alta. As doses de EMS utilizados nestes estudos pode levar a entre 3 e 30 mutações por Chlamydia genoma, avaliadas experimentalmente por WGS (Figura 4). Embora gradiente CEs purificados são em grande parte livre de material da célula hospedeira, ADN do hospedeiro e é também detectada consiste de cerca de 10-15% das preparações genómicas. Co-infecção de duas linhagens podem gerar descendentes com as contribuições genéticas de duas amostras e ocorre em freqüências de 10 -4 a 10 -3, cerca de 10 4 vezes mais do que a resistência espontânea (13). Recombinação break points normalmente ocorrem entre ~ 100 kb para 800 kb (12). Uma análise de tais estirpes recombinantes podem revelar as mutações que são geneticamente ligadas ao fenótipo em estudo.

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K visualizações.  Duke University Medical Center.  Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular. 

Vídeo: Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Imunologia e Infecção

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...