Nosso trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas. Gostaríamos de agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para gentilmente nos fornecer com o plasmídeo para a expressão da CFP-LC3.

1. Preparação celular <ol><li> Semente de baixo número de passagem das células HEK-293T que expressam estavelmente GFP DFCP1 em 22 lamelas redondas mm; células de cultura durante a noite em Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), a uma confluência de 30-40% (o objectivo de confluência de 80% após 2 dias - dias de imagens de células vivas). </li></ol> 2. Transfecção celular <ol><li> Prepare a mistura complexa de transfecção para cada prato, contendo 100 mL OptiMEM eu reduzi meio de soro, 3 mL X-9 tremeGENE reagente de transfecção de DNA, e 0,5 mg de pECFP-LC3 DNA plasmídeo. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo e incubar 15 minutos à temperatura ambiente. [Nota: temos encontrado repetidamente que outros reagentes de transfecção, como Lipofectamine 2000, tem um monte de toxicidade, e, além disso, eles produzem partículas fluorescentes por conta própria que interferem com muitas técnicas de microscopia.] </li><li> Aspirar o meio das placas e adicionam DMEM fresco pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicione o transfection complexo para células por pipetagem, células incubar durante 24 horas. </li></ol> 3. A incubação de células com o marcador Organelle (Opcional) <ol><li> Adicionar Mitotracker / Lyso Tracker para DMEM a uma concentração final de 75 nM, e manter em gelo, em um tubo Falcon coberto com folha de alumínio, ao longo de todo o dia experimental, para evitar a exposição à luz e os ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento. </li><li> Remove-se uma alíquota de 2 ml da Mitotracker / Lyso Tracker, contendo meio e se aquecer a 37 ° C; meio aspirado a partir de células transfectadas e substituir com Mitotracker / Lyso Tracker contendo meio e as células a incubar durante 30 - 60 min. </li></ol> 4. Preparação da câmara de incubação para imagens de células vivas (Figura 1) <ol><li> Limpeza de metal e plástico anéis com etanol a 75% e aplicar massa de silicone sobre o aro do metal o-ring. </li><li> Usando fórceps remover a lamela da placa e secar o excesso de meio a partir do lado inferior da lamela,para evitar a mistura demasiado médio com a massa lubrificante, pois isso irá aumentar a probabilidade de fugas. </li><li> Adicione a lamela para descansar sobre a borda do anel de vedação de plástico e encaixam o anel de vedação de metal no topo do anel de vedação de plástico, com a lamela ensanduichada entre elas, de modo a criar uma câmara fechada. </li><li> Encher com a câmara de suporte da placa, a partir deste ponto em diante, evitar prolongada incubação das células em meio DMEM sem um agente de tamponamento, para evitar alterações de pH para ocorrer, assim como o sistema de tampão de bicarbonato de DMEM exige a concentração de CO 2 artificial de 5-10% e a concentração de CO 2 do ar ambiente é muito menor. </li></ol> 5. Fome de Células <ol><li> Coloque a câmara de incubação na platina do microscópio. </li><li> Aspirar o meio completo e lava-se com 2 ml de meio de inanição três vezes, para assegurar que não há aminoácidos de ter permanecido no meio DMEM, o qual irá eventualmente inibir a resposta autofagia; definir otemporizador ON. </li></ol> 6. Microscopia <ol><li> Será necessário um sistema de imagem apropriado configurado para células vivas de campo amplo epi-fluorescência. Isto irá tipicamente compreender uma armação de microscópio invertido de grau de pesquisa, uma intensa largo espectro fonte de luz, espelhos e filtros específicos para a proteína fluorescente (s) / corante (s) de interesse, uma lente objectiva de alta qualidade, um CCD sensível / scmos câmera e uma câmara de incubação. Todos os principais fabricantes de microscópios oferecer sistemas wide-campo completo apropriado para imagens de células vivas, mas também é possível em casa construir um sistema com componentes de uma variedade de fabricantes e controlá-lo usando o software de código aberto, como Micro-Manager ( <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /</a> ). O aspecto mais importante na nossa opinião é a utilização de um sistema de alta sensibilidade de modo que os níveis de expressão dos repórteres fluorescentes pode ser mantido a um mínimo. </li><li> Selecting as células apropriadas para a imagem. <ol><li> Seleccionar as células grandes e planas que permitam a formação de eventos mais autophagosome a ser capturado. Além disso, optar por células que já começou a produzir um maior número de omegasomes. </li><li> Iniciar a captura vídeo após 30 min ou bem em resposta autofagia, a fim de captar um rácio maior de eventos de formação autophagosome por vídeo. </li></ol></li><li> Imaging. <ol><li> Use uma lente de grande aumento (100x 1.4 NA). </li><li> Ajustar a intensidade da luz de excitação para 10-20% do máximo, para evitar foto-branqueamento. </li><li> Defina a câmara (Hamamatsu ORCA ER, tamanho do pixel 6,45 mm) a exposição 100-500 ms, binning 2x2 e 100 de ganho. </li><li> Definir a taxa de aquisição de imagem para um quadro a cada 10 seg. </li></ol></li></ol> 7. Criando montagens de Eventos Formação autophagosome com ImageJ [Isto pode ser feito de uma forma não sistemática, basta digitalizar o vídeo incorporado pela eaberturas de interesse, mas também pode ser sistematizado, conforme descrito abaixo.] <ol><li> Abertas as pilhas de imagem para a 3 (ou 2) capturou canais em ImageJ / Fiji. </li><li> Aplicar verde, vermelho e azul LUT (tabelas de pesquisa) para o canal correspondente; fundir três cores e salvar. </li><li> Na guia Analisar, selecione Ferramentas&gt; ROI gerente ... &gt; Especifique, em seguida, selecione uma área aleatória de tamanho definido na primeira imagem da pilha. </li><li> A partir da guia Imagem, selecione duplicar, a fim de duplicar a área selecionada da pilha. </li><li> A partir da guia Imagem, selecione Pilhas&gt; Faça montagem ... para criar uma montagem experimental que contém todos os quadros capturado. Verificar todos os quadros na montagem de um evento completo formação autophagosome; manter notas do primeiro e do último quadro do evento. </li><li> Na guia Analisar, selecione Ferramentas&gt; ROI gerente ... seleccionar a mesma área na primeira imagem da pilha para as outras duas cores, bem como para a imagem de cores resultante da fusão e pilhas duplicado. </li><li> De tele guia Arquivo, selecione Novo&gt; Imagem e defina a largura de acordo com o número de pixels inicialmente selecionados usando o gerenciador de ROI, estabelecidos para a altura quatro vezes a altura definida no gerenciador de ROI mais 3 pixels de espaço entre as três cores e as se fundiram, e definir fatias como o número de quadros em cada pilha. </li><li> A partir da guia Imagem, selecione Pilhas&gt; Ferramentas&gt; Inserir ..., em seguida, insira cada um sub-stack em cima da outra, deixando um espaço de 1 pixel no meio. </li><li> A partir da guia Imagem, selecione Pilhas&gt; Faça montagem ... para criar uma montagem e acabamento de partida com o primeiro e o último quadro do evento formação autophagosome capturado. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito neste protocolo permite a visualização da localização de uma proteína durante a formação autophagosome. Temos tentado vários métodos de visualização dos eventos descritos incluindo ponto-de varredura confocal, disco giratório confocal e microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (TIRF). Descobrimos que para fins gerais padrão de campo amplo epi-fluorescência oferece o melhor compromisso entre a sensibilidade ea resolução. Isso garante bom sinal para ruído, photo-bleaching/photo-toxicity mínima e rápida aquisição. A falta de seccionamento óptico não é um problema se regiões apropriadas da célula são escolhidas para a imagem ou seja, a periferia, em que a célula é espalhada e plana. No entanto, é importante que o sistema de imagiologia usado é apropriadamente configurada (tanto em termos de hardware utilizado e as configurações do sistema). Para uma melhor resolução espacial, é recomendado o uso de uma grande ampliação, high numérica abertura da lente de imersão em óleo (lentes de imersão em água vai oferecer nenhuma imagem benefício em estreita proximidade com a lamela). Sugere-se a equilibrar a intensidade de iluminação (por exemplo, com filtros de densidade neutros), as configurações da câmara (tempo de exposição, binning e ganho) para maximizar a relação sinal-ruído e minimizar branqueamento. Isso terá de ser feito de forma empírica, mas como um guia, quando se usa uma lente de 100x 1.4 NA costumamos reduzir o poder da nossa luz de excitação a 10-20% do máximo e definir a câmara (Hamamatsu ORCA ER, tamanho do pixel 6,45 mm) a exposição 100-500 ms, binning 2x2 e 100 de ganho. A taxa de aquisição de imagem deve ser definido na faixa de um quadro a cada 1-10 segundos. Aquisição de imagens em taxas de quadro superiores irá garantir melhor continuidade entre as imagens (melhor resolução temporal), mas vai expor as células de mais luz e, assim, aumentar photo-bleaching/photo-toxicity. Se uma imagem mais fluorescenccanais de mensagens, tem de ser assegurado que o atraso entre a captura do canal é minimizado (reduzir o tempo de exposição, a encaixar trocadores de filtros rápidos). Isso irá reduzir as chances de artefatos de movimento que aparecem na imagem composta. Se artefatos de movimento estão se mostrando difícil de evitar considerar o uso de um divisor de imagem (um dispositivo para facilitar a aquisição simultânea de dois canais de fluorescência usando uma câmera) ou um adaptador de câmera dupla. Imagem do canal de azul requer a seleção de filtros e espelhos adequados para evitar cross-emissão da fluorescência azul para o canal verde. Temos utilizado com sucesso um CellR microscópio Olympus, que usa o Até policromada V iluminador, permitindo seleção específica de comprimento de onda, largura de banda e da intensidade e por isso é muito flexível. No entanto, a fonte de luz é &#39;permeável com uma luz branca que passa para além da wavelengths.For seleccionada esta razão temos montada (multi) filtros de excitação de banda nacubos, para que haja adicional de filtragem da luz de excitação. A seguinte combinação de espelhos / filtros foi utilizada (todos Semrock). Para GFP &amp; mCherry: Exciter FF01-479-585, emissor FF02-525/40 (GFP) e FF01-607/36 (mCherry), Espelho dicróico FF505/606-Di01. Para PCP: Exciter FF01-416/501, Emitter FF01-523/610, dicróica Espelho FF440/520-Di01. Temos também utilizado um microscópio CellR diferente, que tem dado resultados sub-óptimos, com cross-emissão de fluorescência azul para o canal verde. Este microscópio utiliza uma fonte de luz branca e tem uma roda de filtro rápido para seleccionar o wavelengths.This excitação significa que a selecção de comprimento de onda está limitado aos filtros em 8 da roda, mas há uma roda separado para regular a intensidade. Foi utilizada a seguinte combinação de espelhos / filtros. Para GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, Emitter FF02-525/50, dicróica Espelho FF495-DI02. Para PCP e mCherry: Exciter FF01-427/10 (PCP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), emissor FF01-472/30 (PCP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Espelho dicróico 89006bs (Chroma). O significado desta técnica em comparação com outras técnicas de imagiologia é duplo: Em primeiro lugar, ele pode capturar a localização da proteína de interesse em células vivas, e em segundo lugar, pode aumentar a informação extraída adicionando a quarta dimensão do tempo. No entanto, como com as proteínas exógenas, há sempre a possibilidade de mislocalization, quer devido ao aumento dos níveis de expressão ou função de marcação, de imagem de células vivas deve, portanto, ser combinada com imuno-coloração de PI endógenos em células fixas, a fim de confirmar os resultados . Finalmente, vale a pena notar que a imagem de células vivas pode ser combinada com imuno-EM, de modo a aumentar a resolução espacial da análise.

Autophagy é um processo altamente dinâmico, o que requer a coordenação de um grande número de proteínas para o resultado final da formação do autophagosome 1-3. Microscopia é provavelmente o método mais vulgarmente aplicados para estudar autofagia 4. A localização da maioria das proteínas autofagia tem sido extensivamente estudada em células fixadas, quer por imuno-coloração das proteínas endógenas e por expressão de proteína exógena fluorescentemente marcados. Além disso, a microscopia eletrônica (ME), isoladamente e em combinação com marcação imuno-ouro, descreveu os detalhes destas estruturas 5,6. Apesar do facto de que estas técnicas têm estabelecido nossa compreensão da formação autophagosome nas três dimensões do espaço, eles falharam em fornecer uma quantidade suficiente de informação sobre a dimensão de 4 th - tempo. Imagem de células vivas supera esta barreira, uma vez que permite acompanhar a formação de uma autophagosome tão perto quanto possível tempo real 7. Esta técnica foi empregada pela primeira vez para estudar autofagia por Yoshimori e seus colegas 8, e tem sido cada vez mais utilizada daqui em diante. Microscopia de lapso de tempo capta a localização do PI em células vivas e ao longo de um período de tempo. Ao comparar essas informações com a autofagia bem caracterizados e / ou organela marcador, a análise de imagens de células vivas pode colocar o POI no maior contexto espacial e temporal da formação autophagosome. Análise de imagem de células vivas baseia-se na captura repetitiva da localização POI ao longo de todos os passos de formação autophagosome, enquanto que imagens de células fixas baseia-se numa única captura. Portanto, imagens de células vivas pode provar a contribuição do POI em etapas específicas de formação autophagosome, enquanto imagens de células fixas só podem assumir o papel de POI, com base em sua localização média em muitos autophagosomes simultaneamente capturados em diferentes fases do seu lifecycle. Apesar de imagens de células vivas é um método de alto poder analítico, ele tem algumas limitações inerentes, que devem ser levados em consideração. Primeiro de tudo, a imagem de células vivas, requer a expressão de uma ou mais proteínas exógenas marcados com fluorescência. Marcas fluorescentes tendem a ser grande em tamanho, e por vezes, podem alterar o comportamento de uma proteína devido a razões estéricas. Esta situação é acentuado para as proteínas da membrana, uma vez que necessitam para funcionar no espaço limitado das duas dimensões de membranas. De nota, autofagossomas são estruturas membranosas e, consequentemente, a sua formação requer um grande número de proteínas associadas à membrana. Um outro conjunto de problemas é conectado com os níveis de expressão da PI. Em princípio, uma proteína exógena deverá ser expressa em níveis comparáveis ​​aos da proteína endógena. Isto assegura que os reguladores importantes da sua localização sub-celular não vai ser saturado, e thanálise e será biologicamente relevante. Além disso, a sobre-expressão de proteínas autofagia deve ser evitada, tal como quando são expressas acima dos níveis endógenos, que tendem a inibir a resposta autofagia 9. Inversamente, uma vez que os níveis de expressão da PI deve ser suficientemente alta para permitir a sua localização na sequência de um bom período de tempo sem foto-branqueamento, um compromisso deve ser alcançado. Atingir os níveis de expressão de ideais de uma proteína exógena em células de mamíferos requer muita sintonia fina, mas é possível através da criação e seleção linhas de células expressando estavelmente diferentes níveis do POI. A resolução espacial que pode ser obtida com microscopia de fluorescência padrão é outro factor limitante. A resolução pode ser limitada por um número de razões, mas no melhor dos casos, a resolução lateral, será de cerca de 250 nm. Isto significa que quaisquer objectos separados por uma distância menor do que esta aparece ligado (ou como uma únicaobjeto) e objetos menores do que 250 nm será representado na imagem maior do que eles realmente são. Portanto, as imagens devem ser sempre interpretadas com isso em mente e técnicas complementares, tais como EM será necessário para resolver pequenos detalhes ultra-estrutural. Finalmente, a imagem de células vivas requer inerentemente exposição de uma célula à luz, possivelmente durante um período de tempo prolongado. Isto pode alterar as respostas fisiológicas de uma célula, um fenômeno conhecido como foto-toxicidade. Nós utilizamos com sucesso imagens de células vivas da proteína de ligação PI3P DFCP1 descrever, pela primeira vez, que se originam a partir autofagossomas PI3P ricos em anel, como estruturas denominadas omegasomes, que estão em estreita associação com ER fios 10,11. Mostrámos claramente que as estruturas LC3-positivos começam a se formar em estreita associação com omegasomes. Nós, aqui sugerem que emprega uma linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1 para a célula vivaimagiologia da proteína de interesse, estabelece uma estrutura espacial e temporal robusta para a caracterização do seu papel na formação autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy é uma resposta celular desencadeada pela falta de nutrientes, em particular a ausência de aminoácidos. Autophagy é definido pela formação das estruturas de membrana dupla, chamada autofagossomas, que sequestram o citoplasma, proteínas de longa duração e os agregados de proteína, organelas defeituosos, e até mesmo vírus ou bactérias. Autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomas levam a uma degradação do seu conteúdo em massa, produzidos com os nutrientes a ser reciclado de volta para o citoplasma. Portanto, autofagia é crucial para a homeostasia celular, e a desregulação de autofagia pode levar a doença, mais notavelmente a neurodegeneração, envelhecimento e cancro. Formação autophagosome é um processo muito elaborado, pelo qual as células foram definidos para um grupo específico de proteínas, chamado de máquinas autofagia núcleo. A maquinaria autofagia núcleo é funcionalmente complementadas por proteínas adicionais envolvidas em diversos processos celulares, por exemplo, em membrantráfico de e, em biologia mitocondrial e lisossomal. Coordenação destas proteínas para a formação e degradação de autofagossomas constitui a resposta dinâmica e altamente sofisticadas de autofagia. Imagem de células vivas permite seguir a contribuição molecular de cada proteína relacionada autofagia até ao nível de um único evento de formação autophagosome e em tempo real, pelo que esta técnica oferece uma resolução temporal e espacial elevada. Aqui usamos uma linha celular estável expressando GFP-DFCP1, para estabelecer um contexto temporal e espacial para a nossa análise. DFCP1 omegasomes marcas, que são estruturas precursoras que conduzem à formação autofagossomas. Uma proteína de interesse (POI) pode ser marcado com um vermelho ou ciano etiqueta fluorescente. Diferentes organelas, como o ER, mitocôndrias e lisossomos, estão todos envolvidos em diferentes etapas de formação autophagosome, e podem ser marcadas com um corante rastreador específico. Microscopia de lapso de tempo de AUTOPHagy nesta montagem experimental, permite que a informação a ser extraído sobre a quarta dimensão, ou seja, o tempo. Assim podemos seguir a contribuição do POI para autofagia no espaço e no tempo.

No protocolo descrito, utilizou-se microscopia de lapso de tempo a seguir a localização de PCP marcado com LC3 numa linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1, sob condições indutoras autofagia. O resultado desta experiência é a captura de duas séries ou pilhas de imagens, uma do verde e uma do canal azul, correspondentes a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Analisamos ainda mais esses vídeos usando ImageJ, a fim de criar montagens correspondentes a eventos únicos formação autophagosome, conforme descrito na seção de protocolo. Esta análise nos permitiu provar que um autophagosome LC3-positivo origina de uma omegasome DFCP1 positivo. Na montagem mostrada na Figura 2, a formação de um omegasome torna-se aparente a partir do segundo quadro, sob a forma de um pequeno ponto. O omegasome começa a se expandir de modo a formar a característica estrutura em forma de anel, e atinge o seu diâmetro máximo após 6 min. Em seguida, começa a omegasome collapsing e eventualmente desaparece, depois de cerca de 10 min. Colocando-se agora a formação da estrutura LC3-positivo ou autophagosome no contexto da formação omegasome, observamos que o autophagosome aparece após o omegasome, e torna-se claramente visível após aproximadamente 1,5 min. O autophagosome começa a se expandir em estreita associação com o omegasome, primeiro lugar e, em seguida, toque, e quando o omegasome começa desmoronar as papilas autophagosome off. Eventualmente, o autophagosome fica para trás, aparentemente para fundir-se com os lisossomos, após a omegasome desaparece. Esta análise proporciona uma indicação clara acerca da relação funcional entre as duas estruturas, de acordo com o qual LC3 autofagossomas positivos originam omegasomes correspondentes. Em outro exemplo, nós adicionamos um tracker lisossomo, a fim de captar a associação temporal e espacial do autophagosome formação com os lisossomos (Figura 3 </strong&gt;). De fato, poucos minutos após o colapso da omegasome, o autophagosome nascente começa a associar-se com os lisossomos e, eventualmente, ele se funde com um lisossomo. Fusão do autophagosome com o lisossoma largamente sacia PCP-LC3 fluorescência, presumivelmente devido à exposição da marcação PCP no ambiente ácido do lisossoma. No entanto, o mesmo tipo de análise pode produzir resultados não interpretáveis, devido a uma variedade de razões. No exemplo apresentado na Figura 4, os resultados tornam-se não interpretável devido a um desvio no foco. Vídeo inicia a captura com sucesso a formação de uma autophagosome, no entanto um desvio no foco ocorre após a marca de 3 min. A captura de vídeo continua fora de foco para a próxima 6 min, mas, eventualmente, o foco é corrigido manualmente após a min marca de 9 a 10. Esta análise, porém, torna impossível distinguir se o evento de formação autophagosome capturado quando o foco é corrigido é oevento inicial, que está quase concluído, ou uma nova, que começou após a deriva em foco. Problemas adicionais podem ser atribuídos para a confluência das células cultivadas. Por exemplo, quando as células são cultivadas a uma confluência superior óptimo, eles são obrigados a expandir-se no topo de uma célula adjacente, o que torna a focalização bastante desafiador. Além disso, as células que são cultivadas em alta confluência tendem a ser salientado, aumentando os níveis de atividade autofagia fundo antes do início da inanição. Finalmente, os problemas relacionados com a fluorescência são bastante comuns. PCP tem mais fraca atividade de fluorescência em relação ao GFP, e muitas vezes fica foto-branqueada em fases posteriores da captura de vídeo. Análise de tais vídeos podem levar a conclusões negativas falsas sobre a associação espacial do POI com autophagosomes formadoras. Contudo, estes problemas podem ser ultrapassados ​​usando uma das variantes, tais como mTurquise2. Outro phenomeno comumn deriva do facto que a fluorescência das marcas vermelhas não é temperada, ao pH mais baixo dos lisossomos. Muitas proteínas autofagia fisiologicamente terminar seu ciclo de vida em lisossomos, enquanto autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomos. Além disso, as proteínas não-funcionais são frequentemente alvo para degradação nos lisossomos. Portanto, pode-se acabar seguindo a associação não-relacionado de autophagosomes com lisossomos, em vez de uma associação física real entre um POI vermelho-marcados e omegasomes. <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Câmara de incubação. O O-ring de plástico se encaixa em torno da borda do anel de vedação de metal e tem na parte inferior um ressalto fino que se estende para dentro. A lamela é colocada sobre a borda do anel de vedação de plástico, e, em seguida, o anel de plástico é montado na parte inferior do anel de vedação de metal. Dessa forma, a lamela é de areiainíquas entre os dois anéis de vedação, criando uma câmara fechada. <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig2highres.jpg" /> Figura 2. Células que expressam GFP-DFCP1 e CFP-LC3 estavam sedentos de 30 min e fotografada a uma taxa de 1 quadro a cada 10 segundos. Uma montagem de um evento representativo formação autophagosome é apresentado. Os sinais dos canais verde e azul são pseudo-colorido em verde e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig3highres.jpg"/> Figura 3. As células que expressam a GFP-DFCP1 e CFP-LC3, foram incubadas com vermelho Lyso Tracker, fome durante 30 minutos e trabalhada, a uma taxa de um quadro a cada 15 seg. Uma montagem de um evento de formação autophagosome representativo é apresentado. Os sinais dos canais verde, vermelho e azul são pseudo-cor verde, azul e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. Arrowhead indica a primeira captura de fusão autophagosome com o lisossomo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig4highres.jpg"/> Figura 4. Células que expressam GFP-DFCP1 e CFP-LC3 estavam sedentos de 30 min e fotografada a uma taxa de 1 quadro a cada 10 segundos. Uma montagem de um exemplo de sub-o<html> ptimal captura é apresentado. Os sinais dos canais verde e azul são pseudo-colorido em verde e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . Video 1. Vídeo do evento de formação autophagosome apresentado na Figura 2. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . Video 2. O vídeo do evento autophagosome formação apresentada na Figura 3. A seta indica em primeiro lugar, a formação do omegasome, e em segundo lugar, a fusão do autophagosome com o lisossoma. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo.&quot;&gt; Clique aqui para ver filme. Vídeo 3. Vídeo do evento de formação autophagosome apresentado na Figura 4. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484movie3.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . Tabela 1. Lista de reagentes e equipamentos específicos necessários para o protocolo, juntamente com o correspondente fornecedor e número de catálogo. BUFFERS <table border="1"><tbody><tr><td fo:width=".5in"> Tampão </td><td fo:width="1.5in"> Composição </td><td fo:width=".5in"> Passo Usado </td></tr><tr><td> Médio fome </td><td> 20 mM de HEPES pH 7,4 </td><td> 5.2 </td></tr><tr><td></td><td> 140 mM de NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 1 mM </td><td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> MgCl2 1 mM </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 mM de glucose </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1% de BSA </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista dos tampões utilizados neste protocolo. Os tampões utilizados, da sua composição e da primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K visualizações.  The Babraham Institute. Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Vídeo: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biologia

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...